Summary
Para comprender la dinámica de la red de microcircuitos de la neocorteza, que es esencial para grabar simultáneamente la actividad de un gran número de neuronas. En vivo de dos fotones de imágenes de calcio es el único método que permite grabar la actividad de una densa población neuronal con una sola célula de resolución.
Abstract
Para comprender la dinámica de la red de microcircuitos de la neocorteza, que es esencial para grabar simultáneamente la actividad de un gran número de neuronas. En vivo de dos fotones de imágenes de calcio es el único método que permite grabar la actividad de una densa población neuronal con una sola célula de resolución. El método consiste en la implantación de una ventana de imagen del cráneo, se inyecta una solución de calcio indicador fluorescente que puede ser ocupado por un gran número de neuronas y, por último registro de la actividad de las neuronas con las imágenes de calcio lapso de tiempo con una in-vivo dos microscopio de fotones. Co-inyección de astrocito específicos colorantes permite diferenciar las neuronas de los astrocitos. La técnica puede llevarse a cabo en ratones que expresan moléculas fluorescentes en subpoblaciones específicas de neuronas para entender mejor las interacciones en la red de los diferentes grupos de células.
Protocol
- Prepare la solución de calcio indicador fluorescente. Usamos tintes acetoximetil éster, o AM tintes para el cortocircuito. Estos son los tintes que pueden ser absorbidos por las células cuando se inyecta extracelular. Por lo general el uso de Oregon-Green BAPTA-1 AM o Fluo-4 AM a una concentración de 1 mM. Colorantes AM se puede obtener de Invitrogen en viales de 50 microgramos. En primer lugar, preparar una solución al 20% de Pluronic F-127 en DMSO. Calentamos la solución antes de usar todos los días hasta su claro. Disolvemos el indicador de calcio F-127/DMSO Pluronic 20% durante 15-20 minutos a una concentración de 10 mM. A continuación, se diluye la solución a 1 mM en una solución que contiene, en mm: 150 NaCl, 2,5 KCl, 10 HEPES, pH 7,4. Además, el 100 sulforodamina M 101 es por lo general incluyen a los astrocitos etiqueta y visualizar la pipeta durante la inyección. Vamos a filtrar la solución antes de la inyección con un filtro de 0,49 micras centrífuga (Stosiek et al, 2003;.. Garaschuk et al, 2006).
- Implantar una ventana craneal en el área a explorar. Hemos descrito el enfoque general en JoVe , pero las siguientes modificaciones son importantes para la inyección de calcio tinte:
Hacer una craneotomía menor de 2 mm de diámetro sobre el área cortical de interés, teniendo cuidado de no dañar la base dura. Asegurar un cubreobjetos en su lugar sobre la craneotomía, sino únicamente una parte de la craneotomía, dejando un pequeño espacio entre el borde de la craneotomía y el cubreobjetos para dejar espacio para una pipeta para entrar en la corteza oblicuamente. Antes de la inyección, hacer un pozo poco profundo con cemento dental alrededor de la craneotomía. El pozo debe extenderse en dirección rostral y ser lo suficientemente poco profundo para permitir la inserción de la micropipeta para inyección. - Transferir el ratón transferidos a la platina del microscopio e inmovilizar la cabeza, como se muestra en la imagen de vídeo en el flujo sanguíneo .
- Tire de pipetas de vidrio de microelectrodos a un diámetro de la punta produciendo 4.2 Mega ohmios de la resistencia, usando un extractor de la pipeta. Cargar el indicador de calcio mezcla tinta en los pipeta de vidrio con una microjeringa. El uso de un micromanipulador, baje suavemente la micropipeta en la superficie del cerebro utilizando un objetivo de 4X, que luego es finamente colocados bajo un objetivo de 40X. Seleccione una ubicación adecuada para la inyección, de modo que hay que recubre los vasos pocas o ninguna sangre para ocultar la imagen. Utilizando microscopía de dos fotones, la punta de la pipeta se visualiza y avanzaba lentamente en la corteza, a una profundidad de 200 micrómetros por debajo de la duramadre. Entonces, la presión se inyecta la mezcla de tinte a 10 psi por 1 minuto con un Picospritzer. Por lo general, la entrega de dos a cuatro inyecciones de la mezcla de tinte AM calcio, separados en el espacio de aproximadamente 200 a 300 micrones. Este enfoque de carga a granel de las inyecciones de un poco por encima se asegura de que un área tan grande como 600 x 600 micrones es adecuada para el teñido de imágenes de calcio. Comenzará a marcar una hora después de la inyección de la mezcla de tinte AM, para permitir el tinte para difundir y ser tomado por las neuronas.
- Realizar en vivo de dos fotones de imágenes con un microscopio por encargo de dos fotones usando un camaleón Ti-zafiro láser (en sintonía con 800-880 nm) y Cambridge Technology espejos galvanómetro. Adquirimos las imágenes utilizando el software scanimage desarrollado en el laboratorio de Karel Svoboda (Pologruto et al., 2003). Potencia del láser es normalmente muy por debajo de 70 mW en la muestra. Imágenes de todo el campo se adquieren mediante un 20X (0,95 NA) o 40x (0,8 NA) los objetivos de Olympus, a 1,95 a 15,63 fotogramas por segundo (512 x 256 píxeles a 256 x 64 píxeles). Líneas de barrido se adquieren a 500 Hz. Durante estas pruebas, los animales se mantienen bajo ligera anestesia con isoflurano (0.6-0.9%), y también se mantienen a 37 ° C usando un aparato de Harvard temperatura del dispositivo de control. Hay que tener cuidado para mantener el ritmo respiratorio de los animales, cerca de 100 respiraciones / minuto posible. Este nivel de uso de anestesia es el nivel más bajo que inmoviliza al animal, pero sigue permitiendo la actividad espontánea que se grabará.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La ventaja de este método sobre los registros electrofisiológicos es que es menos invasiva y permite que las grabaciones de la actividad en las densas redes neuronales neuronal. Al hacer este procedimiento s importante recordar que tener sumo cuidado al realizar la craneotomía para no dañar la duramadre. Incluso una pequeña cantidad de sangrado subdural con mucho oscurecer la imagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Queremos agradecer a Olga Garaschuk útil para los debates sobre la optimización de la carga masiva de los indicadores de calcio.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Oregon Green BAPTA1-AM | Reagent | Invitrogen | O-6807 | |
| Fluo 4- AM | Reagent | Invitrogen | F-14201 | |
| Sulforhodamine 101 | Reagent | Invitrogen | S-359 | |
| Pluronic F-127 in DMSO | Reagent | Invitrogen | P-3000MP | |
| Centrifugal Filter (0.45 micron) | Reagent | EMD Millipore | UFC3 0HV 0S |
References
- Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo. Nat Protoc. 1, (2006).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In-vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7319-7324 (2003).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online 2:13. Biomed Eng Online. 2, (2003).
