Summary
네크로 텍스의 microcircuits의 네트워크 역학을 이해하기 위해서는 동시에 뉴런의 다수의 활동을 기록하는 것이 필수적입니다. - 생체내에서 두 광자 칼슘 이미징 하나는 단일 셀 해상도 고밀도의 연결 인구의 활동을 기록하는 수있는 유일한 방법입니다.
Abstract
네크로 텍스의 microcircuits의 네트워크 역학을 이해하기 위해서는 동시에 뉴런의 다수의 활동을 기록하는 것이 필수적입니다. - 생체내에서 두 광자 칼슘 이미징 하나는 단일 셀 해상도 고밀도의 연결 인구의 활동을 기록하는 수있는 유일한 방법입니다. 방법은 뉴런의 큰 숫자에 의해 촬영하고 마지막에 - 생체내 두 광자 현미경을 사용하여 시간 저속 칼슘 이미징과 뉴런의 활동을 기록 할 수있는 형광 칼슘 지표 염료를 주입, 두개골 이미지 창을 이온 주입으로 구성되어 있습니다. astrocyte 특정 염료의 공동 주사 하나 astrocytes에서 뉴런을 차별화 할 수 있습니다. 기술은 더 나은 세포의 서로 다른 그룹의 네트워크 상호 작용을 이해하는 뉴런의 특정 subpopulations에 형광 분자를 표현 생쥐에서 수행할 수 있습니다.
Protocol
- 형광 칼슘 지표 솔루션을 준비합니다. 우리는 짧게 염료를 아세 톡시 메틸 에스테르 염료를 사용하거나, AM. 이들은 extracellularly 주입했을 때 세포에 의해 촬영 수있는 염료입니다. 우리는 일반적으로 1 ㎜의 농도에 오레곤 - 그린 BAPTA - 1 AM 또는 AM Fluo - 4를 사용합니다. AM의 염료 50 마이크로 그램의 튜브 안에 Invitrogen에서 얻을 수 있습니다. 우리가 먼저 DMSO에서 Pluronic F - 127의 20 % 솔루션을 준비합니다. 우리는 분명까지 매일 사용하기 전에 솔루션을 따뜻하게. 우리는 칼슘 표시 10 mm의 농도 15-20분에 대한 20 % Pluronic의 F-127/DMSO을 풀다. 150 NaCl, 2.5 KCl, 10 Hepes, 산도 7.4 : 우리는 다음 MM에 포함된 솔루션에서 1mM에 대한 해결책을 희석. 또한, 100 μm의 제품 Sulforhodamine 101은 일반적으로 레이블 astrocytes에 포함되어 있으며 사출 동안 피펫을 시각화. 우리는 0.49 미크론 원심 필터 (..; Garaschuk 외, 2006 Stosiek 외, 2003)로 사전에 주입에 대한 해결책을 필터링합니다.
- 몇 군데로 그 지역에있는 두개의 창문을 이식. 우리는이 목성에있는 일반적인 접근 방식을 설명 하지만, 다음과 같은 수정은 칼슘 염료 주입을 위해 중요합니다 :
기본 두라 손상되지 극단적인 간병, 관심의 피질 영역 직경 2mm의 작은 craniotomy하십시오. craniotomy 이상의 장소에 coverslip을 확보하지만, 일부만 obliquely 피질을 입력 피펫을위한 공간을 허용하도록 craniotomy의 가장자리와 유리 coverslip 사이에 작은 간격을두고, craniotomy을 커버. 이전 주사로, craniotomy 주위에 치과 시멘트와 얕은 우물을합니다. 우물 방향으로 주동이의 확장 및 사출에 대한 micropipette 삽입을 허용하는 정도로 얕은해야합니다. - 현미경의 무대로 전송 마우스를 전송하고 우리와 같이, 머리를 고정 혈액 흐름 이미징에서 비디오 .
- 피펫 풀러를 사용하여 저항에서 2-4 메가 Ohms 저조한 팁 직경에 유리 microelectrode의 pipettes을 당기세요. microsyringe를 사용하여 유리 피펫에 칼슘 표시기 염료 믹스를로드합니다. micromanipulator를 사용하면 부드럽게 다음 잘게 40X 목표 아래에 위치하는 4X 목표를 사용하여 두뇌의 표면에 micropipette를 낮춥니다. 이미지를 보이지 않게하기 위해 거의 또는 전혀 overlying의 혈관이있다는 것을 같은 사출에 적합한 위치를 선택합니다. 두 광자 현미경을 사용하여, 피펫의 끝은 두라 아래 200 micrometers의 깊이, 시각 천천히 피질로 고급이다. 그런 다음, 압력 Picospritzer를 사용하여 1 분 10 PSI에서 염료 혼합물을 주입. 우리는 일반적으로 약 200-300 마이크론의 공간에서 구분된 오전 칼슘 색소 믹스의 2-4 주사를 제공합니다. 약간 중복되는 주사의 대량 로딩 방식은 600 x 600 마이크론 크기로 공간이 충분히 칼슘 이미징을위한 스테인드 것을 보장합니다. 확산과 뉴런에 의해 연결됩니다 염료 수 있도록, 오전 염료 혼합물의 주입 후에 이미지 1 시간 시작합니다.
- - 생체내의 정의와 함께 두 광자 이미징은 카멜레온 티 - 사파이어 레이저 (800-880 nm의로 조정)과 캠브리지 기술 검류계 미러를 사용하여 두 광자 현미경을 만들어 수행합니다. 우리는 카렐 스보보다의 연구실 (Pologruto 외., 2003)에서 개발한 ScanImage 소프트웨어를 사용하여 이미지를 획득. 레이저 전원 잘 샘플 70 MW 아래 일반적이다. 전체 필드 이미지 중 초당 1.95-15.63 프레임 (256 X 64 픽셀 512 X 256 픽셀)에서 20X (NA 0.95) 또는 40X (NA 0.8) 올림푸스 목표를 사용을 찾았습니다. 라인 스캔 500 Hz에서에서 찾았습니다. 이미징 동안 동물은 빛의 isoflurane 마취 (0.6-0.9 %)에서 유지되며, 또한 37 ° C 보관 하버드 장치 온도 제어 장치를 사용하여. 치료는 가능한 한 가까운 100 호흡 / 분에 대해서 동물의 호흡 속도를 유지로 이동합니다. 마취의 사용 수준은 동물을 움직이게 낮은 수준이지만, 여전히 기록하는 자발적인 활동을 허용합니다.
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Discussion
electrophysiological 녹음을 통해이 방법의 장점은 덜 침략하고 밀도의 연결의 연결을 네트워크에 활동의 기록을 허용한다는 것입니다. 이 절차를 수행할 때 그것은 두라을 손상하지 craniotomy를 수행할 때 극단적인 돌봐 기억하는 것이 중요 S. 과 경막하 출혈도 작은 금액은 크게 이미지를 흐릿하게.
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Acknowledgments
우리는 칼슘 지표의 대량 로딩을 최적화에 도움이 토론에 대한 올가 Garaschuk을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Oregon Green BAPTA1-AM | Reagent | Invitrogen | O-6807 | |
| Fluo 4- AM | Reagent | Invitrogen | F-14201 | |
| Sulforhodamine 101 | Reagent | Invitrogen | S-359 | |
| Pluronic F-127 in DMSO | Reagent | Invitrogen | P-3000MP | |
| Centrifugal Filter (0.45 micron) | Reagent | EMD Millipore | UFC3 0HV 0S |
References
- Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo. Nat Protoc. 1, (2006).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In-vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7319-7324 (2003).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online 2:13. Biomed Eng Online. 2, (2003).
