Summary
Detta protokoll presenterar differentieringen av humana osteoklaster från inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) och beskriver metoder för karakterisering av osteoklaster och osteoklastprekursorer.
Abstract
Detta protokoll beskriver förökning och passage av humana iPSC:er och deras differentiering till osteoklaster. Först dissocieras iPSCs till en encellssuspension för vidare användning vid induktion av embryoidkroppar. Efter mesodermal induktion genomgår embryoidkropparna hematopoetisk differentiering, vilket ger en flytande hematopoetisk cellpopulation. Därefter genomgår de skördade hematopoetiska cellerna ett mognadssteg med makrofagkolonistimulerande faktor och slutligen osteoklastdifferentiering. Efter osteoklastdifferentiering karakteriseras osteoklaster genom färgning för TRAP i kombination med en metylgrön kärnfärgning. Osteoklaster observeras som multinukleära, TRAP+ polykaryoner. Deras identifiering kan stödjas ytterligare av Cathepsin K-färgning. Ben- och mineralresorptionsanalyser möjliggör funktionell karakterisering, vilket bekräftar identiteten hos äkta osteoklaster. Detta protokoll demonstrerar en robust och mångsidig metod för att skilja mänskliga osteoklaster från iPSCs och möjliggör enkel användning i applikationer som kräver stora mängder funktionella mänskliga osteoklaster. Tillämpningar inom områdena benforskning, cancerforskning, vävnadsteknik och endoprotesforskning kan tänkas.
Introduction
Osteoklaster (OC) är hematopoetiskt härledda 1,2, mångsidiga celltyper som ofta används av forskare inom områden som bensjukdomsforskning 3,4, cancerforskning 5,6, vävnadsteknik 7,8 och endoprotesforskning 9,10. Differentiering av kolfiber kan dock vara en utmaning eftersom sammansmältning av mononukleära prekursorer till flerkärniga kolväten är nödvändig för att skapa funktionella kolväten11. Flera biologiska faktorer, såsom receptoraktivator av NF-κB-ligand (RANKL) och makrofagkolonistimulerande faktor (M-CSF), är nödvändiga för OC-differentiering. M-CSF har rapporterats ha en positiv effekt på cellproliferation, cellöverlevnad och RANK-uttryck 12,13,14. Å andra sidan binder RANKL till RANK, vilket aktiverar nedströms signalkaskader som inducerar osteoklastogenes. Aktiveringen medieras via TNF-receptorassocierad faktor 6 (TRAF6), vilket leder till nedbrytning av kärnfaktorn hos kappa-ljuspolypeptidgenförstärkaren i B-cellshämmare, alfa (IκB-α), ett bindande protein som binder NF-kB-dimerer16,17. Därför frigör nedbrytning av IκB-α NF-kB-dimerer, som sedan translokerar in i kärnan och inducerar uttrycket av transkriptionsfaktorerna c-Fos och kärnfaktorn för aktiverade T-celler 1 (NFATc1). Detta utlöser i sin tur transkriptionen av en mängd OC-differentieringsrelaterade proteiner15,18. Uppreglerade proteiner som DC-Stamp och Atp6v0d2 medierar cell-cell-fusion av OC-prekursorer, vilket leder till syncytiumbildning 19,20,21.
När det gäller humana primära celler är CD34+ och CD14+ PBMC för närvarande de mest använda celltyperna för differentiering till OC22. Detta tillvägagångssätt begränsas dock av heterogeniteten inom CD34+ -populationen av skördade celler från donatorer23 och deras begränsade utbyggbarhet. Humana iPSC:er utgör en alternativ källa för OC. Eftersom de kan förökas på obestämd tid24 möjliggör de utbyggbarhet och uppskalning av OC-produktionen. Detta gör det möjligt att differentiera ett stort antal forskningsanläggningar, vilket underlättar forskningen om organiserad forskning.
Flera protokoll för differentiering av iPSC:er till OC:er har publicerats 25,26,27. Hela differentieringsprocessen kan delas in i en iPSC-förökningsdel, en mesodermal och hematopoetisk differentieringsdel och OC-differentiering. Spridning av iPSCs före differentieringsprocessen möjliggör uppskalning av OC-produktion före differentiering. Det finns flera tillvägagångssätt när det gäller mesodermal och hematopoetisk differentiering. Traditionellt har embryoidkroppsbildning (EB) använts för att differentiera hematopoetiska celler, men monolagerbaserade metoder representerar en annan hematopoetisk differentieringsstrategi som inte kräver EB-induktion. Icke desto mindre verkar monolagerbaserade system kräva ytterligare optimering, eftersom vi och andra har funnit att EB-baserade metoder är mer robusta för differentiering av OC.
Här beskriver vi differentieringen av OC från mänskliga iPSCs med hjälp av ett EB-baserat protokoll. Detta protokoll anpassades från Rössler et al.26 och modifierades för att öka robustheten och möjliggöra kryokonservering under differentieringsprocessen. Först skördade vi hematopoetiska celler endast en gång efter 10 dagars differentiering. Hematopoetiska celler kryokonserverades sedan för att möjliggöra mer flexibilitet under differentieringsprocessen. Dessutom ökade vi den hematopoetiska cellsåddstätheten från 1 x 105 till 2 x 105 celler/cm2 för OC-differentiering. Ett nyare humant iPSC-serumfritt medium (hiPSC-SFM, se Materialförteckning) användes, och beläggning av brunnar utfördes med 200-300 μg/ml av ett basalmembranextrakt (se Materialförteckning) istället för 0,1 % gelatin. Penicillin/streptomycin tillsattes inte i media.
Protokollet av Rössler et al.26 anpassades ursprungligen från ett iPSC till ett makrofagdifferentieringsprotokoll28 som använder EB-bildning för hematopoetisk differentiering. Medan EB-bildning har använts under en längre tid av forskare för hematopoetisk differentiering29,30, har flera metoder för EB-induktion beskrivits i litteraturen, såsom spontan aggregering, centrifugering i en rundbottnad brunnsplatta, hängande droppkultur, bioreaktorkultur, konisk rörkultur, långsamt roterande sidokärl och mikromögelgelkultur31. Detta protokoll använder centrifugering av dissocierade iPSCs i en brunnsplatta med rund botten för att föra enskilda iPSC-celler i närheten av varandra och för att möjliggöra bildning av sfär (EB), som beskrivs nedan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla reagenser som används i detta protokoll finns i materialtabellen. Om inget annat anges har alla medier före användning utjämnats till 37 °C. Alla centrifugeringssteg utförs vid 37 °C och med det långsammaste accelerations-/retardationsläget. Om inget annat anges avlägsnas supernatanten alltid med hjälp av engångspipetter av Pasteurglas.
1. Upptining och förökning av humana iPSC:er
- En dag före upptining av iPSCs, bestryk en brunn på en 6-hålsplatta med 1 ml av ett basalmembranextrakt i en koncentration av 200-300 μg/ml. Placera brunnsplattan vid 4 °C över natten.
- Nästa dag, tina och överför cellerna till ett 15 ml rör med hjälp av en P1000-pipett. Droppvis, tillsätt 5-7 ml DMEM/F-12 med 15 mM HEPES.
- Centrifugera cellerna vid 300 x g i 5 minuter. Ta försiktigt bort cellerna från centrifugen och se till att inte störa cellpelleten.
- Ta försiktigt bort supernatanten med en Pasteur-glaspipett och återsuspendera cellerna i 1 ml hiPSC-serumfritt medium (hiPSC-SFM innehållande 10 μM Rho-kinashämmare Y-27632) med P1000 med breda spetsar.
- Aspirera basalmembranextraktet från brunnen belagd föregående dag (steg 1.1) och överför 1 ml hiPSC-SFM med 10 μM Y-27632 till brunnen. Tillsätt omsuspenderade iPSC:er till brunnen för att nå en slutlig volym på 2 ml per brunn.
- Snurra plattan för att jämnt fördela iPSC-aggregat innan du placerar den i en inkubator vid 37 °C och 5 % CO2 .
- Utför hela mediumbyten varannan dag med hiPSC-SFM (utan tillsats av ROCK-hämmare Y-27632). iPSCs når vanligtvis 70-80% sammanflöde efter 3-4 dagars förökning.
2. Passaging iPSCs
- En dag före passering av iPSC, bestryk brunnar på en 6-hålsplatta med ett basalmembranextrakt vid en koncentration av 200-300 μg/ml. Placera brunnsplattan vid 4 °C över natten.
OBS: Bekräfta att cellerna har nått cirka 70-80 % sammanflöde. Se till att iPSC:er inte blir överkonfluenta (mer än 80 % sammanflöde), eftersom detta kommer att främja spontan differentiering. - Börja passera iPSCs genom att ta bort differentierade regioner eller regioner med många döda iPSC-aggregat under stereomikroskopet genom att använda 10 μL eller 20 μL pipettspetsar eller en cellskrapa. Differentierade områden kommer att se tätare eller vitare ut i färgen.
OBS: Avskrapade cellaggregat kan fortfarande delvis fästa på brunnsbotten. - Tvätta brunnsbotten flera gånger med en P1000-pipett med bred borrning för att ta bort eventuella aggregat som fortfarande kan vara delvis fästa vid brunnens botten.
- Kassera det förbrukade mediet i vilket iPSC:erna har odlats och som innehåller de lossnade iPSC-aggregaten. Upprepa tvättsteget ytterligare två gånger med fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).
- Tillsätt sedan 1 ml 5 U/ml Dispase per brunn. Kanterna på iPSC-kolonierna kommer att lyftas av från brunnsplattan, vilket kan observeras under stereomikroskopet efter 3-5 minuters inkubation vid rumstemperatur.
- Ta försiktigt bort Dispase för att undvika att lossna lätt lossnade aggregat och tillsätt 1 ml DMEM/F-12 med 15 mM HEPES. Använd en celllyftare för engångsbruk för att skära aggregaten i små storlekar. Konsistensen av iPSC-aggregatstorlekar kan förbättras med ett stamcellspassageverktyg.
- Tvätta av de skivade iPSC-aggregaten med mediet i brunnen och överför mediet med aggregat till ett 15 ml koniskt rör med en 5 ml serologisk pipett eller P1000 med en bred borrspets.
- Skölj brunnen med DMEM/F-12 och överför mediet till 15 ml-röret med iPSC-aggregaten.
- Centrifugera de skivade iPSC-aggregaten vid 200 x g i 3 minuter. Ta bort supernatanten med en Pasteur-glaspipett och tillsätt 2 ml hiPSC-SFM för att lossa och återsuspendera iPSC:erna med en 5 ml serologisk pipett eller P1000 med breda borrspetsar.
- Aspirera det överblivna basalmembranextraktet från den eller de förbelagda brunnsplattorna och tillsätt 1 ml hiPSC-SFM till varje brunn på 6-hålsplattan.
- Överför iPSCs till nya brunnar på en 6-hålsplatta så att den slutliga volymen är 2 ml hiPSC-SFM per brunn med hjälp av en P1000 med breda borrspetsar. Beroende på iPSC-linjen måste delningsförhållandena optimeras. Här användes ett delningsförhållande på 1:6.
- Kontrollera brunnen för flytande aggregat och aggregatstorlek under stereomikroskopet. Helst bör den sammanlagda storleken vara mellan 50-200 μm.
- Snurra brunnsplattan för att fördela cellerna jämnt över plattan efter att aggregaten har överförts och inkubera vid 37 °C vid 5 % CO2 tills 70-80 % sammanflöde.
3. Frysa tillbaka iPSC:er
- För att frysa tillbaka iPSC-celler, passera celler enligt beskrivningen ovan (se protokollsteg "2. Passage av iPSC"). Efter att cellerna har skurits i kolonier och tvättats av brunnsbotten (steg 2.10), snurra ner de skivade aggregaten med 200 x g i 3 minuter. Aspirera supernatanten.
- Tillsätt 1 ml serumfritt kryokonserveringsmedium per brunn på en 6-hålsplatta till 15 ml-röret och återsuspendera de skivade aggregaten med en P1000 med bred borrspets.
- Överför celler till förmärkta kryorör. Stäng rören och överför rören till en förkyld kryokonserveringsbehållare vid 4 °C. Förvara cellerna vid -80 °C i 24-48 timmar.
- Överför kryovialer till flytande kväve för långtidsförvaring.
OBS: En schematisk sammanfattning av OC-differentieringsprocessen illustreras i figur 1.
4. Induktion av embryoidkroppen
- Odla och utöka tillräckligt med iPSC:er enligt beskrivningen ovan för EB-induktion.
OBS: OC-produktionen kan skalas upp genom att öka antalet embryoidkroppar, vilket i sin tur ger ett totalt högre utbyte av hematopoetiska celler. En brunn med 70-80 % konfluenta iPSCs ger cirka 8,4 x 105 celler per brunn i en 6-brunns plattbrunn. 12 500 encelliga iPSCs behövs för att bilda en embryoidkropp. - Aspirera det förbrukade mediet från iPSC-kulturerna och skölj iPSC-kolonierna med D-PBS.
- Tillsätt 0,5 ml förvärmt till rumstemperatur encelligt dissociationsreagens till varje brunn på en 6-hålsplatta och snurra odlingskärlet för att täcka hela brunnens yta. Inkubera odlingskärlet vid 37 °C i 5-8 min.
- Ta bort kärlet från inkubatorn, aspirera encellsdissociationsreagenset och tillsätt 1 ml av steg 1-differentieringsmediet till brunnarna, bestående av hiPSC-serumfritt medium med 50 ng/ml humant benmorfogenetiskt protein 4 (hBMP4), 50 ng/ml human vaskulär endotelial tillväxtfaktor-165 (hVEGF), 20 ng/ml human stamcellsfaktor (hSCF), och 10 μM Y-27632.
- Lossa försiktigt cellerna genom att skölja brunnen med steg 1-mediet. Slå samman dissocierade iPSCs i ett 15 ml koniskt rör.
- Tillsätt 1 ml steg 1 differentieringsmedium till brunnarna och tvätta bort eventuella kvarvarande celler eller använd en cellskrapa för kolonier som inte tvättas bort lätt.
- Efter att ha överfört alla celler till röret, centrifugera vid 200 × g i 5 minuter vid rumstemperatur för att bilda en cellpellet. Aspirera och återsuspendera cellerna i totalt 2 ml föreklibrerat steg 1-differentieringsmedium med hjälp av en 5 ml serologisk pipett eller en P1000 med bred spets.
- Räkna celler med hjälp av en hemocytometer eller automatiserad cellräkningsanordning. Tillsätt mediet till 15 ml-röret som innehåller encellssuspensionen till plattan 12 500 celler per brunn i en 96-hålsplatta med ultralåg tillsats med rund botten i 100 μL av steg 1-differentieringsmediet.
OBS: Under mikroskopet kommer cellerna att visas som en encellssuspension med celler spridda över hela brunnen. - Centrifugera plattorna med 96 brunnar i 3 minuter vid 100 x g. Efter centrifugering bör cellerna börja likna sfäroider när de ses under mikroskopet. Placera plattan i en 37 °C inkubator i 24 timmar.
- Byt hälften av mediet på dag 1 och dag 2 med differentieringsmediet för steg 1. För att förbättra effektiviteten, använd en flerkanalspipett för att kassera 50 μL av det förbrukade steg 1-differentieringsmediet i en petriskål.
- Efter att ha kasserat mediet från 96-brunnsplattan, kontrollera om det finns EB under stereomikroskopet som kan ha tagits bort av misstag. Överför oavsiktligt borttagna EB:er till 96-hålsplattan med hjälp av en P1000-pipett med breda borrspetsar.
- Tillsätt 50 μl färskt steg 1-differentieringsmedium till varje brunn på en 96-hålsplatta med rund botten och 96 brunnar med hjälp av en flerkanalspipett.
5. Hematopoetisk differentiering
- En dag innan hematopoetisk differentiering påbörjas, belägg en brunn med en 6-hålsplatta med 1 ml av ett basalmembranextrakt med en koncentration av 200-300 μg/ml. Placera brunnsplattan vid 4 °C över natten.
OBS: Varje brunn kommer att få 8 EB vid ett senare tillfälle i detta protokoll. Beroende på antalet EB som förbereds, belägg brunnarna på motsvarande sätt. - Aspirera överskottet av basalmembranextrakt och fyll brunnarna i 6-hålsplattan med 3 ml av steg 2-differentieringsmediet, bestående av ett hematopoetiskt basalmedium till vilket 2 mM ultraglutamin, 55 μM 2-merkaptoetanol, 25 ng/ml humant interleukin 3 (hIL-3) och 100 ng/ml human makrofagkolonistimulerande faktor (hM-CSF) tillsätts.
- Använd en P1000 med breda borrspetsar och överför 8 EB till varje brunn på 6-hålsplattan. Efter överföringen, bekräfta med ögat eller under stereomikroskopet att 8 EB finns i varje brunn.
OBS: Efter 1 dag kommer de flytande EB:erna att fästa vid brunnsbotten. Under de följande 5-7 dagarna bör en flytande cellpopulation bestående av hematopoetiska celler bli synlig. Den hematopoetiska differentieringsperioden kan varieras, från 7 dagar. Differentiering under 10 dagar visade en hematopoetisk population bestående av stora CD45+, CD14+ och CD11b+ subpopulationer. - Efter 5 dagars behandling med steg 2 differentieringsmedium, utför ett mediebyte genom att ta bort det förbrukade mediet och fördela det i ett 50 ml koniskt rör. Pipettera långsamt för att försöka ta bort så lite flytande celler som möjligt och hålla skjuvspänningen så låg som möjligt. Pipettering under ett stereomikroskop kan hjälpa till att undvika oavsiktlig borttagning av celler.
- Tillsätt omedelbart 1 ml färskt steg 2-differentieringsmedium till brunnarna. För att återvinna eventuella flytande hematopoetiska celler som redan kan finnas vid denna tidpunkt i differentieringsprocessen, kassera inte det dispenserade mediet. Snurra hellre ner röret med det förbrukade mediet på 300 x g i 5 minuter och aspirera supernatanten.
- Tillsätt ett nytt steg 2-differentieringsmedium till röret och återsuspendera för att lossa celler som kan ha överförts med det förbrukade mediet.
- Tillsätt 2 ml av det färska steg 2-differentieringsmediet med de återvunna cellerna i varje brunn, som tidigare fylldes med 1 ml av steg 2-differentieringsmediet.
- På dag 10 av hematopoetisk differentiering, kontrollera om det finns ett stort antal flytande hematopoetiska celler. Skörda genom att samla dem i ett 50 ml rör. De kan antingen frysas tillbaka i 10 % DMSO, 50 % FBS och 40 % medium eller användas omedelbart för att differentiera cellerna till OC.
6. M-CSF-mognad och OC-differentiering
- Fröceller med en koncentration av 200 000 celler/cm2 på vävnadskultur behandlade brunnsplattor och behandlade med alfa-MEM, kompletterat med 10 % FBS och 50 ng/ml hM-CSF.
- För att utföra funktionella analyser eller avbildning, lossa de M-CSF-mogna cellerna 3 dagar efter sådd genom att tvätta med förvärmd PBS till 37 °C med en P1000 med bred borrspets. Upprepade tvättsteg kan behövas för att helt lossa celler.
- Överför de lossnade cellerna till ett 15 ml rör med en P1000 med bred spets och centrifugera vid 300 x g i 5 minuter. Kassera supernatanten.
- Återsuspendera och lös upp cellpelleten med OC-differentieringsmediet, bestående av alfa-MEM kompletterat med 10 % FBS, 50 ng/ml hM-CSF och 80 ng/ml hRANKL. Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer eller automatiserad cellräkningsanordning och återplantera M-CSF-mogna celler med en densitet av 200,00–250 000 celler/cm2 i ett lämpligt odlingskärl för funktionella analyser eller avbildning (dvs. benresorptionsanalyser, täckglas för avbildning osv.).
- Differentiera med OC-differentieringsmediet i 7-9 dagar. Utför ett fullständigt välmediumbyte med det färska OC-differentieringsmediet var 2-3:e dag.
OBS: Multinukleära OC uppträder vanligtvis efter 5-7 dagar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Övervakning av cellmorfologi under hela differentieringsprocessen
Alla resultat som beskrivs nedan genererades med hjälp av MCND-TENS2 iPSC-linjen för OC-differentiering. Denna iPSC-linje har tidigare använts i flera studier 32,33. Icke desto mindre har andra iPSC-linjer också använts framgångsrikt med detta differentieringsprotokoll.
Regelbunden visuell bedömning avslöjar olika och distinkta morfologiska egenskaper hos iPSCs under hela differentieringsprocessen till OC (figur 2). iPSC-kolonier (Figur 2A) dissocierades till en encellssuspension, som uppträder som enskilda celler i hela den runda bottenplattan före centrifugering (Figur 2B). Efter centrifugering (steg 4.9 i protokollet) kommer cellerna att samlas i mitten av den runda botten av den ultralåga fästbrunnsplattan med rund botten och därefter bilda sfärer (embryoidkroppar, EB, figur 2C). EB kommer att öka två till tre gånger i storlek under den mesodermala differentieringsprocessen (Figur 2D) och bli lätt synlig för ögat i slutet av den 4-dagars differentieringsperioden (Figur 2E). EB kan ses vidhäfta och smälta samman med brunnsplattans botten efter överföringen till brunnar av en 6-hålsplatta för hematopoetisk differentiering (steg 5.3 i protokollet, figur 2F). Efter 7-8 dagar blir stora mängder flytande hematopoetiska celler synliga i odlingsmediet (Figur 2G). Efter skörd och omplätering av hematopoetiska celler följer en mognadsfas för M-CSF och OC-differentiering initieras (steg 6.4 i protokollet). Inom 5-6 dagar blir multinukleära celler med en stor genomskinlig cellkropp först synliga (Figur 2H). Ett stort antal mononukleära celler är fortfarande synliga i detta skede. Efter ytterligare 2-3 dagar av OC-differentiering kommer OC att smälta samman ytterligare med intilliggande celler för att bilda stora polykarioner med ännu fler kärnor (Figur 2I).
Bedömning av den EB-härledda hematopoetiska populationen
Hematopoetisk differentiering kan utföras under en varierande tidsperiod. Tidsperioder som börjar med 7 dagar upp till 9 veckor har beskrivits i litteraturen. I detta protokoll utförs hematopoetisk differentiering under en period av 10 dagar. Vi fann att 10 dagars hematopoetisk differentiering gav ett lågt antal tidiga CD34+ (0,53 %, Figur 3A) och ett större antal CD43+ (48,5 %, Figur 3B) hematopoetiska stamceller i mellanstadiet. Mer kritiskt var att tillräckliga mängder av CD45+ (96,2 %, figur 3C), CD14+ (33 %, figur 3D) och CD11b+ (35,9 %, figur 3E) HPC genererades efter en behandlingsperiod på 10 dagar för att framgångsrikt differentiera dem ytterligare till OC. Cytokinbehandlingsperioden för hematopoetisk differentiering (steg 5.4 i protokollet) kan dock behöva justeras och optimeras baserat på iPSC-linjen för att generera tillräckliga mängder CD45+, CD14+ och CD11b+ -celler.
I genomsnitt skördades 6 miljoner hematopoetiska celler efter 10 dagars differentiering från varje brunn med 8 EB.
Bedömning av OC-morfologi och aktivitet
Efter differentiering av OC kan OC bedömas morfologiskt och funktionellt. OC-prekursorer återplanteras på kammarglas eller täckglasglas efter M-CSF-mognadssteget för att förbättra bildkvaliteten vid färgning för TRAP eller Cathepsin K. Enzymatisk TRAP-färgning efter OC-differentiering visar stora, multinukleära, TRAP-positiva OC (figur 4A). Dessutom kan lätt TRAP-positiva mononukleära celler ses insprängda mellan multinukleära OCs. Negativa kontroller utan tillägg av RANKL visar inte smält multinukleär OC. Icke desto mindre kan ett litet antal lätt TRAP-positiva mononukleära celler avbildas (figur 4B).
Bilder från konfokal laserskanningsmikroskopi (CLSM) visar OC färgade för Cathepsin K (turkos) och F-aktin (röd) i kombination med DAPI-kärnfärgning (blå) (Figur 4C, 4D). Stora multinukleära OC är synliga när de behandlas med RANKL enligt protokollet, som visar en omfattande F-aktincytoskelettstruktur och färgning positiv för Cathepsin K (Figur 4C). Negativa kontroller utan tillsats av RANKL visar å andra sidan inte smälta multinukleära celler.
Polarisationshärdar kan bedömas ytterligare funktionellt genom att mäta den resorptiva aktiviteten. Ben- eller mineralresorptionsanalyser kan användas för att bestämma den resorptiva aktiviteten. Här såddes OC-prekursorer på kalciumfosfatbelagda brunnar och differentierades terminalt. Stora områden där mineralbeläggningen resorberades är synliga i en blågrå färg (Figur 4E). Resorptionsgropar av olika storlek kan identifieras. Resterande kalciumfosfatbeläggning är inte resorberad, utan synlig i brunt. Närvaron av resorptionsgropar bekräftar identiteten hos de differentierade multinukleära cellerna som OC. Dessutom kan resorptionsgropar kvantifieras ytterligare för att bedöma och jämföra den resorptiva aktiviteten. Den totala arean av resorberat mineral över den totala brunnsytan kan kvantifieras som ett procentuellt mått. Dessutom kan resorptionsgroparnas storlek och antal kvantifieras ytterligare. Obehandlade negativa kontroller uppvisade inga resorptionsgropar (figur 4F).
Figur 1: Schematisk illustration av osteoklasternas differentieringsprocess från humana iPSC. Illustration ritad av Hannah Blümke med hjälp av Affinity Designer 2.1.1. Illustrationen använder tidigare använda ritningar33. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Mikroskopibilder under hela differentieringsprocessen av humana iPSCs mot osteoklaster. (A) Odifferentierade iPSC-kolonier under hela förökningen. B) iPSC i rundbottnade brunnar efter dissociation till en encellssuspension före centrifugering. C) Centralt insamlade encells-iPSC efter centrifugering. (D) EB växer i storlek under hela den 4-dagars mesodermala differentieringsperioden. E) Synliga embryoidkroppar efter mesodermal differentiering. (F) Efter överföring av embryoidkroppar till basalmembranextraktbelagda 6-hålsplattor kan embryoidkroppar ses vidhäfta och smälta samman med brunnens botten. (G) Efter 5-7 dagars hematopoetisk differentiering kan ett stort antal flytande hematopoetiska celler observeras i mediet. (H) Efter M-CSF-mognad uppträder de första osteoklasterna med 3-4 kärnor efter 5-7 dagars differentiering med RANKL. (I) I slutet av osteoklastdifferentieringen kan stora multinukleära celler observeras. Skalstreck: A, D, F, G = 200 μm, B, C, H, I = 50 μm, E = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Ytmarköranalys av embryoida kroppshärledda hematopoetiska celler med hjälp av flödescytometri. Marköruttryck möjliggör analys av hematopoetiska celler och identifiering av subpopulationer efter gating för singlets och levande celler. (A) Ontogenetiskt tidig CD34+ hematopoetisk stamcellspopulation är mycket liten till frånvarande i samband med detta protokoll. (B) CD43+ -celler utgör cirka 50 % av hela populationen. (C) Senare stadium CD45+ hematopoetiska stamceller utgör den största delen av den hematopoetiska populationen med 96,2 %. (D, E) Mer direkta CD14+ och CD11b+ OC-prekursorer utgör 33 % respektive 36 %. I rött: ofärgad negativ kontroll, i blått: isotypkontroller, i gult: celler färgade med respektive markörantikropp. Diagrammen använder tidigare publicerade data33. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Morfologisk och funktionell bedömning av iPSC-differentierade humana osteoklaster. (A) TRAP-färgning efter osteoklastdifferentiering visar stora, multinukleära, TRAP-positiva osteoklaster. Något TRAP-positiva mononukleära celler kan ses insprängda mellan multinukleära osteoklaster. (B) Negativa kontroller utan tillsats av RANKL färgade för TRAP visar inte smälta multinukleära osteoklaster. Ändå kan ett litet antal lätt TRAP-positiva, mononukleära celler avbildas. (C) Konfokala laserskanningsmikroskopibilder av osteoklastdifferentierade hematopoetiska celler på ett objektglas färgat för F-aktin (rött) och Cathepsin K (turkos) i samband med DAPI-kärnfärgning (blått) visar stora multinukleära Cathepsin K-positiva osteoklaster. (D) Negativa kontroller utan tillsats av RANKL visar liknande (B) mononukleära celler vid en lägre celltäthet. E) Funktionsbedömning kan utföras genom bedömning av osteoklasternas resorptionsaktivitet. För detta utförs osteoklastdifferentiering på en ben- eller mineralresorptionsanalys. Kortfattade brunnsbilder tagna med ett inverterat vidvinkelmikroskop i faskontrastläge visar stora resorptionsområden i kalciumfosfatmineralskiktet. Resorptiv aktivitet kan kvantifieras ytterligare genom att mäta resorptionsarean över den totala arean. F) Negativa kontroller utan tillsats av RANKL visar inte resorptionsområden. Skalstreck: A, B = 100 μm, C, D = 50 μm, E, F = 1 mm. Bilderna har redigerats från tidigare publicerade data33. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll erbjuder en pålitlig och robust metod för att differentiera iPSC:er till OC:er. Det finns dock flera fallgropar som kan uppstå under hela differentieringsprocessen. Humana iPSC-linjer som genererats från celler med olika vävnadsursprung har framgångsrikt differentierats med hjälp av detta protokoll33. Vid frysning av iPSC:er (se protokollsteg "3. Frysa tillbaka iPSCs"), en brunn vid passeringspunkten frystes tillbaka till en kryovial. Vid upptining (se protokollsteg "1. Upptining och förökning av humana iPSC"), tinades en kryovial upp i en enda brunn på en 6-hålsplatta. Olika iPSC-linjer kommer att bete sig något annorlunda och spridningshastigheterna kommer att variera. Delningshastigheten måste justeras i enlighet med detta.
Vid passage av iPSCs eller dissocierande iPSCs till en encellssuspension för EB-induktion är det viktigt att avlägsna alla spontant differentierade kolonier eller aggregat av döda celler för att förbättra effektiviteten och effektiviteten av mesodermal och hematopoetisk differentiering. Detta kan göras under ett stereomikroskop med hjälp av en cellskrapa, pipettspetsar från en P10- eller P20-pipett eller ett skrapverktyg byggt av en Pasteur-pipett35.
Som nämnts ovan innebär detta protokoll dissociation av iPSC-kolonier till en encellssuspension för EB-induktion, medan iPSC:er med andra protokoll lämnas som aggregat som ska centrifugeras för EB-induktion36. EB-storlek, cellantal, form och morfologi har alla rapporterats påverka differentiering 37,38,39. Således antar vi att dissociationen till en encellssuspension möjliggör bättre EB-till-EB-likformighet i storlek och form efter centrifugering och därmed mer konsekventa resultat av hematopoetisk cellproduktion31.
Andra metoder för EB-induktion har beskrivits. Sådana metoder som använder en encellssuspension i kombination med ROCK-hämmare för att förbättra cellöverlevnaden har rapporterats vara fördelaktiga för att kontrollera EB-storlek och differentieringsresultat31.
Den rundbottnade 96-brunnars EB-induktionsmetoden som beskrivs i detta protokoll är lämplig för storskalig produktion av EB och möjliggör uppskalning av OC-produktion. Fler nya metoder för hematopoetisk differentiering utan ett induktionssteg i embryoidkroppen med potential att underlätta differentieringsprocessen har nyligen beskrivits32. Dessa protokoll har dock ännu inte upprättats för differentiering av OC33.
I det ovan nämnda protokollet beskriver vi medieförändringen på dag 5 av hematopoetisk differentiering. Ett litet antal flytande celler kan dyka upp redan runt dag 4-5 av differentieringen. För att undvika att flytande celler kasseras bör mediet samlas upp i ett rör och centrifugeras innan det kasseras. Cellpelleten i botten av röret måste sedan lossna med det färska mediet och bör överföras tillbaka till brunnar på en 6-hålsplatta. Betydelsen av den tidiga flytande cellpopulationen för OC-differentiering återstår dock att fastställa.
Produktionen av hematopoetiska celler kan bedömas med hjälp av flödescytometri. Höga utbyten av CD45+, CD14+ och CD11b+-celler är önskvärda för osteoklastdifferentiering33. Kryokonservering av skördade flytande hematopoetiska celler har rapporterats vara utmanande med generellt begränsade återhämtningshastigheter och låg cellviabilitet40,41. Genom att kryokonservera hematopoetiska celler i ett kryokonserveringsmedium bestående av 50 % av ett serumfritt hematopoetiskt cellexpansionsmedium (se Materialtabell), 40 % FBS och 10 % DMSO, kunde vi återvinna celler med en cellviabilitet på cirka 90,3 % ± 2,62 SD (n = 7) efter upptining.
Osteoklastogenes kräver sammansmältning av flera mononukleära OC-prekursorer för att bilda flerkärniga osteoklaster som kan mineral- och benresorption. Medan murina OC-prekursorcellinjer helt enkelt behöver tillsats av RANKL för att inducera OC-bildning42, kräver humana prekursorer ytterligare M-CSF för cellöverlevnad och proliferation43. OSCAR har nyligen upptäckts som ytterligare en receptor som är involverad i OC-differentiering, även om endast typ I-kollagen hittills har identifierats som en ligand. Medan forskning om OSCAR med iPSC-härledda OCs fortfarande är begränsad, verkar suprafysiologiska in vitro RANKL- och M-CSF-koncentrationer i en murin cellinje kringgå behovet av OSCAR-aktivering44, aktivering av OSCAR in vivo verkar vara en nödvändig kostnadsstimulerande signal för osteoklastogenes45. En ytterligare faktor som måste beaktas är brunnsplattans yta. Kemiska46 och fysikaliska47 ytegenskaper är kända för att påverka osteoklastdifferentiering och kan antingen främja eller hindra framgångsrik differentiering. En viss heterogenitet inom prekursorpopulationen verkar också vara avgörande för framgångsrik fusion av OCs, eftersom olika fusionsrelaterade faktorer som CD47 och DC-STAMP verkar i olika stadier av osteoklastfusion48.
Sammanfattningsvis möjliggör detta protokoll differentiering av humant OC från iPSCs för att underlätta och påskynda OC-forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna redovisar inga motstridiga intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka medlemmarna i Giachelli-labbet för deras tekniska hjälp och stöd. Vi tackar W. M. Keck Microscopy Center och Keck Center Manager, Dr. Nathanial Peters, för hjälp med att få konfokalmikroskopi och vidvinkelmikroskopibilder. Vi tackar också UW Flow Core Facility och Flow Core Facility manager, Aurelio Silvestroni, för teknisk support och hjälp. Slutligen tackar vi Hannah Blümke för stödet med illustration och grafisk design.
Finansieringen tillhandahölls genom National Institutes of Health-anslaget R35 HL139602-01. Vi erkänner också NIH S10-anslag S10 OD016240 för instrumentfinansiering vid W. M. Keck Center samt NIH-anslag 1S10OD024979-01A1 för instrumentfinansiering vid UW Flow Core Facility.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250-10ML | |
| Antibody - Anti-Cathepsin K | Abcam | ab19027 | |
| Antibody - APC-conjugated Anti-Human CD45 | BD | 555485 | |
| Antibody - APC-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Control | BD | 555751 | |
| Antibody - BV711-conjugated Anti-Human CD14 | BD | 563372 | |
| Antibody - BV711-conjugates Mouse IgG2b, κ Isotype Control | BD | 563125 | |
| Antibody - Goat Anti-Rabbit IgG H&L Alexa Fluor® 647 | Abcam | ab150079 | |
| Antibody - PE-conjugated Anti-Human CD14 | R&D Systems | FAB3832P-025 | |
| Antibody - PE-conjugated Anti-Human Integrin alpha M/CD11b | R&D Systems | FAB16991P-025 | |
| Antibody - PE-Cy7-conjugated Anti-Human CD34 | BD | 560710 | |
| Antibody - PE-Cy7-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 557872 | |
| Antibody - PE/Cyanine5-conjugated Anti-Human CD11b | Biolegend | 301308 | |
| Antibody - PE/Cyanine5-conjugated Mouse IgG1, κ Isotype Ctrl | Biolegend | 400118 | |
| Antibody - PerCP-Cy5.5-conjugated Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD | 550795 | |
| Antibody - PerCpCy5.5-conjugated Anti-Human CD43 | BD | 563521 | |
| Bone Resorption Assay Kit | CosmoBioUSA | CSR-BRA-24KIT | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | ThermoFisher | 16812556 | |
| Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract | R&D Sytems | 3434-010-02 | Basal membrane extract |
| DAPI | R&D Systems | 5748/10 | |
| Dispase (5 U/mL) | STEMCELL Technologies | 7913 | |
| DMEM/F-12 with 15 mM HEPES | Stem Cell | 36254 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537-500ML | |
| Human Bone Morphogenetic Protein 4 (hBMP4) | STEMCELL Technologies | 78211 | |
| Human IL-3 | STEMCELL Technologies | 78146.1 | |
| Human Macrophage Colony-stimulating Factor (hM-CSF) | STEMCELL Technologies | 78150.1 | |
| Human Soluble Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand (hsRANKL) | STEMCELL Technologies | 78214.1 | |
| Human Stem Cell Factor (hSCF) | STEMCELL Technologies | 78155.1 | |
| Human TruStain FcX (Fc Receptor Blocking Solution) | Biolegend | 422301 | |
| Human Vascular Endothelial Growth Factor-165 (hVEGF165) | STEMCELL Technologies | 78073 | |
| Invitrogen Rhodamine Phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| MEM α, nucleosides, no phenol red | ThermoFisher | 41061029 | |
| mFreSR | STEMCELL Technologies | 05855 | Serum free cryopreservation medium |
| mTeSR Plus medium | STEMCELL Technologies | 100-0276 | Human iPSC-serum free medium (hiPSC-SFM) |
| Nunclon Sphera 96-Well, Nunclon Sphera-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate | Thermo Scientific | 174925 | Round bottom ultra-low attachment 96-well plate |
| P1000 Wide Bore Tips | ThermoFisher | 2079GPK | |
| ROCK-Inhibitor Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72304 | |
| StemSpan SFEM | StemCell | 09650 | Hematopoietic cell culture medium |
| TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Thermo Fisher | 12563011 | Single-cell dissociation reagent |
| Ultraglutamine | Bioscience Lonza | BE17-605E/U1 | |
| X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Bioscience Lonza | 04-418Q | Hematopoietic basal medium |
| µ-Slide 8 Well High | Ibidi | 80806 |
References
- Bar-Shavit, Z. The osteoclast: A multinucleated, hematopoietic-origin, bone-resorbing osteoimmune cell. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (5), 1130-1139 (2007).
- Boyce, B. F. Advances in the regulation of osteoclasts and osteoclast functions. Journal of Dental Research. 92 (10), 860-867 (2013).
- Buranaphatthana, W., et al. Engineered osteoclasts resorb necrotic alveolar bone in anti-RANKL antibody-treated mice. Bone. 153, 116144 (2021).
- Wang, L., et al. Isolation, purification, and differentiation of osteoclast precursors from rat bone marrow. Journal of Visualized Experiments. 2019 (147), e58895 (2019).
- Mercatali, L., et al. Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines. Journal of Visualized Experiments. (127), e56311 (2017).
- Marino, S., Bishop, R. T., de Ridder, D., Delgado-Calle, J., Reagan, M. R. 2D and 3D in vitro co-culture for cancer and bone cell interaction studies. Methods in Molecular Biology. 1914, 71-98 (2019).
- Rementer, C. W., et al. An inducible, ligand-independent receptor activator of NF-κB gene to control osteoclast differentiation from monocytic precursors. PloS One. 8 (12), e0084465 (2013).
- Rementer, C., et al. Engineered myeloid precursors differentiate into osteoclasts and resorb heterotopic ossification in mice. Research Square Priprint. , 2156913 (2022).
- Bjelić, D., Finšgar, M. Bioactive coatings with anti-osteoclast therapeutic agents for bone implants: Enhanced compliance and prolonged implant life. Pharmacological Research. 176, 106060 (2022).
- Minkin, C., Marinho, V. C. Role of the osteoclast at the bone-implant interface. Advances in dental research. 13, 49-56 (1999).
- Kodama, J., Kaito, T. Osteoclast multinucleation: Review of current literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 1-35 (2020).
- Mun, S. H., Park, P. S. U., Park-Min, K. H. The M-CSF receptor in osteoclasts and beyond. Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1239-1254 (2020).
- Plotkin, L. I., Bivi, N. Local regulation of bone cell function. Basic and Applied Bone Biology. , 47-73 (2014).
- Hodge, J. M., Kirkland, M. A., Nicholson, G. C. Multiple roles of M-CSF in human osteoclastogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (3), 759-768 (2007).
- Ono, T., Nakashima, T.
- Boyce, B. F., Xiu, Y., Li, J., Xing, L., Yao, Z.
- Novack, D. V.
- Kim, K., Lee, S. H., Jung, H. K., Choi, Y., Kim, N. NFATc1 induces osteoclast fusion via up-regulation of Atp6v0d2 and the dendritic cell-specific transmembrane protein (DC-STAMP). Molecular Endocrinology. 22 (1), 176-185 (2008).
- Wu, H., Xu, G., Li, Y. P. Atp6v0d2 is an essential component of the osteoclast-specific proton pump that mediates extracellular acidification in bone resorption. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (5), 871 (2009).
- Vignery, A. Macrophage fusion: The making of osteoclasts and giant cells. The Journal of Experimental Medicine. 202 (3), 337 (2005).
- Chiu, Y. H., Ritchlin, C. T. DC-STAMP: A key regulator in osteoclast differentiation. Journal of Cellular Physiology. 231 (11), 2402 (2016).
- Riedlova, P., Sood, S., Goodyear, C. S., Ansalone, C. Differentiation of functional osteoclasts from human peripheral blood CD14+ monocytes. Journal of Visualized Experiments. (191), e64698 (2023).
- Gothot, A., Pyatt, R., McMahel, J., Rice, S., Srour, E. F. Functional heterogeneity of human CD34+ cells isolated in subcompartments of the G0 /G1 phase of the cell cycle. Blood. 90 (11), 4384-4393 (1997).
- Dinella, J., Koster, M. I., Koch, P. J. Use of induced pluripotent stem cells in dermatological research. The Journal of Investigative Dermatology. 134 (8), e23 (2014).
- Grigoriadis, A. E., et al. Directed differentiation of hematopoietic precursors and functional osteoclasts from human ES and iPS cells. Blood. 115 (14), 2769-2776 (2010).
- Rössler, U., et al. Efficient generation of osteoclasts from human induced pluripotent stem cells and functional investigations of lethal CLCN7-related osteopetrosis. Journal of Bone and Mineral Research: The Official Journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 36 (8), 1621-1635 (2021).
- Chen, I. -P. Differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) into osteoclasts. Bio-Protocol. 10 (24), e3854-e3854 (2020).
- Buchrieser, J., James, W., Moore, M. D. Human induced pluripotent stem cell-derived macrophages share ontogeny with MYB-independent tissue-resident macrophages. Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).
- Abe, K., et al. Endoderm-specific gene expression in embryonic stem cells differentiated to embryoid bodies. Experimental Cell Research. 229 (1), 27-34 (1996).
- Perlingeiro, R. C. R., Kyba, M., Daley, G. Q. Clonal analysis of differentiating embryonic stem cells reveals a hematopoietic progenitor with primitive erythroid and adult lymphoid-myeloid potential. Development. 128 (22), 4597-4604 (2001).
- Pettinato, G., Wen, X., Zhang, N. Engineering strategies for the formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 24 (14), 1595 (2015).
- Ruiz, J. P., et al. Robust generation of erythroid and multilineage hematopoietic progenitors from human iPSCs using a scalable monolayer culture system. Stem Cell Research. 41, 101600 (2019).
- Blümke, A., et al. Comparison of osteoclast differentiation protocols from human induced pluripotent stem cells of different tissue origins. Stem Cell Research & Therapy. 14 (1), 319 (2023).
- Klepikova, A., et al. iPSC-Derived Macrophages: The differentiation protocol affects cell immune characteristics and differentiation trajectories. International Journal of Molecular Sciences. 23 (24), 16087 (2022).
- Neely, M. D., Tidball, A. M., Aboud, A. A., Ess, K. C., Bowman, A. B. Induced pluripotent stem cells (iPSCs): An emerging model system for the study of human neurotoxicology. Neuromethods. 56, 27-61 (2011).
- Doulatov, S., et al. Induction of multipotential hematopoietic progenitors from human pluripotent stem cells via re-specification of lineage-restricted precursors. Cell Stem Cell. 13 (4), 459-470 (2013).
- Van Winkle, A. P., Gates, I. D., Kallos, M. S. Mass transfer limitations in embryoid bodies during human embryonic stem cell differentiation. Cells, Tissues, Organs. 196 (1), 34-47 (2012).
- Kim, J. M., et al. Assessment of differentiation aspects by the morphological classification of embryoid bodies derived from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 20 (11), 1925-1935 (2011).
- Mohr, J. C., et al. The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).
- Lopez-Yrigoyen, M., et al. Production and characterization of human macrophages from pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (158), e61038 (2020).
- Cao, X., et al. Differentiation and functional comparison of monocytes and macrophages from hiPSCs with peripheral blood derivatives. Stem Cell Reports. 12 (6), 1282 (2019).
- Omata, Y., et al. Interspecies single-cell RNA-seq analysis reveals the novel trajectory of osteoclast differentiation and therapeutic targets. JBMR Plus. 6 (7), e10631 (2022).
- Hodge, J. M., Kirkland, M. A., Nicholson, G. C. Multiple roles of M-CSF in human osteoclastogenesis. Journal of Cellular Biochemistry. 102 (3), 759-768 (2007).
- Kim, N., Takami, M., Rho, J., Josien, R., Choi, Y. A novel member of the leukocyte receptor complex regulates osteoclast differentiation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (2), 201 (2002).
- Nedeva, I. R., Vitale, M., Elson, A., Hoyland, J. A., Bella, J. Role of OSCAR signaling in psteoclastogenesis and bone disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 641162 (2021).
- Bernhardt, A., Schamel, M., Gbureck, U., Gelinsky, M. Osteoclastic differentiation and resorption is modulated by bioactive metal ions Co2+, Cu2+ and Cr3+ incorporated into calcium phosphate bone cements. PLoS One. 12 (8), e0182109 (2017).
- Akasaka, T., et al. Different micro/nano-scale patterns of surface materials influence osteoclastogenesis and actin structure. Nano Research. 15 (5), 4201-4211 (2022).
- Hobolt-Pedersen, A. S., Delaissé, J. M., Søe, K. Osteoclast fusion is based on heterogeneity between fusion partners. Calcified Tissue International. 95 (1), 73 (2014).
