Vivo फीट 2 फोटॉन परत में कैल्शियम इमेजिंग / 2 चूहे के 3

Summary

Neocortex में microcircuits के नेटवर्क की गतिशीलता को समझने के लिए, यह एक साथ न्यूरॉन्स की एक बड़ी संख्या की गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए आवश्यक है. Vivo में दो photon कैल्शियम इमेजिंग केवल एक ही तरीका है कि एक एकल कोशिका संकल्प के साथ एक घने neuronal जनसंख्या का गतिविधि रिकॉर्ड करने की अनुमति देता है.

Abstract

Neocortex में microcircuits के नेटवर्क की गतिशीलता को समझने के लिए, यह एक साथ न्यूरॉन्स की एक बड़ी संख्या की गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए आवश्यक है. Vivo में दो photon कैल्शियम इमेजिंग केवल एक ही तरीका है कि एक एकल कोशिका संकल्प के साथ एक घने neuronal जनसंख्या का गतिविधि रिकॉर्ड करने की अनुमति देता है. विधि एक कपाल इमेजिंग खिड़की दाखिल, एक फ्लोरोसेंट कैल्शियम सूचक डाई है कि न्यूरॉन्स की बड़ी संख्या के द्वारा लिया जा सकता है और अंत में एक में vivo दो फोटॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग कर समय व्यतीत हो कैल्शियम इमेजिंग के साथ न्यूरॉन्स की गतिविधि रिकॉर्डिंग इंजेक्शन में होते हैं. Astrocyte विशिष्ट रंगों के सह - इंजेक्शन एक astrocytes से न्यूरॉन्स अंतर करने के लिए अनुमति देता है. तकनीक चूहों में कोशिकाओं के विभिन्न समूहों के नेटवर्क बातचीत के लिए बेहतर समझने के लिए न्यूरॉन्स के विशिष्ट उप - जनसंख्या में फ्लोरोसेंट अणु व्यक्त किया जा सकता है.

Protocol

1. फ्लोरोसेंट कैल्शियम सूचक समाधान तैयार है. हम acetoxymethyl एस्टर रंगों का उपयोग करें, या AM कम करने के लिए रंगों. रंजक है कि कोशिकाओं द्वारा लिया जा सकता है जब extracellularly इंजेक्शन हैं. हम आम तौर पर 1 मिमी की एक एकाग्रता में ओरेगन ग्रीन BAPTA-1 AM AM या Fluo-4 का उपयोग करें. AM रंजक 50 माइक्रोग्राम शीशियों में Invitrogen से प्राप्त किया जा सकता है है. हम पहले DMSO में एक एफ 127 Pluronic की 20% समाधान तैयार करते हैं. हम समाधान से पहले गर्म करने के लिए अपनी स्पष्ट जब तक हर दिन का उपयोग करें. हम कैल्शियम सूचक 20% 10 मिमी की एक एकाग्रता के लिए 15-20 मिनट के लिए Pluronic F-127/DMSO भंग. 150 NaCl, 2.5 KCl, 10 Hepes, 7.4 पीएच: हम तो एक युक्त मिमी में, समाधान में 1mm का हल पतला. इसके अलावा, 100 सुक्ष्ममापी 101 Sulforhodamine आमतौर पर लेबल astrocytes के लिए शामिल है और इंजेक्शन के दौरान विंदुक कल्पना. हम 0.49 माइक्रोन केन्द्रापसारक फिल्टर (; Garaschuk एट अल, 2006 Stosiek एट अल, 2003) के साथ इंजेक्शन के लिए पहले हल फिल्टर.
   
   
2. Imaged किया जा क्षेत्र पर कपाल विंडो प्रत्यारोपण. हम जौव में सामान्य दृष्टिकोण वर्णित है , लेकिन निम्नलिखित संशोधनों कैल्शियम डाई इंजेक्शन के लिए महत्वपूर्ण हैं:
   
   ब्याज की cortical क्षेत्र पर व्यास में 2 मिमी के छोटे craniotomy बनाओ, चरम देखभाल लेने के अंतर्निहित dura नुकसान नहीं है. Craniotomy अधिक जगह में एक coverslip सुरक्षित है, लेकिन केवल आंशिक रूप से craniotomy कवर, प्रांतस्था obliquely दर्ज करें विंदुक के लिए कमरे की अनुमति के लिए craniotomy और गिलास coverslip के किनारे के बीच एक छोटे से अंतराल छोड़ने के लिए. इंजेक्शन के लिए पहले, craniotomy आसपास दंत सीमेंट के साथ एक उथले अच्छी तरह से बनाने के. अच्छी तरह के रूप में व्याख्यान चबूतरे वाला दिशा में विस्तार और बहुत उथले इंजेक्शन के लिए micropipette की प्रविष्टि की अनुमति होना चाहिए.
   
   
3. माइक्रोस्कोप के चरण के लिए स्थानांतरित माउस स्थानांतरण और सिर स्थिर, के रूप में हमारे रक्त प्रवाह इमेजिंग पर वीडियो में दिखाया गया है .
   
   
4. कोई टिप व्यास प्रतिरोध में 2-4 मेगा Ohms उपज, एक विंदुक खींचने का उपयोग कांच microelectrode pipettes खींचो. लोड ग्लास विंदुक पर कैल्शियम सूचक डाई मिश्रण एक microsyringe का उपयोग. एक micromanipulator का प्रयोग, धीरे से एक 4X उद्देश्य है, जो फिर पतले है एक 40x उद्देश्य के तहत तैनात का उपयोग कर मस्तिष्क की सतह पर micropipette कम. इंजेक्शन के लिए एक उपयुक्त स्थान है, ऐसी है कि वहाँ कुछ है या नहीं overlying रक्त वाहिकाओं इमेजिंग अस्पष्ट हैं चुनें. दो photon माइक्रोस्कोपी का प्रयोग, पिपेट की नोक कल्पना और प्रांतस्था में धीरे - धीरे उन्नत dura नीचे 200 micrometers के एक गहराई. फिर, दबाव 1 Picospritzer का उपयोग मिनट के लिए 10 साई पर डाई मिश्रण इंजेक्षन. हम आम तौर पर AM कैल्शियम डाई मिश्रण के दो से चार इंजेक्शन, लगभग 200-300 माइक्रोन के द्वारा अंतरिक्ष में अलग उद्धार. थोड़ा अतिव्यापी इंजेक्शन के इस थोक लोड हो रहा है दृष्टिकोण सुनिश्चित करता है कि एक क्षेत्र के रूप में 600 x 600 microns के रूप में बड़े पर्याप्त कैल्शियम इमेजिंग के लिए दाग है. AM डाई मिश्रण के इंजेक्शन के बाद शुरू इमेजिंग 1 घंटे फैलाना और न्यूरॉन्स द्वारा लिया डाई के लिए अनुमति देने के.
   
   
5. Vivo में एक रिवाज के साथ दो photon इमेजिंग दो photon माइक्रोस्कोप बनाया गिरगिट तिवारी - नीलम (800-880 एनएम के लिए देखते) लेजर और कैम्ब्रिज प्रौद्योगिकी galvanometer दर्पण का उपयोग करते हुए प्रदर्शन. हम ScanImage कैरेल SVOBODA प्रयोगशाला (Pologruto एट अल., 2003) में विकसित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों का अधिग्रहण. लेजर पावर नमूना में 70 मेगावाट से नीचे अच्छी तरह से आम तौर पर है. पूरे क्षेत्र छवियों या तो 1.95-15.63 फ्रेम प्रति सेकंड (512 x 256 x 64 पिक्सल के लिए 256 पिक्सल) (0.95 एनए) 20X या 40x (0.8 एनए) ओलिंप उद्देश्यों, उपयोग के लिए अर्जित कर रहे हैं. रेखा स्कैन 500 हर्ट्ज पर अर्जित कर रहे हैं. इमेजिंग के दौरान जानवरों प्रकाश isoflurane संज्ञाहरण (0.6-.9%) के तहत रखा जाता है, और भी 37 पर रखा डिग्री सेल्सियस एक हार्वर्ड उपकरण तापमान नियंत्रण उपकरण का उपयोग कर. देखभाल करने के लिए संभव के रूप में 100 / साँस मिनट के करीब के रूप में पशुओं की सांस दर रखने के लिए ले लिया है. संज्ञाहरण के उपयोग की इस स्तर निम्नतम स्तर है कि पशु immobilizes है, लेकिन अभी भी सहज गतिविधि परमिट के लिए दर्ज हो.

Discussion

electrophysiological रिकॉर्डिंग पर इस विधि का लाभ यह है कि यह कम आक्रामक है और घने neuronal neuronal नेटवर्क में गतिविधि की रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है है. जब इस प्रक्रिया कर रही यह महत्वपूर्ण है के लिए अत्यधिक ध्यान रखना जब craniotomy प्रदर्शन dura को नुकसान नहीं याद. यहां तक ​​कि अवदृढ़तानिकी रक्तस्राव का एक छोटा सा के साथ राशि काफी अस्पष्ट इमेजिंग.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Oregon Green BAPTA1-AM	Reagent	Invitrogen	O-6807
Fluo 4- AM	Reagent	Invitrogen	F-14201
Sulforhodamine 101	Reagent	Invitrogen	S-359
Pluronic F-127 in DMSO	Reagent	Invitrogen	P-3000MP
Centrifugal Filter (0.45 micron)	Reagent	EMD Millipore	UFC3 0HV 0S