In Vivo 2-Photon Imaging calcium dans la couche 2 / 3 de souris

Summary

Pour comprendre la dynamique des réseaux de microcircuits du néocortex, il est indispensable d'enregistrer simultanément l'activité d'un grand nombre de neurones. L'imagerie in vivo de calcium à deux photons est la seule méthode qui permet d'enregistrer l'activité d'une population dense de neurones avec une seule cellule de résolution.

Abstract

Pour comprendre la dynamique des réseaux de microcircuits du néocortex, il est indispensable d'enregistrer simultanément l'activité d'un grand nombre de neurones. L'imagerie in vivo de calcium à deux photons est la seule méthode qui permet d'enregistrer l'activité d'une population dense de neurones avec une seule cellule de résolution. La méthode consiste à implanter une fenêtre d'imagerie crânienne, l'injection d'un colorant fluorescent de calcium indicateur qui peut être repris par un grand nombre de neurones et finalement d'enregistrer l'activité des neurones à l'imagerie calcique laps de temps en utilisant une in-vivo deux microscope photonique. La co-injection des astrocytes spécifiques colorants permet de différencier les neurones à partir des astrocytes. La technique peut être réalisée sur des souris exprimant des molécules fluorescentes dans les sous-populations spécifiques de neurones pour mieux comprendre les interactions en réseau des différents groupes de cellules.

Protocol

1. Préparer la solution de calcium indicateur fluorescent. Nous utilisons des colorants ester acétoxyméthyle, colorants ou AM pour faire court. Ce sont des colorants qui peuvent être prises par les cellules lorsqu'elles sont injectées extracellulaire. Nous utilisons généralement l'Oregon-Vert BAPTA-1 AM ou Fluo-quatre heures à une concentration de 1 mM. AM colorants peuvent être obtenus auprès de Invitrogen dans 50 flacons de microgramme. Nous avons d'abord préparer une solution à 20% de Pluronic F-127 dans le DMSO. Nous chauffer la solution avant de l'utiliser chaque jour jusqu'à son clair. Nous dissoudre l'indicateur de calcium du F-127/DMSO Pluronic 20% pour les 15-20 minutes à une concentration de 10 mM. Nous avons ensuite diluer la solution à 1 mM dans une solution contenant, en mm: 150 NaCl, 2,5 KCl, 10 HEPES, pH 7,4. En outre, 100 101 uM Sulforhodamine est habituellement inclus aux astrocytes étiquettes et de visualiser la pipette lors de l'injection. Nous filtrer la solution avant l'injection d'un filtre 0,49 micron centrifuge (Stosiek et al, 2003;.. Garaschuk et al, 2006).
   
   
2. Implant une fenêtre crânienne sur la zone à imager. Nous avons décrit l'approche générale de JoVE , mais les modifications suivantes sont importantes pour l'injection de colorant de calcium:
   
   Faites une petite craniotomie de 2 mm de diamètre sur la surface corticale d'intérêt, prenant un soin extrême à ne pas endommager le sous-tendent-mère. Fixez une lamelle en place au cours de la craniotomie, mais ne couvrent que partiellement la craniotomie, laissant un petit espace entre le bord de la craniotomie et la lamelle de verre pour laisser place à une pipette pour entrer dans le cortex oblique. Avant l'injection, faire un puits peu profond avec du ciment dentaire autour de la craniotomie. Le bien doit s'étendre en direction rostrale et être assez peu profond pour permettre l'insertion de la micropipette pour l'injection.
   
   
3. Transfert de la souris transféré à l'étape du microscope et d'immobiliser la tête, comme le montre notre vidéo sur l'imagerie du flux sanguin .
   
   
4. Tirez pipettes microélectrode de verre à un diamètre de l'extrémité céder 2-4 Ohms Mega dans la résistance, en utilisant un extracteur de pipette. Chargez le mélange de teinture de calcium indicateur sur la pipette de verre à l'aide d'une microseringue. L'utilisation d'un micromanipulateur, abaissez doucement la micropipette sur la surface du cerveau en utilisant un objectif 4X, qui est ensuite finement placé sous un objectif 40X. Choisissez un emplacement approprié pour l'injection, de sorte qu'il ya peu ou pas de vaisseaux sanguins recouvrant à obscurcir l'image. Utiliser microscopie à deux photons, la pointe de la pipette est visualisée et s'avança lentement dans le cortex, à une profondeur de 200 micromètres en dessous de la dure-mère. Ensuite, la pression d'injecter le mélange de teinture à 10 psi pendant 1 minute en utilisant un Picospritzer. En général, nous livrer deux à quatre injections du mélange de colorants AM calcium, séparés dans l'espace d'environ 200-300 microns. Cette approche de chargement en vrac des injections qui se chevauchent légèrement assure une région aussi grande que 600 x 600 microns est suffisamment colorées pour l'imagerie calcique. Commencez d'imagerie 1 heure après l'injection du mélange de colorant AM, afin de permettre au colorant de diffuser et être repris par les neurones.
   
   
5. Effectuer in vivo à deux photons avec une imagerie personnalisée faite microscope à deux photons en utilisant un caméléon Ti-Sapphire Laser (800-880 accordé à nm) et des miroirs de Cambridge Technology galvanomètre. Nous acquérir des images à l'aide du logiciel développé dans le laboratoire scanimage Karel Svoboda (Pologruto et al., 2003). Puissance du laser est généralement bien en dessous de 70 mW à l'échantillon. Ensemble du champ des images sont acquises soit en utilisant un 20X (0,95 NA) ou 40X (0,8 NA) objectifs Olympus, à 1.95 à 15.63 images par seconde (512 x 256 pixels à 256 x 64 pixels). Ligne scans sont acquises à 500 Hz. Lors d'imagerie, les animaux sont maintenus sous anesthésie à l'isoflurane léger (0,6-0,9%), et sont également maintenus à 37 ° C en utilisant un appareil Harvard température de l'appareil de contrôle. Il est pris soin de garder le rythme respiratoire des animaux au plus près à 100 respirations / minute que possible. Ce niveau d'utilisation d'anesthésie est le niveau le plus bas qui immobilise l'animal, mais permet encore l'activité spontanée d'être enregistré.

Discussion

L'avantage de cette méthode sur des enregistrements électrophysiologiques, c'est qu'il est moins invasive et permet l'enregistrement de l'activité neuronale dans les denses réseaux de neurones. Lorsque vous effectuez cette procédure, il est important de se rappeler de prendre un soin extrême lors de l'exécution de la craniotomie pour ne pas endommager la mère. Même une petite quantité de saignement sous-dural avec énormément obscurs de l'imagerie.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Oregon Green BAPTA1-AM	Reagent	Invitrogen	O-6807
Fluo 4- AM	Reagent	Invitrogen	F-14201
Sulforhodamine 101	Reagent	Invitrogen	S-359
Pluronic F-127 in DMSO	Reagent	Invitrogen	P-3000MP
Centrifugal Filter (0.45 micron)	Reagent	EMD Millipore	UFC3 0HV 0S