Summary
Для того чтобы понять динамику сети микросхем в коре головного мозга, очень важно одновременно записывать активность большого числа нейронов. В естественных условиях двухфотонного кальция изображений является единственным методом, который позволяет регистрировать активность нейронов плотной населения с одноклеточных разрешения.
Abstract
Для того чтобы понять динамику сети микросхем в коре головного мозга, очень важно одновременно записывать активность большого числа нейронов. В естественных условиях двухфотонного кальция изображений является единственным методом, который позволяет регистрировать активность нейронов плотной населения с одноклеточных разрешения. Метод заключается в имплантации черепных окна изображения, потребители инъекционных флуоресцентного красителя показатель кальция, что может быть подхвачена большим количеством нейронов и, наконец, запись активности нейронов во времени изображений кальция промежуток использования в естественных условиях двухфотонного микроскопа. Сотрудничество инъекции астроцитов конкретных красителями позволяет дифференцировать нейронов из астроцитов. Техника может быть выполнена в мышей, экспрессирующих флуоресцентных молекул в конкретных субпопуляции нейронов, чтобы лучше понять сетевые взаимодействия различных групп клеток.
Protocol
- Подготовка решения флуоресцентных индикаторов кальция. Мы используем ацетоксиметил красителей эфир, или АМ красители для краткости. Эти красители, которые могут быть рассмотрены клетки при введении внеклеточно. Обычно мы используем Орегон-зеленый BAPTA-1 АМ или Fluo-4 утра в концентрации 1 мМ. AM красители могут быть получены из Invitrogen в 50 ампул мкг. Мы сначала подготовить 20% раствора Pluronic F-127 в ДМСО. Мы теплой решение перед применением каждый день, пока его ясно. Мы растворяем кальция показатель 20% Pluronic F-127/DMSO в течение 15-20 минут в концентрации 10 мМ. Затем разбавить раствор до 1 мм в раствор, содержащий, в мм: 150 NaCl, 2,5 KCl, 10 HEPES, рН 7,4. Кроме того, 100 мкМ Sulforhodamine 101 обычно включается для обозначения астроциты и визуализировать пипеткой во время инъекции. Мы фильтр решение перед инъекцией с 0,49 микрон центробежный фильтр (Stosiek и др., 2003;.. Garaschuk и др., 2006).
- Имплантат черепных окна на площадь для включения в образ. Мы описали общий подход в Юпитер , но следующие изменения важны для инъекций кальция красителя:
Сделать меньше краниотомии 2 мм в диаметре более корковые области интересов, с особой осторожностью, чтобы не повредить основной оболочки. Безопасные покровное на месте в течение трепанации черепа, но лишь частично покрывать трепанации черепа, оставляя небольшой зазор между краем трепанации черепа и стекло покровное, чтобы места для пипетки, чтобы войти в коре косо. До инъекции, сделать мелкий и с зубной цемент вокруг трепанации черепа. Также должно распространяться как ростральной по направлению и быть достаточно мелко, позволяющее вставить микропипетки для инъекций. - Передача мыши передаются столик микроскопа и иммобилизации головы, как показано в нашем видео по крови визуализации потока .
- Вытяните пипетки стеклянные микроэлектрода на диаметр кончика уступая 2-4 Мега Ом сопротивления, используя съемник пипетки. Нагрузка красителя кальция индикатор смесь на стеклянную пипетку использованием микрошприца. Использование микроманипулятора, осторожно опустите микропипетки на поверхность мозга с помощью 4X цель, которую затем мелко расположенный под 40X цели. Выберите подходящее место для инъекции, например, что Есть мало или совсем нет вышележащих кровеносные сосуды, чтобы скрыть изображения. С помощью двух-фотонной микроскопии, кончиком пипетки визуализируется и передовые медленно в коре на глубине до 200 мкм ниже оболочки. Потом, давление вводят краситель смеси при 10 PSI в течение 1 минуты использованием Picospritzer. Мы обычно доставить 3:58 инъекций красителя сочетание кальция А.М., разделенных в пространстве примерно на 200-300 микрон. Это массовый подход загрузка слегка перекрывая инъекции гарантирует, что площадь такого размера, как 600 х 600 микрон адекватно окрашенных в кальции изображений. Начните изображений через 1 час после введения красителя AM смеси, чтобы обеспечить красителя распространять и быть рассмотрен нейронов.
- Выполните в естественных условиях двухфотонного изображения с заказ двухфотонного микроскопа использованием Chameleon Ti-сапфирового лазера (настроен на 800-880 нм) и Кембриджа зеркала технологии гальванометра. Мы приобретаем изображения с помощью ScanImage Программное обеспечение, разработанное в лаборатории Карела Свободы (Pologruto и соавт., 2003). Мощность лазера, как правило, значительно ниже 70 мВт на образце. Всего изображения области приобрели либо с помощью 20X (0,95 NA) или 40Х (0,8 NA) Olympus целей, в 1.95-15.63 кадров в секунду (512 х 256 пикселей до 256 х 64 пикселей). Линия сканирования можно получить на 500 Гц. Во время обработки изображений, животные находятся под легкой анестезией изофлуран (0,6-0,9%), а также хранятся при температуре 37 ° С с использованием Температура Гарвардского Аппарат управления устройством. Осторожность, чтобы сохранить частоту дыхания животных как можно ближе к 100 вдохов / мин, как это возможно. Этот уровень анестезии используется самый низкий уровень, который обездвиживает животное, но все же позволяет спонтанной активности для записи.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Преимущество этого метода по сравнению с электрофизиологических записей является то, что она менее инвазивных и позволяет записях деятельности в плотных нейронов нейронной сети. При выполнении этой процедуры важно помнить, принять крайнюю осторожность при выполнении трепанации черепа, чтобы не повредить оболочку. Даже небольшое количество субдуральной кровотечения с очень неясными изображениями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы хотели бы выразить признательность Ольга Garaschuk за полезные обсуждения по оптимизации массовой загрузки кальция показателей.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Oregon Green BAPTA1-AM | Reagent | Invitrogen | O-6807 | |
| Fluo 4- AM | Reagent | Invitrogen | F-14201 | |
| Sulforhodamine 101 | Reagent | Invitrogen | S-359 | |
| Pluronic F-127 in DMSO | Reagent | Invitrogen | P-3000MP | |
| Centrifugal Filter (0.45 micron) | Reagent | EMD Millipore | UFC3 0HV 0S |
References
- Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo. Nat Protoc. 1, (2006).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In-vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7319-7324 (2003).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online 2:13. Biomed Eng Online. 2, (2003).
