Etichettatura hESC e hMSCs con nanoparticelle di ossido di ferro per i non-invasiva in vivo inseguimento con la RM

Summary

Per la valutazione delle terapie con cellule staminali nuovo, è importante non invasiva traccia le cellule iniettate in vivo. Questo video vi mostrerà come etichetta cellule staminali mesenchimali ed embrionali con il ferro mezzi di contrasto a base di ossidi in vivo per la successiva RM in vivo.

Abstract

Negli ultimi anni la ricerca sulle cellule staminali ha portato ad una migliore comprensione della biologia dello sviluppo, malattie varie e il suo potenziale impatto sulla medicina rigenerativa. Un metodo non invasivo per monitorare le cellule staminali trapiantate in vivo avrebbe ripetutamente di migliorare notevolmente la nostra capacità di comprendere i meccanismi che la morte di controllo delle cellule staminali e di identificare fattori trofici e di vie di segnalazione che consentono di migliorare l'attecchimento delle cellule staminali. RM ha dimostrato di essere uno strumento efficace per la rappresentazione in vivo di cellule staminali con vicino risoluzione anatomica microscopica. Al fine di individuare le cellule staminali con MR, le cellule devono essere etichettati con cellulari specifici mezzi di contrasto MR. A tal fine, le nanoparticelle di ossido di ferro, come le particelle di ossido di ferro superparamagnetiche (SPIO), vengono applicate, a causa della loro elevata sensibilità per il rilevamento delle cellule e la loro eccellente biocompatibilità. SPIO particelle sono composte da un nucleo di ossido di ferro e un cappotto destrano, carboxydextran o amido, e la funzione creando disomogeneità campo locale, che causano una diminuzione del segnale sulle immagini T2 MR. Questa presentazione dimostrerà le tecniche per l'etichettatura di cellule staminali clinicamente applicabile con mezzi di contrasto RM per la successiva non invasive nel monitoraggio in vivo delle cellule etichettate con la RM.

Protocol

L'etichettatura di hMSC con Ferucarbotran

Questa è la tecnica per l'etichettatura di cellule staminali mesenchimali con Ferucarbotran, un ossido di ferro agente di contrasto per RM:

1. Per iniziare, piastra delle cellule 18-24 ore prima della procedura di etichettatura T75 fiaschi ad una confluenza del 80%. Se si utilizza un piatto diversa cultura, questa è pari a circa 10000 cellule per cm ^2.
2. Il giorno dopo, iniziare con la preparazione dei mezzi di etichettatura con l'aggiunta di 30 ml di Resovist a 8 ml di siero libertà dei media. Questo etichetta uno T75 pallone in 80% confluenza, corrispondente a una concentrazione di 100 mg Fe / ml media.
3. Togliere il mezzo di coltura e lavare le cellule una volta con PBS o senza siero dei media. Questo viene fatto per sbarazzarsi di residui di proteine ​​del siero ed altri costituenti dei media che possono legare il mezzo di contrasto e di etichettatura di efficienza influenza.
4. Aggiungi ai media di etichettatura per il pallone e rimettere il pallone in incubatrice.
5. Dopo 2 ore, aggiungere 2 ml di FCS modo che la concentrazione finale del 20% FCS è raggiunto. Questo viene fatto per garantire che le cellule non ricevono lo stimolo a differenziare, ma invece crescere nel loro ambiente familiare.
6. Incubare le cellule oltre 18 ore. Questo è fatto meglio durante la notte.
7. Il giorno dopo, lavare le cellule con PBS, poi trypsinize come al solito.
8. Una volta trypsinized, la sospensione cellulare ha bisogno di essere lavati 3 volte per sbarazzarsi di residui, senza mezzo di contrasto nei media. Questo viene fatto con PBS centrifugando le cellule a 400 rcf per 5 minuti.
9. La finale pellet cellulare può essere risospeso ed è pronto per ulteriori esperimenti.
10. Contare le celle ora, come qualcuno potrebbe essere stato perso durante i passaggi precedenti lavaggio. Inoltre, eseguire test di vitalità a questo punto, utilizzando il test Trypan esclusione blu e prendere alcuni campioni per analisi di spettrometria per misurare l'efficienza di etichettatura.

Etichettatura delle cellule staminali embrionali umane con Ferumoxides

1. Per iniziare la targhetta del hESC nei piatti 10cm, come al solito. Questi piatti sono pre-rivestiti con gelatina e sono cellule alimentatore irradiato su di loro. È possibile utilizzare questo protocollo per l'alimentazione priva di culture pure.
2. Lasciate che i hESC attaccare e crescere per circa 3-4 giorni in modo da formare colonie di medie dimensioni. Durante questo tempo, in modo che le colonie non crescono alla grande, come le colonie più grandi sono più difficili da rompere più tardi.
3. Cellule differenziate possono contaminare queste culture, per cui a seconda della pulizia delle colonie, potrebbe essere necessario sbarazzarsi di culture differenziate da dissezione.
4. Preparare il supporto di etichettatura che consiste Ferumoxides ad una concentrazione di mezzi hESC 100μg/ml e pieno. Per questo, abbiamo mix 89μl Ferumoxides e 10 ml di media piena crescita.
5. Lavare il piatto una volta con i media completa.
6. Aggiungere 10 ml di etichettatura dei media per ogni piatto e incubare le cellule per 4 ore.
7. Ora, l'etichettatura è completa. Nel passo successivo, è necessario lavare le cellule e ottenere una sospensione singola cella per un ulteriore uso. Per questo, prima lavare il piatto con PBS.
8. Poi, sostituire la PBS con 5 ml di tripsina 0,25% e incubare nell'incubatore per 5 minuti, o fino a quando le cellule staccare. Aiuta a toccare il piatto di frequente.
9. Le cellule sono ormai staccati. Tenete presente che se il piatto conteneva le colonie più grandi ci potrebbero essere alcuni cespugli di sinistra.
10. Per sbarazzarsi di questi grumi, si può miscelare la sospensione intero una volta con una pipetta sierologica, poi lasciate riposare per altri 2 minuti.
11. Noi non usare una pipetta Eppendorf, succhiando come ripetuto delle cellule attraverso la punta sottile può rompere le membrane cellulari.
12. Se si osservano residui sono presenti, si può eseguire la sospensione cellulare attraverso un colino cellula 40μm.
13. Se tutto ha funzionato correttamente, una sospensione singola cellula esiste, ora che è mescolato con un sacco di detriti, provenienti dal rivestimento in gelatina, il CES-matrice e cellule morte. Per sbarazzarsi di questo, lavare le cellule due volte facendo girare giù a 400 rcf per 5 minuti e risospendere in mezzi di comunicazione completo.
14. Ora, il Comitato deve essere isolato dalle cellule alimentatore irradiati. Questo può essere fatto in modo efficiente dal placcatura la sospensione cellulare su un piatto rivestito di gelatina.
15. Se il piatto non è manipolato, tutte le cellule si sedimenta giù, ma gli alimentatori che attribuirà più veloce del CES.
16. Quindi, se il surnatante viene tolto dopo 45 minuti, dovrebbe contenere principalmente ESC, mentre gli alimentatori dovrebbe principalmente essere allegata al piatto.
17. In questo modo, una sospensione singola cella di magneticamente etichettato cellule staminali embrionali umane che possono essere utilizzati per ulteriori esperimenti si ottiene.
18. Come nel precedente protocollo, a questo punto, è necessario contare le cellule e prelevare campioni per valutazione della vitalità economica e la misurazione di efficienza etichettatura.

Discussion

Un non-invasiva rappresentazione delle cellule staminali è fondamentale per il monitoraggio praticamente qualsiasi terapia a base di cellule staminali. Una migliore comprensione della cinetica in vivo delle cellule staminali etichettati, come visualizzato nelle immagini MR, potrebbe aprire la strada ad un razionale e un uso più efficace delle cellule staminali a base di terapie. Dal momento che usiamo mezzi di contrasto clinicamente applicabile e tecniche di imaging, i nostri protocolli presentati devono essere facilmente traducibili in applicazioni nei pazienti. Potenziali applicazioni cliniche dei nostri metodi includono indagini comparative del processo di attecchimento dei sottotipi diversi di cellule staminali o cellule staminali geneticamente modificate, così come, la valutazione degli effetti della terapia sui risultati di attecchimento delle cellule staminali. I risultati devono essere immediatamente utile nella valutazione preclinica di terapie a base di staminali, nella progettazione dei relativi studi clinici, e più tardi, nella valutazione di tali terapie basate sulle cellule staminali nella pratica clinica. Da notare che la nostra tecnica di imaging è applicabile anche ad altre popolazioni di cellule staminali, come le cellule staminali ematopoietiche o cellule staminali neuronali.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
D-MEM High Glucose	Reagent	Sigma-Aldrich	D5648
Gelatin	Reagent	Sigma-Aldrich	G1890	dilute Gelatin in PBS to final concentration of 0.1 %
PBS (Ca++ Mg++ freed)	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14190-144
Trypsin-EDTA 0.05%	Reagent	Invitrogen	25300-120
Trypsin-EDTA 0.25%	Reagent	Invitrogen	25200-114
FBS characterized	Reagent	Hyclone	SH30071.03
Cell Strainer (40 μm Nylon)	Tool	BD Biosciences	352340
Knockout DMEM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10829018
Knockout Serum Replacer	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10828028
b-Mercapt–thanol	Reagent	Sigma-Aldrich	7522
non-essential amino acids	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11140050
FGF-2	Reagent	R&D Systems	233-FB-025
Glutamine	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25030081
Penicillin/Streptomycin	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Ferumoxides (Endorem)	Reagent	Guerbet
Ferucarbotran (Resovist®)	Reagent	Bayer AG