Lokalisierte RNAi und ektopische Genexpression in der Blutegel
Summary
In diesem Video zeigen wir ein Verfahren für eine genaue biolistischen Lieferung von Reagenzien in lebendes Gewebe mit einem neuartigen Mini-Gen-Kanone. Wir sind umzuwerfen der Ausdruck der Axon Führung Molekül Netrin in Blutegel Embryonen durch die Bereitstellung Moleküle dsRNA in der ventralen Körperwand und Ganglien der einzelnen Segmente.
Abstract
In diesem Video zeigen wir die Verwendung eines pneumatischen Kapillare Waffe für die genaue biolistischen Lieferung von Reagenzien in lebendem Gewebe. Wir nutzen das Verfahren zur stören Genexpressionsmuster in ausgewählten Segmenten des Blutegel Embryonen, so dass die unbehandelten Segmenten als interne Kontrollen.
Die pneumatische Kapillare Waffe kann zur inneren Schichten von Zellen in einem frühen Stadium der Entwicklung erreicht, ohne Öffnung der Probe sein. Als Verfahren zur lokalisierten Einbringen von Stoffen in lebenden Geweben, die biolistischen Lieferung mit der Pistole mehrere Vorteile: Sie ist schnell, berührungslos und zerstörungsfrei. Darüber hinaus kann eine einzelne Kapillare Pistole für unabhängige Lieferung von verschiedenen Substanzen verwendet werden. Die Lieferung einer Region kann auch lateralen Abmessungen von ca. 50-150 um und erstreckt sich über ca. 15 um rund um die mittlere Eindringtiefe, die zwischen 0 und 50 um liegt. Diese Auslieferung hat den Vorteil, dass in der Lage, eine begrenzte Anzahl von Zellen in einem ausgewählten Ort der Mitte zwischen einzelnen Zelle knock down durch Mikroinjektion und systemische Knockdown durch extrazelluläre Injektionen oder durch genetische Ansätze Ziel.
Für umzuwerfen oder Klopfen in der Expression des Axons Führung Molekül Netrin, die natürlich von einigen zentralen Neuronen und in der ventralen Körperwand zum Ausdruck kommt, nicht aber die dorsale Domäne, liefern wir Moleküle dsRNA oder Plasmid-DNA in den Körper Wand-und zentralen Ganglien. Dieses Verfahren umfasst folgende Schritte: (i) Vorbereitung der Versuchsaufbau für einen spezifischen Assay (Anpassung der Beschleunigung Druck), (ii) die Beschichtung der Partikel mit Molekülen der dsRNA oder DNA, (iii) das Laden der beschichteten Partikel in die Pistole, bis zu zwei Reagenzien in einem Test, (iv) die Vorbereitung der Tiere für die Partikel-Lieferung, (v) Lieferung von beschichteten Partikel in das Zielgewebe (Körper Wand oder Ganglien), und (vi) die Verarbeitung der Embryonen (Immunfärbung, Immunhistochemie und neuronalen Kennzeichnung), um die Ergebnisse zu visualisieren, in der Regel 2 bis 3 Tage nach der Lieferung.
Wenn die Teilchen mit Netrin dsRNA beschichtet waren, verursachten sie deutlich sichtbar knock-down von Netrin Ausdruck, der nur in Zellen mit Teilchen (in der Regel, 1-2 Partikel pro Zelle) aufgetreten ist. Partikel mit einem Plasmid kodiert EGFP Fluoreszenz in neuronalen Zellen, wenn sie in ihrem Kern nicht mehr beschichtet.
Protocol
Discussion
In dieser Demonstration, verwendeten wir die pneumatische Kapillare Pistole an Goldpartikel in Zellen liefern in kleinen lokalisierten Volumen von einer Live-leech Embryo bis zum Knock-in und knock-down-Gene. Die Zielregion der Regel einen Durchmesser von ~ 150 um und Partikel gefunden wurden ~ 15 um rund um die mittlere Eindringtiefe, die zwischen 0 und 50 um. Wenn die Teilchen mit dsRNA Moleküle des Axons Führung Faktor Netrin beschichtet waren, verursachten sie deutlich sichtbar knock-down von Netrin Ausdruck, der nur in Zellen mit Par…
Acknowledgements
Wir möchten Dr. Michael Baker für seine Hilfe danken Erzeugung Konstrukte für die Gen-knock-in und für die Bereitstellung der Zeitraffer-Filme wachsender sensorischen Projektionen. Wir möchten auch Virginia Vandelinder für technische Hilfe mit dem Luftgewehr Experimente danken.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| gold particles | Other | Seashell Technology, LLC | S1600ri | |
| binding buffer | Reagent | Seashell Technology, LLC | ||
| silicone rubber | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 |
References
- Baker, M. W., Macagno, E. R. RNAi of the receptor tyrosine phosphatase HmLAR2 in a single cell of an intact leech embryo leads to growth-cone collapse. Current Biology. 10, 1071-1074 (2000).
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- Gan, W. B., et al. Cellular expression of a leech netrin suggests roles in the formation of longitudinal nerve tracts and in regional innervation of peripheral targets. Journal of Neurobiology. 40, 103-115 (1999).
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