Summary
כדי להבין את הדינמיקה של הרשת microcircuits ב הניאוקורטקס, חיוני להקליט בו זמנית את הפעילות של מספר גדול של נוירונים. In-vivo שני הפוטונים הדמיה סידן היא השיטה היחידה המאפשרת להקליט את הפעילות העצבית של אוכלוסייה צפופה עם רזולוציה של תא בודד.
Abstract
כדי להבין את הדינמיקה של הרשת microcircuits ב הניאוקורטקס, חיוני להקליט בו זמנית את הפעילות של מספר גדול של נוירונים. In-vivo שני הפוטונים הדמיה סידן היא השיטה היחידה המאפשרת להקליט את הפעילות העצבית של אוכלוסייה צפופה עם רזולוציה של תא בודד. השיטה מורכבת השתלת חלון הדמיה גולגולתי, הזרקת סידן פלורסנט אינדיקטור צבע זה יכול להיות נלקח על ידי מספר גדול של נוירונים ולבסוף להקליט את פעילותם של הנוירונים עם הדמיה זמן לשגות סידן שימוש ב-vivo two מיקרוסקופ פוטון. שיתוף הזרקת astrocyte ספציפי צבעים מאפשרת להבדיל בין הנוירונים האסטרוציטים. הטכניקה ניתן לבצע בעכברים לבטא מולקולות ניאון subpopulations ספציפיים של נוירונים כדי להבין טוב יותר את האינטראקציות רשת של קבוצות שונות של תאים.
Protocol
- הכן את הפתרון פלורסנט אינדיקטור סידן. אנו משתמשים בצבעי אסתר acetoxymethyl, או בקיצור AM צבעים. אלה הם צבעים שניתן לנקוט על ידי תאים כאשר הוא מוזרק extracellularly. אנו משתמשים בדרך כלל אורגון-Green-BAPTA 01:00 או Fluo, 04:00 בריכוז של 1 מ"מ. צבעים AM ניתן להשיג Invitrogen ב 50 בקבוקונים מיקרוגרם. אנחנו הראשונים להכין פתרון 20% Pluronic F-127 ב DMSO. אנו חם הפתרון לפני השימוש בכל יום עד ברור שלה. אנו לפזר את החיווי הסידן F-127/DMSO Pluronic 20% במשך 15-20 דקות עד לריכוז של 10 מ"מ. לאחר מכן, אנו לדלל הפתרון 1mm בתמיסה המכילה, במ"מ: 150 NaCl, KCl 2.5, 10 Hepes, pH 7.4. בנוסף, 100 Sulforhodamine 101 מיקרומטר נכלל בדרך כלל האסטרוציטים התווית לדמיין את פיפטה במהלך ההזרקה. אנחנו לסנן את הפתרון לפני זריקה עם מסנן 0.49 מיקרון צנטריפוגלי (Stosiek et al, 2003;.. Garaschuk et al, 2006).
- שתל חלון הגולגולת מעל האזור להיות צילמו. יש לנו תיאר את הגישה הכללית של יופיטר , אך את השינויים הבאים חשובים הזרקת צבע סידן:
הפוך craniotomy קטן של 2 מ"מ בקוטר מעל אזור בקליפת המוח של עניין, מטפלת קיצוני לא לפגוע הדורה הבסיסית. Secure coverslip במקום על craniotomy, אבל רק חלקית לכסות את craniotomy, השארת רווח קטן בין הקצה של craniotomy לבין coverslip זכוכית כדי לאפשר מקום טפטפת כדי להזין את קליפת המוח בעקיפין. לפני הזריקה, לעשות גם רדוד במלט שיניים סביב craniotomy. גם צריך להאריך מקורי כמו הכיוון להיות רדודים מספיק כדי לאפשר החדרת micropipette להזרקה. - העברת העכבר הועברו בשלב של המיקרוסקופ לבין לשתק את הראש, כפי שמוצג שלנו וידאו על הדמיה זרימת הדם .
- משוך microelectrode pipettes זכוכית בקוטר טיפ מניב 2-4 מגה אוהם התנגדות, חולץ בעזרת פיפטה. עומס מחוון סידן לצבוע לערבב על פיפטה הזכוכית באמצעות microsyringe. שימוש micromanipulator, בעדינות להוריד את micropipette על פני השטח של המוח באמצעות המטרה 4X, אשר אז ממוצבת היטב תחת מטרה 40X. בחר מיקום מתאים הזרקה, כך יש מעט או ללא כלי דם המכסה כדי לטשטש את ההדמיה. באמצעות שני פוטונים במיקרוסקופ, את קצה פיפטה הוא מדמיין מתקדמים לאט לתוך קליפת המוח, עד לעומק של 200 מיקרומטר מתחת הדורה. לאחר מכן, הלחץ להזריק את התערובת לצבוע ב PSI 10 דקה 1 באמצעות Picospritzer. אנחנו בדרך כלל לספק 2-4 זריקות של תערובת סידן לצבוע בבוקר, המופרדים בחלל בכ 200-300 מיקרון. גישה זו טוען עיקר זריקות מעט חופפות מבטיח כי שטח גדול כמו 600 x 600 מיקרון הוא מוכתם כראוי הדמיה סידן. בגין 1 שעה הדמיה לאחר ההזרקה של התערובת AM לצבוע, כדי לאפשר לצבוע כדי מפוזר להיות נלקח על ידי נוירונים.
- בצע ב-vivo שני הפוטונים הדמיה עם מנהג עשה מיקרוסקופ שני הפוטונים באמצעות TI-Sapphire Chameleon לייזר (מכוון 800-880 ננומטר) וקיימברידג' מראות טכנולוגיה גלונומטר. אנו לרכוש תמונות באמצעות תוכנת ScanImage שפותחה במעבדתו של קארל סוובודה (Pologruto et al., 2003). כוח לייזר היא בדרך כלל הרבה מתחת 70 mW ב המדגם. תמונות שדה שלם או נרכשים באמצעות 20X (0.95 NA) או 40X (0.8 NA) מטרות אולימפוס, בשעה 1.95-15.63 מסגרות לשנייה (512 x 256 פיקסלים 256 x 64 פיקסלים). סריקות קו נרכשים על 500 הרץ. במהלך הדמיה, בעלי חיים נשמרים תחת הרדמה isoflurane אור (0.6-0.9%), ו נשמרים גם ב 37 מעלות צלזיוס טמפרטורה באמצעות מנגנון הרווארד התקן הבקרה. טיפול הוא נלקח כדי לשמור על קצב הנשימה של בעלי חיים קרוב ל 100 נשימות / דקה ככל האפשר. רמה זו של שימוש הרדמה היא הרמה הנמוכה ביותר שמגביל את בעל החיים, אבל עדיין מאפשר פעילות ספונטנית שיירשמו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
היתרון של שיטה זו על פני הקלטות אלקטרו היא שזה פחות פולשני ומאפשר הקלטות של פעילות צפופה רשתות נוירונים עצביים. כאשר עושים את זה הליך זה חשוב לזכור לטפל קיצוניים בעת ביצוע craniotomy לא לפגוע הדורה. אפילו כמות קטנה של דימום עם subdural מאוד לטשטש את ההדמיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ברצוננו להודות אולגה Garaschuk לדיונים מועיל על אופטימיזציה של העמסה מרבית האינדיקטורים סידן.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Oregon Green BAPTA1-AM | Reagent | Invitrogen | O-6807 | |
| Fluo 4- AM | Reagent | Invitrogen | F-14201 | |
| Sulforhodamine 101 | Reagent | Invitrogen | S-359 | |
| Pluronic F-127 in DMSO | Reagent | Invitrogen | P-3000MP | |
| Centrifugal Filter (0.45 micron) | Reagent | EMD Millipore | UFC3 0HV 0S |
References
- Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo. Nat Protoc. 1, (2006).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In-vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7319-7324 (2003).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online 2:13. Biomed Eng Online. 2, (2003).
