Summary
להערכת טיפולים בתאי גזע חדש חשוב הלא פולשני המסלול התאים מוזרקים in vivo. סרט הווידאו הזה יראה לכם כיצד לתייג אדם בתאי גזע mesenchymal ו עובריים עם סוכני תחמוצת ברזל מבוסס בניגוד in vivo עבור הבאים MR הדמיה in vivo.
Abstract
בשנים האחרונות, מחקר בתאי גזע הוביל להבנה טובה יותר של הביולוגיה ההתפתחותית, מחלות שונות וההשפעה הפוטנציאלית על רפואה רגנרטיבית. שיטה לא פולשנית כדי לפקח על בתאי גזע המושתלים שוב ושוב in vivo היה מאוד לשפר את היכולת שלנו להבין את מנגנוני הבקרה תא גזע מוות לזהות גורמים trophic ועל מסלולי איתות כי לשפר תא גזע engraftment. MR הדמיה הוכח להיות כלי יעיל עבור בתיאור vivo בתאי גזע עם רזולוציה ליד אנטומי מיקרוסקופיים. על מנת לזהות בתאי גזע עם MR, התאים צריכים להיות מתויג עם תא ספציפי סוכנים בניגוד MR. לענין זה, חלקיקים תחמוצת ברזל, כגון ברזל פאראמגנטי חלקיקי תחמוצת (SPIO), מוחלים, בגלל רגישות גבוהה שלהם לאיתור התא biocompatibility מעולה שלהם. SPIO חלקיקים מורכבים הליבה תחמוצת ברזל ומעיל dextran, carboxydextran או עמילן, ותפקוד על ידי יצירת שדה inhomogeneities המקומי, הגורמות אות ירד ב T2 משוקלל תמונות MR. מצגת זו תדגים טכניקות תיוג בתאי גזע עם החלים קלינית סוכני MR בניגוד עבור שלאחר מכן לא פולשנית של מעקב vivo של תאים שכותרתו עם MR הדמיה.
Protocol
תיוג של hMSC עם Ferucarbotran
זוהי טכניקה תיוג אדם בתאי גזע mesenchymal עם Ferucarbotran, תחמוצת ברזל סוכן מבוסס בניגוד עבור MR הדמיה:
- כדי להתחיל, צלחת התאים 18-24 שעות לפני ההליך תיוג ב T75 צלוחיות בנקודת המפגש של 80%. אם אתה משתמש צלחת תרבות שונה, זה שווה כ - 10,000 תאים לכל 2 ס"מ.
- למחרת, להתחיל עם הכנת התקשורת תיוג על ידי הוספת 30 μl של Resovist עד 8 מ"ל של התקשורת החופשית בסרום. זה בתווית הבקבוק T75 80% confluency, המתאים בריכוז של מדיה 100 Fe / מ"ל מיקרוגרם.
- תוריד את המדיה תרבות לשטוף את התאים פעם עם PBS או סרום ללא התקשורת. הדבר נעשה כדי להיפטר חלבונים בסרום שיורית ומרכיבים אחרים של התקשורת שיכול לקשור את חומר ניגוד וסימון יעילות להשפיע.
- מוסיפים את התקשורת תיוג כדי הבקבוק והחזיר את הבקבוק בחממה.
- לאחר 2 שעות, להוסיף 2ml של FCS כך ריכוז סופי של FCS 20% מושגת. הדבר נעשה על מנת להבטיח כי התאים אינם מקבלים גירוי להבדיל, אך במקום לגדול בסביבה המוכרת שלהם.
- דגירה התאים על פני 18 שעות. זה נעשה הכי טוב הלילה.
- למחרת, לשטוף את התאים עם PBS, אז trypsinize אותם כרגיל.
- Trypsinized פעם, על השעיית התא צריך להיות שטף 3 פעמים כדי להיפטר סוכן, שיורית בניגוד חינם בתקשורת. זה נעשה עם PBS centrifuging התאים ב RCF 400 במשך 5 דקות.
- התא גלולה הסופי ניתן resuspended ומוכן ניסויים נוספים.
- ספירת התאים עכשיו, כמה שאולי אבדו במהלך השלבים כביסה הקודם. כמו כן, לבצע בדיקות כדאיות בשלב זה באמצעות assay Trypan הדרה כחול לקחת כמה דוגמאות לניתוח spectrometric כדי למדוד את יעילות תיוג.
תיוג של בתאי גזע עובריים אנושיים עם Ferumoxides
- כדי להתחיל, הצלחת hESC בצלחות 10 ס"מ, כרגיל. מאכלים אלה מראש מצופה ג'לטין יש תאים מזין מוקרן עליהם. ניתן להשתמש בפרוטוקול עבור מזין ללא התרבויות.
- בואו hESC לצרף ולגדול כ 3-4 ימים, כך הם יוצרים מושבות בגודל בינוני. במהלך תקופה זו, להבטיח כי המושבות אינם גדלים גדולים, כמו במושבות גדולות יותר קשה לשבור מאוחר יותר.
- תאים רמות יכול לזהם אלה תרבויות, כך בהתאם ניקיון של המושבות, ייתכן שיהיה עליך להיפטר תרבויות מובחן על ידי לנתיחה.
- הכן את התקשורת תיוג שמורכבת Ferumoxides בריכוז של התקשורת hESC 100μg/ml ומלא. לשם כך, אנו לערבב 89μl Ferumoxides ו 10 מ"ל של התקשורת צמיחה מלאה.
- לשטוף את צלחת אחת עם התקשורת מלאה.
- הוסף 10 מ"ל של תיוג מדיה לכל צלחת ו דגירה התאים במשך 4 שעות.
- עכשיו, תיוג תושלם. בשלב הבא, יש לשטוף את התאים לקבל השעיה תא יחיד לשימוש נוסף. לשם כך, ראשית יש לשטוף את המנה עם PBS.
- לאחר מכן, להחליף את PBS עם 5 מ"ל של טריפסין 0.25% ו דגירה בחממה במשך 5 דקות, או עד התאים לנתק. זה עוזר לנצל את המנה לעתים קרובות.
- התאים יש מנותקת עכשיו. זכור כי אם המנה הכילה מושבות גדולות יותר ייתכן שיש כמה גושים שמאל.
- כדי להיפטר גושים אלה, אפשר לערבב את ההשעיה כל פעם בעזרת פיפטה סרולוגיות, אז תן לו לשבת עוד 2 דקות.
- אנחנו לא משתמשים פיפטה Eppendorf, מוצץ חזר כמו של התאים דרך קצה דק יכול לשבור את קרום התא.
- אם גושים שיורית נוכחים, ניתן להריץ את ההשעיה התא דרך מסננת תא 40μm.
- אם הכל עובד כראוי, השעיה תא בודד עכשיו קיים כי הוא מעורב עם הרבה פסולת, שמקורם ציפוי ג'לטין, ESC-matrix תאים מתים. כדי להיפטר זה, לשטוף את התאים פעמיים ספינינג אותם למטה אל RCF 400 במשך 5 דקות ו resuspend אותם בתקשורת מלא.
- עכשיו, ESC צריך להיות מבודד מתאי מזין מוקרן. ניתן לעשות זאת ביעילות על ידי ציפוי ההשעיה תא ג'לטין על צלחת מצופה.
- אם המנה לא מניפולציה, כל התאים יהיו משקעים כלפי מטה, אלא ניזונים יהיה לצרף מהר יותר ESC.
- לכן, אם supernatant הוא המריא אחרי 45 דקות, הוא אמור להכיל בעיקר ESC, בעוד ניזונים בעיקר צריכים להיות מחוברים המנה.
- בדרך זו, השעיה תא בודד של תאים אנושיים שכותרתו מגנטית גזע עובריים שיכולים לשמש עבור ניסויים נוספים מתקבל.
- כמו בפרוטוקול הקודם, בשלב זה, אתה צריך לספור את התאים לקחת דגימות להערכת הכדאיות ומדידה של יעילות תיוג.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תיאור פולשני בתאי גזע חיוני לניטור כמעט כל תא גזע טיפול מבוסס. הבנה טובה יותר של קינטיקה ב vivo בתאי גזע שכותרתו, כמו דמיינו על תמונות MR, יכול להוביל את הדרך רציונלי ושימוש יעיל יותר של תא טיפולים מבוססי גזע. מאז אנו משתמשים סוכנים בניגוד החלים קלינית שיטות הדמיה, פרוטוקולים שהוצגו שלנו צריכה להיות לתרגום בקלות יישומים בחולים. יישומים קליניים אפשריים של השיטות שלנו כוללות חקירות השוואתי של תהליך engraftment שונים של תאים תת גזע או בתאי גזע מהונדסים גנטית, כמו גם, את ההערכה של השפעות הטיפול על תוצאות engraftment בתאי גזע. תוצאות צריך להיות מועיל מיד בהערכות קליני של טיפולים מבוססי גזע, בתכנון של ניסויים קליניים הקשורים, ומאוחר יותר, בהערכת אלה תא טיפולים מבוססי גזע בפרקטיקה הקלינית. ראוי לציין, טכניקת דימות שלנו הוא גם החלים על אוכלוסיות אחרות תא גזע, כגון בתאי גזע hematopoietic או בתאי גזע עצביים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
פרויקט זה מומן על ידי מענק ג'יי טל! SEED ליאון ממכון קליפורניה עבור רפואה רגנרטיבית. טוביאס הנינג המחקר מומן על ידי מענק מן האגודה הגרמנית למחקר (DFG, HE 4578/1-2). אנחנו רוצים להכיר תודה Meneses חואניטו את עצתו על תרבות בתאי גזע עובריים אנושיים.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Gelatin | Reagent | Sigma-Aldrich | G1890 | dilute Gelatin in PBS to final concentration of 0.1 % |
| PBS (Ca++ Mg++ freed) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Reagent | Invitrogen | 25300-120 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Reagent | Invitrogen | 25200-114 | |
| FBS characterized | Reagent | Hyclone | SH30071.03 | |
| Cell Strainer (40 μm Nylon) | Tool | BD Biosciences | 352340 | |
| Knockout DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacer | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828028 | |
| b-Mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | 7522 | |
| non-essential amino acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | |
| FGF-2 | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Ferumoxides (Endorem) | Reagent | Guerbet | ||
| Ferucarbotran (Resovist®) | Reagent | Bayer AG |
References
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Oostendorp, R. A. J., Settles, M., Piontek, G., Metz, S., Heinzmann, U., Rummeny, E. J., Schlegel, J., Link, T. M. Targeting of Hematopoietic Progenitor Cells with MR Contrast Agents. 228, 760-767 (2003).
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Piontek, G., Metz, S., Brauer, R., Debus, G., Corot, C., Schlegel, J., Link, T. M., Peschel, C., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. Migration of iron oxide labeled human hematopoietic progenitor cells in a xenotransplant model: in vivo monitoring using clinical magnetic resonance imaging equipment. Radiology. 234, 197-205 (2005).
- Henning, T. D., Saborowski, O., Golovko, D., Boddington, S., Bauer, J. S., Fu, Y., Meier, R., Pietsch, H., Sennino, B., McDonald, D. M., Daldrup-Link, H. E. Cell labeling with the positive MR contrast agent. Gadofluorine M. Eur Radiol. 17, 1226-1234 (2007).
