Summary
لفهم ديناميات شبكة من رقائق في القشرة المخية الحديثة ، فإنه من الضروري في نفس الوقت لتسجيل نشاط عدد كبير من الخلايا العصبية. داخل الجسم الحي اثنين الفوتون التصوير الكالسيوم هو الأسلوب الوحيد الذي يسمح احد لتسجيل نشاط الخلايا العصبية من سكان كثيفة مع وحيدة الخلية القرار.
Abstract
لفهم ديناميات شبكة من رقائق في القشرة المخية الحديثة ، فإنه من الضروري في نفس الوقت لتسجيل نشاط عدد كبير من الخلايا العصبية. داخل الجسم الحي اثنين الفوتون التصوير الكالسيوم هو الأسلوب الوحيد الذي يسمح احد لتسجيل نشاط الخلايا العصبية من سكان كثيفة مع وحيدة الخلية القرار. طريقة تتمثل في زرع نافذة التصوير الجمجمة ، حقن صبغة الفلورسنت مؤشر الكالسيوم التي يمكن اتخاذها من قبل أعداد كبيرة من الخلايا العصبية وأخيرا تسجيل نشاط الخلايا العصبية مع مرور الوقت باستخدام التصوير الكالسيوم في الجسم الحي ، two المجهر الفوتون. شارك في حقن الأصباغ نجمية محددة يسمح احد لتمييز الخلايا العصبية من الخلايا النجمية. يمكن تنفيذ هذا الاسلوب في التعبير عن جزيئات الفلورسنت الفئران في مجموعات سكانية فرعية معينة من الخلايا العصبية لفهم أفضل للتفاعلات شبكة من مجموعات مختلفة من الخلايا.
Protocol
- إعداد مؤشر الكالسيوم الفلورسنت الحل. نستخدم الأصباغ استر acetoxymethyl ، أو الأصباغ AM قصيرة. هذه الأصباغ التي يمكن اتخاذها من قبل الخلايا عند حقنها خارج الخلية. نستخدم عادة ولاية أوريغون والخضر BAPTA - 1 - Fluo صباحا أو 04:00 في تركيز 1 ملم. ويمكن الحصول على الأصباغ صباحا من Invitrogen 50 ميكروغرام في قارورة. نحن نستعد لأول مرة حل 20 ٪ من Pluronic F - 127 في DMSO. نحن الحار الحل قبل استخدامها كل يوم حتى واضحة لها. نحن بحل مؤشر الكالسيوم F-127/DMSO Pluronic 20 ٪ لمدة 15-20 دقيقة إلى تركيز من 10 ملم. ثم أننا تمييع الحل ل1MM في محلول يحتوي ، في ملي : 150 كلوريد الصوديوم ، 2.5 بوكل ، 10 Hepes ، ودرجة الحموضة 7.4. بالإضافة إلى ذلك ، وعادة ما يتم Sulforhodamine 100 ميكرومتر من 101 إلى النجمية التسمية وتصور ماصة خلال الحقن. نحن تصفية حل قبل الحقن مع فلتر ميكرون 0.49 الطرد المركزي (Stosiek وآخرون ، 2003 ؛. Garaschuk وآخرون ، 2006).
- زرع نافذة الجمجمة على المنطقة المراد تصويره. لقد كنا وصفت في النهج العام إن الرب ، ولكن التعديلات التالية مهمة لحقن الصبغة الكالسيوم :
جعل أصغر حج القحف من 2 ملم وقطرها على المنطقة القشرية ذات الاهتمام ، مع الحرص الشديد على عدم الإضرار الجافية الكامنة. تأمين ساترة في المكان خلال حج القحف ، ولكن جزئيا فقط تغطية حج القحف ، مما يترك فجوة صغيرة بين حافة حج القحف وساترة الزجاج للسماح للغرفة ماصة للدخول في القشرة بشكل غير مباشر. قبل الحقن ، وجعل بئر ضحل مع الاسمنت الأسنان حول حج القحف. ينبغي أن تمتد بشكل جيد كما هو الحال في اتجاه منقاري وتكون ضحلة بما يكفي للسماح للmicropipette الإدراج للحقن. - نقل الماوس نقله إلى مرحلة المجهر ويستوقف في الرأس ، كما هو مبين من خلال موقعنا على تصوير الفيديو تدفق الدم .
- سحب ماصات microelectrode الزجاج ليبلغ قطرها غيض الغلة 2-4 ميغا أوم في المقاومة ، وذلك باستخدام ماصة مجتذب. تحميل الصبغة مؤشر على مزيج من الكالسيوم والزجاج باستخدام ماصة microsyringe. باستخدام micromanipulator ، وانخفاض micropipette برفق على سطح الدماغ باستخدام 4X الهدف الذي وضعه ناعما ثم تحت الهدف 40X. اختيار موقع مناسب للحقن ، مثل أن هناك عدد قليل أو لا الأوعية الدموية المغطي لحجب التصوير. باستخدام اثنين من الفوتون المجهري ، وغيض من ماصة هو تصور والمتقدمة ببطء داخل القشرة ، إلى عمق 200 ميكرومتر تحت الجافية. ثم ، وضغط حقن صبغة الخليط في 10 PSI لمدة 1 دقيقة باستخدام Picospritzer. نقدم عادة 2-4 حقن الصبغة AM مزيج من الكالسيوم ، وفصلها في الفضاء بنحو 200-300 ميكرون. هذا النهج تحميل الجزء الأكبر من الحقن تداخل قليلا يضمن بشكل كاف الملون مساحة كبيرة مثل 600 × 600 ميكرون للتصوير الكالسيوم. يبدأ التصوير 1 بعد ساعة من الحقن من هذا الخليط صباحا صباغة ، للسماح لصبغ لنشر وسيتم تناولها من خلال الخلايا العصبية.
- أداء داخل الجسم الحي اثنين الفوتون التصوير مع العرف مجهر ثنائي الفوتون باستخدام TI - الياقوت الحرباء ليزر (ضبطها ل800-880 نانومتر) والمرايا كامبريدج الجلفانومتر التكنولوجيا. علينا الحصول على الصور باستخدام برامج ScanImage ضعت في مختبر للكاريل سفوبودا (Pologruto وآخرون ، 2003). الليزر السلطة هي عادة أقل بكثير من 70 ميغاواط في العينة. يتم الحصول على الصور الحقل بأكمله باستخدام إما 20X (0.95 NA) أو 40X (0.8 NA) أهداف أوليمبوس ، 1،95-15،63 في لقطة في الثانية (512 × 256 بكسل إلى 256 × 64 بكسل). يتم الحصول على خط بفحص 500 هرتز. خلال التصوير ، ويتم الاحتفاظ الحيوانات تحت التخدير isoflurane الخفيفة (0،6-0،9 ٪) ، ويتم الاحتفاظ أيضا عند 37 درجة مئوية درجة الحرارة باستخدام جهاز هارفارد جهاز التحكم. هو الحرص على الحفاظ على معدل التنفس الحيوانات أقرب إلى 100 الأنفاس / دقيقة قدر الإمكان. هذا المستوى من استخدام التخدير هو أدنى مستوى الذي يشل هذا الحيوان ، ولكن لا يزال يسمح النشاط العفوي ليتم تسجيلها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ميزة هذا الأسلوب أكثر من التسجيلات الكهربية هو أنه أقل الغازية ويسمح للتسجيلات نشاط الخلايا العصبية في شبكات كثيفة العصبية. عندما تفعل هذا الإجراء فإنه من المهم أن نتذكر أن تأخذ الحذر الشديد عند أداء حج القحف لا يلحق الضرر الجافية. حتى كمية صغيرة من نزيف تحت الجافية مع غامضة إلى حد كبير من التصوير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نود أن نعترف أولغا Garaschuk لإجراء مناقشات مفيدة حول الاستفادة المثلى من تحميل الجزء الأكبر من مؤشرات الكالسيوم.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Oregon Green BAPTA1-AM | Reagent | Invitrogen | O-6807 | |
| Fluo 4- AM | Reagent | Invitrogen | F-14201 | |
| Sulforhodamine 101 | Reagent | Invitrogen | S-359 | |
| Pluronic F-127 in DMSO | Reagent | Invitrogen | P-3000MP | |
| Centrifugal Filter (0.45 micron) | Reagent | EMD Millipore | UFC3 0HV 0S |
References
- Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo. Nat Protoc. 1, (2006).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In-vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7319-7324 (2003).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online 2:13. Biomed Eng Online. 2, (2003).
