Localizada RNAi y la expresión génica ectópico en la sanguijuela medicinal
Summary
En este vídeo, se muestra un procedimiento para realizar una entrega precisa biolística de reactivos en el tejido vivo con una pistola de genes en miniatura novela. Estamos derribando la expresión de la molécula de Netrin axón orientación en los embriones de sanguijuela mediante la entrega de las moléculas de dsRNA en la pared ventral del cuerpo y los ganglios de los segmentos individuales.
Abstract
En este video, se muestra el uso de una pistola neumática capilar para la entrega precisa biolística de reactivos en el tejido vivo. Utilizamos el procedimiento para perturbar los patrones de expresión génica en los segmentos seleccionados de embriones de sanguijuelas, dejando a los segmentos no tratados como los controles internos.
La pistola neumática capilar se puede utilizar para llegar a las capas internas de las células en las primeras etapas de desarrollo sin necesidad de abrir la muestra. Como un método para la introducción de las sustancias localizadas en los tejidos vivos, la entrega biolística con la pistola tiene varias ventajas: es rápido, sin contacto y no destructiva. Además, una pistola capilar solo puede ser utilizado para la entrega independiente de las diferentes sustancias. La región de la entrega puede tener dimensiones laterales de ~ 50-150 micras y se extiende sobre unos 15 m alrededor de la profundidad de la penetración media, que es ajustable entre 0 y 50 micras. Esta entrega cuenta con la ventaja de ser capaz de dirigirse a un número limitado de células en un lugar intermedio seleccionado entre célula derribar por microinyección y caída sistémica a través de inyecciones extracelular o por medio de métodos genéticos.
Para derribar o golpear en la expresión de la molécula de Netrin orientación axón, que es, naturalmente, expresadas por algunas neuronas centrales y en la pared ventral del cuerpo, pero no el dominio dorsal, nosotros entregamos las moléculas de dsRNA o un plásmido de ADN en la pared del cuerpo y ganglios centrales. Este procedimiento incluye los siguientes pasos: (i) la preparación de la instalación experimental de un ensayo específico (ajuste de la presión de aceleración), (ii) recubrimiento de las partículas con las moléculas de dsRNA o el ADN, (iii) la carga de las partículas recubiertas en la pistola, hasta dos reactivos en un ensayo, (iv) la preparación de los animales para la entrega de las partículas, (v) la entrega de las partículas recubiertas en el tejido objetivo (pared del cuerpo o de los ganglios), y (vi) el tratamiento de los embriones (tinción de inmunohistoquímica y neuronal etiquetado) para visualizar los resultados, generalmente de 2 a 3 días después de la entrega.
Cuando las partículas se recubrieron con netrina dsRNA, que han causado claramente visible derribo de expresión netrina que sólo ocurrió en las células que contienen partículas (normalmente, 1-2 partículas por célula). Partículas recubiertas con un plásmido EGFP fluorescencia inducida por la codificación en las células neuronales cuando se detuvieron en sus núcleos.
Protocol
Discussion
En esta demostración, se utilizó la pistola neumática capilar para proporcionar partículas de oro en las células de pequeño volumen localizada de un embrión vivo sanguijuela con knock-in y knock-down genes. La región de destino por lo general tenía un diámetro de ~ 150 micras y las partículas se encontraron unos 15 m alrededor de la profundidad de la penetración media, que se puede ajustar entre 0 y 50 micras. Cuando las partículas se recubrieron con moléculas de dsRNA de la netrina factor de orientación axón, que han causad…
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer al Dr. Michael Baker por su ayuda en la generación de las construcciones de genes knock-in y para proporcionar las películas con lapso de tiempo de crecimiento proyecciones sensoriales. También nos gustaría agradecer a Virginia Vandelinder de asistencia técnica con los experimentos de neumáticos arma de fuego.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| gold particles | Other | Seashell Technology, LLC | S1600ri | |
| binding buffer | Reagent | Seashell Technology, LLC | ||
| silicone rubber | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 |
References
- Baker, M. W., Macagno, E. R. RNAi of the receptor tyrosine phosphatase HmLAR2 in a single cell of an intact leech embryo leads to growth-cone collapse. Current Biology. 10, 1071-1074 (2000).
- Baker, M. W., Macagno, E. R. Characterization of Hirudo medicinalis DNA Promoters for Targeted Gene Expression. Journal of Neuroscience Methods. 156, 145-153 (2006).
- Gan, W. B., et al. Cellular expression of a leech netrin suggests roles in the formation of longitudinal nerve tracts and in regional innervation of peripheral targets. Journal of Neurobiology. 40, 103-115 (1999).
- Juven-Gershon, T., Cheng, S., Kadonaga, J. T. Rational design of a super core promoter that enhances gene expression. Nature Methods. 3, 917-922 (2006).
- Rinberg, D., Simonnet, C., Groisman, A. Pneumatic capillary gun for ballistic delivery of microparticles. Applied Physics Letters. 87, 014103 (2005).
- Shefi, O., Simonnet, C., Baker, M. W., Glass, J. R., Macagno, E. R. Microtargeted gene silencing and ectopic expression in live embryos using biolistic delivery with a pneumatic capillary gun. Journal of Neuroscience. 26, 6119-6123 (2006).
