In vivo 2-Photon Imaging Calcium in Layer 2 / 3 van Muizen

Summary

Om te begrijpen netwerk dynamiek van microcircuits in de neocortex, is het essentieel om tegelijkertijd op te nemen van de activiteit van een groot aantal neuronen. In-vivo twee-foton calcium beeldvorming is de enige methode die het mogelijk maakt een op te nemen van de activiteit van een dichte neuronale populatie met single-cell resolutie.

Abstract

Om te begrijpen netwerk dynamiek van microcircuits in de neocortex, is het essentieel om tegelijkertijd op te nemen van de activiteit van een groot aantal neuronen. In-vivo twee-foton calcium beeldvorming is de enige methode die het mogelijk maakt een op te nemen van de activiteit van een dichte neuronale populatie met single-cell resolutie. De methode bestaat uit het implanteren van een schedel imaging venster, het injecteren van een fluorescente calcium indicator kleurstof die kan worden genomen door een groot aantal neuronen en tenslotte het opnemen van de activiteit van neuronen met time-lapse calcium beeldvorming met behulp van een in-vivo twee foton microscoop. Co-injectie van astrocyten-specifieke kleurstoffen kunnen een onderscheid te maken neuronen van astrocyten. De techniek kan worden uitgevoerd in muizen die fluorescerende moleculen in specifieke subpopulaties van neuronen beter inzicht in de interactie met het netwerk van verschillende groepen van cellen.

Protocol

1. Bereid de fluorescerende calcium indicator oplossing. We maken gebruik van acetoxymethyl ester kleurstoffen, of AM-kleurstoffen voor kort. Dit zijn kleurstoffen die kunnen worden genomen door de cellen bij het extracellulair geïnjecteerd. Wij gebruiken meestal de Oregon-Green-BAPTA een AM-of Fluo-4 uur in een concentratie van 1 mM. AM kleurstoffen kunnen worden verkregen bij Invitrogen in 50 microgram flacons. We hebben eerst voor te bereiden een 20% oplossing van Pluronic F-127 in DMSO. We voorafgaande warm de oplossing om elke dag te gebruiken totdat het duidelijk. We ontbinding van de calcium-indicator van de 20% Pluronic F-127/DMSO gedurende 15-20 minuten tot een concentratie van 10 mM. Vervolgens hebben we verdun de oplossing tot 1 mm in een oplossing die, in mm: 150 NaCl, KCl 2,5, 10 Hepes, pH 7,4. Daarnaast wordt 100 uM sulforhodamine 101 meestal opgenomen om label astrocyten en visualiseren van de pipet tijdens de injectie. We filter de oplossing vóór injectie met een 0,49 micron centrifugaal filter (Stosiek et al., 2003;.. Garaschuk et al., 2006).
   
   
2. Implantaat een craniale venster over het gebied dat moet worden afgebeeld. We hebben beschreven de algemene aanpak in Jupiter , maar de volgende wijzigingen zijn van belang voor calcium dye injectie:
   
   Maak een kleinere craniotomie van 2 mm in diameter over de corticale gebied van belang, waarbij uiterste zorg niet aan de onderliggende dura schade. Veilig een dekglaasje op zijn plaats over de craniotomie, maar slechts gedeeltelijk betrekking hebben op de craniotomie, waardoor een kleine ruimte tussen de rand van de craniotomie en het glazen dekglaasje om ruimte voor een pipet om de cortex schuin gaan mogelijk te maken. Voorafgaand aan de injectie, maak dan een ondiepe goed met tandheelkundig cement rond de craniotomie. Het goed moet zo rostrale te breiden in de richting en zijn ondiep genoeg om het inbrengen van de micropipet voor injectie toe.
   
   
3. Breng de muis naar het stadium van de microscoop en immobiliseren het hoofd, zoals weergegeven in onze video-on-doorbloeding beeldvorming .
   
   
4. Trek glas micro-elektrode pipetten om een ​​tip diameter waardoor 2-4 Mega Ohm in verzet, met behulp van een pipet trekker. Laad de calcium indicator verf mengen op de glazen pipet met een micro. Met behulp van een micromanipulator voorzichtig lager de micropipet op het oppervlak van de hersenen met behulp van een 4X doelstelling, die dan fijn bevindt zich onder een 40X doelstelling. Kies een geschikte locatie voor injectie, zodat er weinig of geen bovenliggende bloedvaten naar de beeldvorming duister. Met behulp van twee-foton microscopie, de punt van de pipet wordt gevisualiseerd en geavanceerde langzaam in de cortex, tot een diepte van 200 micrometer onder de dura. Vervolgens druk injecteren de kleurstof mengsel bij 10 PSI gedurende 1 minuut met behulp van een Picospritzer. We meestal leveren twee tot vier injecties van de AM-calcium verf mengen, gescheiden in de ruimte door ongeveer 200-300 micron. Deze bulk laden benadering van iets overlappende injecties zorgt ervoor dat een gebied zo groot als 600 x 600 micron voldoende is gekleurd voor calcium beeldvorming. Begin imaging 1 uur na de injectie van de AM-kleurstof mengsel, zodat de kleurstof te verspreiden en worden opgenomen door neuronen.
   
   
5. Uitvoeren van in-vivo twee-foton beeldvorming met een op maat gemaakte twee-foton microscoop met behulp van een Chameleon Ti-saffier-laser (afgestemd op 800-880 nm) en Cambridge Technology galvanometer spiegels. We krijgen beelden met behulp van scanimage Software ontwikkeld in Karel Svoboda het laboratorium (Pologruto et al.., 2003). Laser Power is meestal ver onder 70 mW bij het monster. Hele veld beelden worden verkregen, hetzij met behulp van een 20X (0,95 NA) of 40X (0.8 NA) Olympus doelstellingen, bij 1.95-15.63 frames per seconde (512 x 256 pixels 256 x 64 pixels). Lijn scans worden verworven bij 500 Hz. Tijdens de beeldvorming, worden dieren gehouden onder lichte isofluraananesthesie (0.6-0.9%), en zijn ook bewaard bij 37 ° C met behulp van een Harvard Apparatuur Temperature Control Device. Zorg wordt verstaan ​​de ademfrequentie van de dieren zo dicht bij 100 ademhalingen / minuut mogelijk te maken. Dit niveau van de anesthesie te gebruiken is het laagste niveau dat het dier immobiliseert, maar nog steeds vergunningen spontane activiteit op te nemen.

Discussion

Het voordeel van deze methode meer dan elektrofysiologische opnames is dat het minder invasief en laat de opnames van de activiteit in dichte neuronale neuronale netwerken. Bij het doen van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om uiterste zorg te nemen bij het uitvoeren van de craniotomie niet naar de dura schade. Zelfs een kleine hoeveelheid van de subdurale bloeden met een sterk obscure de beeldvorming.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Oregon Green BAPTA1-AM	Reagent	Invitrogen	O-6807
Fluo 4- AM	Reagent	Invitrogen	F-14201
Sulforhodamine 101	Reagent	Invitrogen	S-359
Pluronic F-127 in DMSO	Reagent	Invitrogen	P-3000MP
Centrifugal Filter (0.45 micron)	Reagent	EMD Millipore	UFC3 0HV 0S