Summary
Para la evaluación de nuevas terapias con células madre es importante no invasiva vía las células inyectadas en vivo. Este video le mostrará cómo etiquetar células madre mesenquimales humanas embrionarias y con los agentes de contraste basados en óxido de hierro en vivo para su posterior RM en vivo.
Abstract
En los últimos años, la investigación con células madre ha dado lugar a una mejor comprensión de la biología del desarrollo, diversas enfermedades y su impacto potencial en medicina regenerativa. Un método no invasivo para monitorizar las células madre trasplantadas en varias ocasiones en vivo aumentaría en gran medida nuestra capacidad para comprender los mecanismos que controlan la muerte celular del tallo e identificar los factores tróficos y las vías de señalización que mejoren el injerto de células madre. RM ha demostrado ser una herramienta eficaz para la representación en vivo de las células madre con una resolución de cerca de anatomía microscópica. Con el fin de detectar las células madre con retraso mental, las células tienen que estar etiquetados con células específicas de los agentes de contraste RM. Para ello, las nanopartículas de óxido de hierro, como las partículas de óxido de hierro superparamagnético (SPIO), se aplican, debido a su alta sensibilidad para la detección de células y su excelente biocompatibilidad. SPIO partículas están compuestas de un núcleo de óxido de hierro y una capa de dextrano, carboxidextrano o almidón, y la función mediante la creación de heterogeneidades locales de campo, que causan una disminución de la señal en imágenes potenciadas en T2 MR. En esta presentación se muestran las técnicas para el etiquetado de las células madre con agentes de contraste para RM aplicación clínica posterior no invasivo en el seguimiento in vivo de las células marcadas con la RM.
Protocol
Etiquetado de hMSC con Ferucarbotran
Esta es la técnica para el etiquetado de las células madre mesenquimales con Ferucarbotran, un agente de contraste basados en óxido de hierro de la RM:
- Para empezar, la placa de las células de 18-24 horas antes del procedimiento de etiquetado en frascos T75 en una confluencia del 80%. Si utiliza una placa de cultivo diferentes, esto es igual a cerca de 10.000 células por cm 2.
- Al día siguiente, comenzar con la preparación de los medios de comunicación etiquetado mediante la adición de 30 l de Resovist a 8 ml de medio libre de suero. Esto marca un frasco T75 el 80% de confluencia, que corresponde a una concentración de 100 mg Fe / ml de los medios.
- Quítese los medios de cultivo y se lavan las células una vez con PBS o medio libre de suero. Esto se hace para deshacerse de las proteínas del suero residual y otros componentes de los medios de comunicación que podría obligar a la agente de contraste y etiquetado de eficiencia influencia.
- Añadir los medios de comunicación de etiquetado para el frasco y colocar el frasco de nuevo en la incubadora.
- Después de 2 horas, añadir 2 ml de FCS para que una concentración final de 20% de FCS se logra. Esto se hace para asegurar que las células no reciben el estímulo para diferenciar, sino que crecen en su entorno familiar.
- Se incuban las células durante 18 horas. Esto se hace mejor durante la noche.
- Al día siguiente, lavar las células con PBS, y luego trypsinize como de costumbre.
- Una vez trypsinized, la suspensión de células necesita ser lavado tres veces para deshacerse del agente residual, cambio libre en los medios de comunicación. Esto se hace con PBS las células centrifugando a 400 rcf durante 5 minutos.
- La final precipitado de células pueden ser resuspendidas y está listo para nuevos experimentos.
- Contar ahora las células, como algunos se han perdido durante los pasos previos de lavado. Además, realizar pruebas de viabilidad en este momento utilizando el ensayo de exclusión del azul tripano y tomar algunas muestras para el análisis de espectrometría de medir la eficacia de etiquetado.
Etiquetado de células madre embrionarias humanas con Ferumoxides
- Para empezar, la placa de la células madre en los platos de 10 cm, como de costumbre. Estos platos se cubren con gelatina y tienen células irradiadas de alimentación en ellos. Usted puede usar este protocolo para la alimentación libre de culturas.
- Deje que la células madre se adhieren y crecen por día aproximadamente 3-4 para que formen colonias de tamaño mediano. Durante este tiempo, asegúrese de que las colonias no crecen a grandes, como las colonias grandes son más difíciles de romper más tarde.
- Células diferenciadas pueden contaminar los cultivos, por lo que dependiendo de la limpieza de las colonias, es posible que tenga que deshacerse de las culturas diferenciadas por la disección.
- Prepare los medios de comunicación que consiste en el etiquetado de Ferumoxides a una concentración de los medios de comunicación células madre 100μg/ml y completa. Para ello, se mezcla 89μl Ferumoxides y 10 ml de medio de cultivo completo.
- Lavar el plato una vez con los medios de comunicación completa.
- Añadir 10 ml de etiquetado de medios por placa e incubar las células durante 4 horas.
- Ahora, el etiquetado es completo. En el siguiente paso, es necesario lavar las células y obtener una suspensión de células individuales para su uso posterior. Para ello, primero enjuague el recipiente con PBS.
- A continuación, reemplace el PBS con 5 ml de tripsina 0,25% y se incuban en la incubadora durante 5 minutos, o hasta que separar las células. Esto ayuda a aprovechar el plato con frecuencia.
- Las células han separado. Tenga en cuenta que si el plato contenía grandes colonias que podría haber algunos grupos a la izquierda.
- Para deshacerse de estos grupos, se puede mezclar la suspensión toda vez que con una pipeta serológica, luego dejar reposar por 2 minutos.
- No usar una pipeta Eppendorf, chupando como repetida de las células a través de la punta delgada puede romper las membranas celulares.
- Si matas residual están presentes, se puede ejecutar la suspensión de células a través de un filtro de 40μm celular.
- Si todo ha funcionado correctamente, una suspensión de células individuales ahora existe, que se mezcla con un montón de escombros, procedentes de la capa de gelatina, el CES-matriz y las células muertas. Para deshacerse de este, se lavan las células dos veces al girar hacia abajo a 400 rcf durante 5 minutos y volver a suspender en los medios de comunicación completa.
- Ahora, el CES tiene que ser aislado de las células irradiadas de alimentación. Esto se puede hacer de manera eficiente por la chapa de la suspensión de células en un plato recubiertas de gelatina.
- Si el plato no se manipula, todas las células se sedimentos hacia abajo, pero los alimentadores se conectará más rápido que la ESC.
- Por lo tanto, si el sobrenadante se retira después de 45 minutos, que debe contener todo ESC, mientras que los alimentadores de todo debe atribuirse a la antena.
- De esta manera, una suspensión de células individuales de marcadas magnéticamente las células madre de embriones humanos que se pueden utilizar para más experimentos se obtiene.
- Al igual que en el protocolo anterior, en este punto, es necesario contar con las células y tomar muestras para la evaluación de la viabilidad y la medición de la eficacia de etiquetado.
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Discussion
Una representación no invasiva de las células madre es crucial para el seguimiento prácticamente cualquier terapia con células madre basado. Una mejor comprensión de la cinética en vivo de las células madre etiquetado, tal como puede verse en las imágenes de RM, podría abrir el camino a un racional y un uso más eficaz de células madre basado en las terapias. Desde que usamos los agentes de contraste aplicación clínica y las técnicas de imagen, los protocolos presentados deben ser fácilmente traducibles a las aplicaciones en los pacientes. Las aplicaciones clínicas potenciales de nuestros métodos incluyen las investigaciones comparativas del proceso de asentamiento de las diferentes subtipos de células madre o la ingeniería genética las células madre, así como, la evaluación de los efectos de la terapia sobre el resultado del injerto de células madre. Los resultados deben ser inmediatamente útil en la evaluación preclínica de la madre de las terapias basadas en el diseño de ensayos clínicos relacionados, y más tarde, en la evaluación de las madres terapias celulares en la práctica clínica. Es de destacar que nuestra técnica de imagen también es aplicable a otras poblaciones de células madre, como las células madre hematopoyéticas o células madre neuronales.
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Acknowledgments
Este proyecto fue financiado por una subvención Leon J. SEMILLA Thal del Instituto de Medicina Regenerativa de California. Tobias Henning fue financiado por una beca de investigación de la Asociación Alemana de Investigación (DFG, el Excmo 4578/1-2). Queremos reconocer y agradecer Meneses Juanito por sus consejos sobre la cultura de células madre embrionarias humanas.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| D-MEM High Glucose | Reagent | Sigma-Aldrich | D5648 | |
| Gelatin | Reagent | Sigma-Aldrich | G1890 | dilute Gelatin in PBS to final concentration of 0.1 % |
| PBS (Ca++ Mg++ freed) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Reagent | Invitrogen | 25300-120 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Reagent | Invitrogen | 25200-114 | |
| FBS characterized | Reagent | Hyclone | SH30071.03 | |
| Cell Strainer (40 μm Nylon) | Tool | BD Biosciences | 352340 | |
| Knockout DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacer | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828028 | |
| b-Mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | 7522 | |
| non-essential amino acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140050 | |
| FGF-2 | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Ferumoxides (Endorem) | Reagent | Guerbet | ||
| Ferucarbotran (Resovist®) | Reagent | Bayer AG |
References
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Oostendorp, R. A. J., Settles, M., Piontek, G., Metz, S., Heinzmann, U., Rummeny, E. J., Schlegel, J., Link, T. M. Targeting of Hematopoietic Progenitor Cells with MR Contrast Agents. 228, 760-767 (2003).
- Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Piontek, G., Metz, S., Brauer, R., Debus, G., Corot, C., Schlegel, J., Link, T. M., Peschel, C., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. Migration of iron oxide labeled human hematopoietic progenitor cells in a xenotransplant model: in vivo monitoring using clinical magnetic resonance imaging equipment. Radiology. 234, 197-205 (2005).
- Henning, T. D., Saborowski, O., Golovko, D., Boddington, S., Bauer, J. S., Fu, Y., Meier, R., Pietsch, H., Sennino, B., McDonald, D. M., Daldrup-Link, H. E. Cell labeling with the positive MR contrast agent. Gadofluorine M. Eur Radiol. 17, 1226-1234 (2007).
