В этом видео мы покажем процедуру точной biolistic доставки реагентов в живые ткани романа миниатюрный пистолет гена. Мы сбить выражение молекулы Netrin руководством аксонов в пиявка эмбрионов путем предоставления молекулы дсРНК в вентральной стенкой тела и ганглиях одного сегмента.
Abstract
В этом видео мы покажем, использование пневматических капиллярных пистолет для точного biolistic доставки реагентов в живые ткани. Мы используем процедуру возмущают шаблоны экспрессии генов в отдельных сегментах пиявки эмбрионов, оставив необработанными сегментов внутреннего контроля.
Пневматический пистолет капиллярной могут быть использованы для достижения внутренних слоев клеток на ранних стадиях развития, не открывая образца. В качестве метода локализованных введения веществ в живых тканях, biolistic поставки с пушкой имеет ряд преимуществ: он быстрый, бесконтактный и неразрушающий. Кроме того, одной капиллярной оружие может быть использовано для самостоятельной доставки различных веществ. Доставка регионе может иметь поперечные размеры ~ 50-150 мкм и распространяется на ~ 15 мкм вокруг средняя глубина проникновения, которая регулируется в пределах от 0 до 50 мкм. Эта поставка имеет преимущество в том, способна привлечь внимание ограниченное количество ячеек в выбранном месте промежуточное между одной клетки сбить путем микроинъекции и системных нокдаун через внеклеточную инъекции или с помощью генетических методов.
Для сбивания или стучать в экспрессии молекулы аксон руководством Netrin, которая, естественно, выраженные некоторыми центральными нейронами и в брюшной стенке тела, но не спинной области, мы поставляем молекулы дсРНК или плазмид-ДНК в стенке тела и центральных ганглиев. Эта процедура включает в себя следующие этапы: (я) подготовки экспериментальной установки для конкретного анализа (регулировка ускорения давления), (II) покрытия частиц с молекулами дсРНК или ДНК, (III) погрузка покрытых частиц в пушку, до двух реагентов в одном анализе, (IV) подготовке животных для доставки частиц, (V) доставка покрытых частиц в ткани-мишени (стенки тела или ганглии) и (VI) обработки эмбрионов (иммунной, иммуногистохимии и нейронных маркировки) для визуализации результатов, как правило, от 2 до 3 дней после поставки.
Когда частицы были покрыты netrin дсРНК, они вызвали отчетливо видны нокдауна от netrin выражение, которое произошло только в клетках, содержащих частицы (как правило, 1-2 частиц на клетку). Частицы покрытые плазмиды, кодирующей EGFP индуцированной флуоресценции в нервных клетках, когда они остановились в их ядер.
Protocol
Частицы могут быть покрыты различными реагентами, например, молекулы дсРНК, ДНК плазмиды или красители. Тип и диаметр частиц выбираются в зависимости от реагентов и глубину клетки-мишени в ткани: крупные частицы проникают дальше, но может вызвать некоторые повреждения тканей. <p class="jo…
Discussion
В этой демонстрации мы использовали пневматический пистолет капиллярные для доставки золота частиц по ячейкам в небольших локализованных объема живых эмбрионов пиявки стучать в и нокдауна генов. Целевом регионе как правило, имеют диаметр ~ 150 мкм и частицы были обнаружены ~ 15 мкм примерно средняя…
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить д-р Майкл Бейкер за помощь в создании конструкций для генной нокаут в себе и для обеспечения покадровой фильмы растущей сенсорных проекций. Мы также хотели бы поблагодарить Вирджиния Vandelinder для оказания технической помощи с экспериментами пневматического пистолета.
Shefi, O., Simonnet, C., Groisman, A., Macagno, E. R. Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech. J. Vis. Exp. (14), e697, doi:10.3791/697 (2008).