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Summary
神経科学の調査がより洗練さになると、脳の構造と回路の調査では、精度と高分解能の改善レベルが必要です。我々は、50ミクロンの先端径を持つホウケイ酸microcannulaを利用して脳内の慢性的な輸液システムの準備と移植する方法を開発した。
Abstract
脳の領域内神経活性剤の慢性的投与のために使用される実験的なプロトコルは、しばしばミニ浸透圧ポンプシステムを採用しています。エージェントは、一般的に0.30ミリメートル以上の直径を有するステンレス鋼製カニューレを介して配信されます。この口径のカニューレを利用するシステムは、それによって構造的完全性と通常の機能を犠牲にすること、建築の被害をもたらすの関心の領域に外傷を課すことができる。神経科学の調査がより洗練さになると、脳の構造と回路の調査では、精度と高分解能の改善レベルが必要です。我々は、50ミクロンの先端径を持つホウケイ酸microcannulaを利用して脳内の慢性的な輸液システムの準備と移植する方法を開発した。この手法は、ローカル環境へのダメージを軽減し、注入部位で反応性神経膠症を減少させる。 microinfusionシステムの構成は、このように頭皮の切開の閉鎖を促進し、感染のリスクを低減、大脳神経台座の必要性を排除し、また、動物の頭蓋骨の表面に適合することができます。我々は、in vitroモデルとラットのin vivo試験で用いた代表的な分子量を有する色素の信頼性の高い持続的な配信を示しています。
Protocol
はじめ
神経活性剤の直接注入は、血液脳関門をバイパスして、特定の脳領域を検討することができます。神経科学におけるこのアプローチのアプリケーションは多様であり、離散的なサブリージョンでの脳活動のレベルを変更することが含まれます（Berrettaら、2004;。グリッドンら、2005;。Kimら、2000。）、向精神薬の行動を調査する（クリントンら、2006;。ディベネデットら、2004）、（Hauss - Wegrzyniakら脳の炎症の制御モデルを提供し、1998;。。Marchalantら、2007;。ローシーら、2004）、メカニズムを研究する。中毒の（Kimら、2005;。ロックマンら、2005;。。Zhangら、2006）、および栄養因子の長期投与が可能になります（Naertら、2006;。ラデツキら、2005;。高橋ら、2006）。
薬剤の慢性的な配信のための標準的な方法は、多くの場合、0.25の範囲であることが直径のステンレス製のカニューレを介して脳内で配信される神経活性剤を搭載したミニ浸透圧ポンプ（例えば、ALZET浸透圧ポンプ、クパチーノ、カリフォルニア州）、利用するミリメートル（Williamsら、1987。）0.5ミリメートル、しかし、最も一般的に約0.3mm（プラスチックOne、ロアノーク、バージニア州、図6Aを参照）されている。このサイズの配信カニューレは、精度の高いレベルが必要と微小環境への外傷が重要な問題ではない場合、これらのカニューレは、カニューレが同等になっている小規模な、繊細な部位に薬剤を提供するための次善のものではないされている多くのアプリケーションに適しているかもしれないが大きさのために（またはより大きい）対象となる構造自体、またはここで、関数は外傷性の侮辱によって損なわれてはならない。
ここで紹介する程度に下げて先端径を持つ"microcannula"を利用して脳内の神経活性剤の送達のための慢性的な輸液システムの準備と移植のための方法です。この手法は、小規模なサブ構造を対象とすることができますし、関心領域のために外傷を減らすことができます。現在の手順は、このように調査中脳の領域への混乱を最小限にすることを望む研究者の従来の方法に代わるものとして教えられている。
材料および方法
動物とデザイン
十八大人（400〜450 GM）の雄のSprague - Dawleyラットを手順を示し、本方法の関数をテストするために使用された。十二の動物はmicroinfusionシステムを移植し、4日間にわたる持続機能の経時的評価に貢献した。 6匹の動物は、5日間標準28 GA配信カニューレ（N = 3）または生理食塩水を充填したミニ浸透圧ポンプに接続されているmicrocannula（N = 3）のいずれかの移植後のトラウマと反応性神経膠症のレベルを比較するために使用された。動物は、透明なプラスチックケージに収容し、食物と水提供を自由に摂取して、12時間の明/暗スケジュールで維持した。すべての手順は、動物の実験的使用のための適用される連邦政府と地元のガイドラインに準拠して、マクリーン病院動物実験用の委員会によって承認された。
Microinfusionシステムの組立
図1は、コンポーネントとmicroinfusionシステムのアセンブリを示しています。我々は無菌操作を使用してシステムを構築し、注入をお勧めします。生理食塩水槽内に浸漬しながら加えて、システムへの空気の導入を防ぐために、それが組み立てられる。現在のテストでは、ミニ浸透圧ポンプ（MOPS）は14日の期間、0.25μL/ hrの流量、および98.6μLの充填容量を持つ（ALZET、モデル＃1002、クパチーノ、カリフォルニア州）を用いた。メーカーの指示に従ってしかし、過度の流量は、脳内の関心の小さなエリア氾濫ことと構造的な損傷を引き起こすので、これらの研究のための流量は、パラフィンとMOPのコーティング半分で0.125μL/ hrに減少した。地元の外傷の評価については、MOPSは、滅菌生理食塩水を充填した。 microinfusionシステム、ファストグリーン（生理食塩水で1％、フィッシャーサイエンティフィック、パークレーンピッツバーグ、ペンシルバニア州）の持続的な機能の評価については、その低い毒性、実行可能な脳組織内に拡散する能力、およびそのためのテストソリューションとして選ばれた慢性的な注入（例えばムシモール、ピクロトキシン、フルオキセチン、等）のために関心が一般的な"低分子"（<1000）の範囲の上端に分子量（808.84）があります。
図1：Assemのブライmicroinfusionシステムの。 （A）システムのコンポーネントは、アセンブリのためのそれらの相対的な位置に配置。フローmodulaterチューブからフランジが破断されています注意してください。私たちは、整列線は（テキストを参照）ちょうど着床する前に保護されることをお勧めします。 （B）アライメント線と床の取付前にmicroinfusionシステムを組み立て。
Microcannula準備
microcannulaは長い間、静かに先細シャンク（図2A）を持つガラス電極を製造するための設定を標準の水平または垂直電極プラー（Stoelting株式会社ウッドデール、イリノイ州）を使用して昔ながらことができます。ホウケイ酸塩チューブは、この目的に適しています（一部1B100F - 6、で1.0ミリメートル、6、世界の精密機器、（株）、サラソタ、フロリダ州）、それができるように、比較的低い融点を有するように集中熱で曲がり、その後の。ストレートmicrocannulaの先端ほとんどの部分は、解剖ハサミで切断することができますまたは制御ブレークが所望の最終先端径を（与えるためにmicroforceps（世界の精密機器、（株）、サラソタ、フロリダ州）で作ることができる、本デモンストレーションでは50μmの）、及び顕微鏡ステージのマイクロメータは、所望の直径を指導し、確認するのに便利です。カットの先端は短時間加熱、または"ファイアーポリッシュ"、ラフやシャープなエッジを削除することができます。電極の引き手やブンゼンバーナーの加熱コイルは、その後（またはブンゼン火炎加熱コイル内にホウケイ酸チューブを配置することにより、microcannula（図2B）の先端から所定の距離でmicrocannula上に直角を課すために使用されチューブが加熱される）と鉗子との遠位部分に穏やかな力を加える。自主直角に遠位microcannulaの所定の長さは（（例えば、5mm）を対象とする脳の領域の深さに基づいて決定したと考慮頭蓋骨の厚さを取って（〜1 mm）と頭蓋骨の上に距離が取り組んでいるたとえば、1〜2ミリメートル）。従って、本デモのためのmicrocannulaの先端から課された右の角に所定の距離は7-8 mmであった。ダイヤモンドの鉛筆は、ホウケイ酸チューブを直角に近位約8 mmをカットするために使用されます。
図2：microcannulaの準備。 （A）電極プラー（Stoelting株式会社ウッドデール、イリノイ州）は長い間、先細シャンクとmicrocannulaを生成するために使用されます。 （B）加熱コイルは、使いやすさのためにreorientedされることがあります、とマイクロは直角曲げがガラス管が加熱されるように鉗子を用いて形成できるように、コイル内に配置されます。
microcannulasの希望数が行われた後、我々は、エチレンオキサイドやオートクレーブを使用して殺菌をお勧めします。 microcannulaの先端ほとんど1〜2ミリメートルはmicrocannulaの先端が手術中に容易に可視化できるように、滅菌外科マーカー（または滅菌前にパーマネントインク）で着色することができます。
MOPの準備
MOPSは、製造元の指示に従って調製した。簡単に言えば、ステンレス鋼のMOPのチューブ（"フローモジュレータ"）からプラスチック製のフランジは、最初にハサミやrongeursを使用して削除されます。ポリエチレンチューブ（;外径、1.22ミリメートル、プラスチックOne、ロアノーク、バージニア州、＃C312 VT ID：0.72 mm）の長さは、以前はステンレスを挿入することにより、フランジ（〜4 mm）のが占有しているステンレス鋼チューブのエリアに接続されていますポリエチレンチューブと接続の外周に適した接着剤で固定するの腔への鋼管。 LumaBond（myNeuroLab社、セントルイス、MO）は、集束光に曝されると数秒以内に硬化する（例えば、光ファイバーランプから）として特に有用である。チューブの長さは、動物の頭蓋底と肩甲骨の吻側 - ほとんどの側面（例えば、実験用ラットでは約1.5〜3.0センチメートル）との間のおおよその距離すべき。ポンプは指示通り、およびステンレス鋼のALZETチューブ充填され、その端に接続されたポリエチレンチューブの長さで、満たされたポンプに挿入されます。ポンプからの溶液の小体積はポンプチューブのインタフェースの外側（と離れてdabbedされるべきである）周りともポリエチレン管の近位領域に強制されます。付属のチューブで満たされたポンプは、その後37℃で12時間滅菌生理食塩水でインキュベートするポンプは、この潜伏期間の後、正常に機能している場合は、流体は、ポリエチレンチューブの中で数ミリを旅行してきたために見られます。
構築する microinfusionシステムのイオン
その添付されたチューブとポンプは、滅菌生理食塩水を含む10cmペトリ皿に浸漬し、ポリエチレンチューブ内の残りの空気は、ポンプとその中に含まれる同一の溶液を入れたシリンジを用いて除去される小径チューブを装着されていますそのは、ポリエチレンのチューブ内に挿入することができます。解決策は、このように空気を置き換えるためにポリエチレンチューブに注入することができます。同様に、microcannulaは生理食塩水浴中に浸漬され、空気が溶液を注入することにより除去される。これは簡単に第二の溶液にシリンジmicrocannulaの大きい（近位）端の上に収まるフレキシブル（例えば、シリコン）チューブを装着して達成されます。
ホウケイ酸塩チューブの近位端は、ポリエチレンチューブに挿入されます。これはしっかりとそれによってホウケイ酸チューブを簡単に挿入するための開口部をフレアリング内腔にmicroforcepsの閉じた先端を押すことにより、ポリエチレン管の拡張を必要とするかもしれないことに注意してください。空気のない注入システムは、その後、生理食塩水槽から取り出し、無菌の表面の上に置き、軽くガーゼや綿棒で乾燥させる。 microcannula -ポリエチレンチューブの接続は、接着剤の円周コート（例えば、LumaBond）で固定されている。
場合、システムが適切に組み立てられている、とMOPが想定どおりに機能し続ける場合ポンプ内の浸透機構が準備中に続けて、この手順の最終ステップ中に、ソリューションの滴は、通常microcannulaの先端部に表示されます。メーカーの指示に従ってMOPの流量は、パラフィンを塗布し、適切な表面積が比例して減少することができます。現在のデモンストレーションのために、各MOPの50％は、このように0.125μL/ hrに半分に流量を減少させる、簡単に溶融パラフィンにそれをダンクして冷却することにより塗布した。完成したmicroinfusionシステムは、滅菌生理食塩水に浸漬し、37℃になるまで注入に格納されています。
microinfusionシステムの移植
microinfusionシステムは、前述のように標準的な定位手法（クーリー、1990）を用いて注入される。手術野の調製後、穿頭孔をmicrocannulaのエントリのために掘削されています。必要に応じて、頭蓋骨のネジがまたmicrocannulaを保護するために使用されるボンディング化合物を安定化するように配置することができます。この研究室で使用される化合物（Geribond、デン - マット（株）、サンタマリア、カリフォルニア州）は、追加のアンカーを必要としませんが、頭蓋骨の表面はacetonedampened綿棒でクリーニングすることによって調製されている必要があります。 1〜2ミリメートルの直径"フックは、"それはホウケイ酸塩チューブの曲げを取り囲むようにできるように、位置合わせの線の先端（図1参照）で行われます。その後microcannulaの遠位部（脳に進出することを、図3Bを参照）と同じ軸に沿った方向で、（LumaBondを使用して）保護されています。注入システムは、ホルダーの上に位置合わせ線をクランプ、定位キャリア（図3）に搭載される。滅菌縫合糸は、このようにそれを中断し、ポンプの重さ（とトルク）（図3B）による手順の実行中に方向の損失を防ぐ、テザー定位マニピュレータのトップへ注入ポンプをするために使用されます。 microcannulaは、その後ゆっくりとキャリアのクランプに遠位の位置合わせ線を曲げることが鉗子を使用することによって所望の方向（例えば、正確に垂直）に配置することができます。 microcannulaの先端が基準点（例えば、ブレグマまたはラムダ）の上に置かしてから、脳へのエントリポイントに操縦されている。これらの実験における動物のために使用される座標であった：ブレグマ0.2ミリメートル、横3.2ミリメートル、と頭蓋骨、フラット位置では、動物の頭を持つ硬膜の下に腹側5.0ミリメートル。
microcannulaが脳内の適切な深さまで進んだされた後、システムは、台座の化合物（例えば、Geribond）との位置に固定されています。台座は、近くに創傷閉鎖を促進するために頭蓋骨の表面に彫刻することができます。台座の化合物は、（〜2分）硬化した後、整列線がドリルの切削ホイールを使用して台座と同じ高さにカットされます。化合物の少量の切断線から、残りのバーブをカバーし、滑らかにするために使用することができます。 MOPは、動物の肩甲骨の間に位置する、皮下に挿入されます。最後に、傷口を滅菌食塩水でlavaged、そして切開は縫合または創傷クリップ（図3、パネルD）を使用してクローズされます。
croinfusionシステムは、動物内での配置と固定のために配置されている。 （D）microinfusionシステムの設計には、リスクの感染を減らし、動物に不快感を最小限に抑え、ロープロファイル台座上に切開を簡単に閉鎖することができます。"幅="511"高さ="381"/>
図3：microinfusionシステムの注入。定位固定装置の上にmicroinfusionシステムの（）ポジショニング。 （B）MOPはmicrocannulaの向きを中断することから、その重さを防ぐために滅菌縫合糸を使用してつながれている。 microcannulaは、アラインメントの線を用いて脳への精密な垂直方向のエントリのために配置されている。 （C）microinfusionシステムは、動物内での配置と固定のために配置されている。 （D）microinfusionシステムの設計には、リスクの感染を減らし、動物に不快感を最小限に抑え、ロープロファイル台座上に切開を簡単に閉鎖することができます。
標準的な輸液システムの準備と移植
プラスチックOne、ロアノーク、バージニア州、＃3300PM /、標準の輸液システムの準備のための手順はmicrocannula除いmicroinfusionシステムの場合と同じですが300μmの直径を持つ"浸透圧ポンプコネクタカニューレ"（28 GAに置き換えられていますSPC、図5aを参照してください）。標準システムの移植は、脳への参入のカニューレの正確な垂直方向の位置決めを可能にするためにアライメントのワイヤーの添付ファイルを含めて、またmicroinfusionのシステムと同じです。
組織学および分析
高速グリーンの持続的な配信を提供するためにmicroinfusionシステムの能力を調べるために、3匹の動物のグループは、手術後12時間、1日、2日、4日目に屠殺した。被験者は、ペントバルビタールナトリウム（120 mg / kgを、IP）と深く麻酔し、transcardially 0.1Mリン酸200mlで灌流（PBS）緩衝生理食塩水0.1M phospateバッファー中4％パラホルムアルデヒド400 mLのが続く。灌流液は、7.4のpHを、4℃で保持し、ペリスタポンプを用いて毎分50mlの速度で灌流した。死後の組織を損傷することなくカニューレを除去するためには、灌流動物を定位フレームに固定され、台座は、マニピュレータのアームのクランプに取り付けられた硬質線に接着剤で固定され、頭蓋骨は慎重に使用して台座の周りから削除されました歯科用バー。台座と基礎カニューレは、それによってカニューレを配置するための高度されたのと同じ軌道に沿って削除されました。脳は、頭蓋冠から削除され、同じ固定液で12時間浸漬した。
高速グリーンの持続注入の評価のために、200μmの厚さを持つセクションは、スライドガラスにマウントビブラトーム（myNeuroLab、セントルイス、MO）とウェットを使って切断した。代表的なセクションは、CANON CANOSCAN LIDE 600Fスキャナを用いて画像化した。地元の外傷と反応性神経膠症の評価については、70μmビブラトームのセクションは、最初にあったウェットマウントや、乾燥染色、脱水などの組織学的プロセス、で発生する可能性のある組織の歪みを防ぐために、染色撮影。これらの同じセクションは、それらのゼラチンでコーティングされたガラススライド上に乾燥させた、そしてそれらは段階的アルコールで脱水、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）で染色し、そしてPermountでカバー-滑っていた。
隣接70μmのセクションでは、外傷に反応して反応性グリオーシスのプロセス中にアストロサイトによって表現されるグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）を、検出するための標準的な免疫蛍光手順を施行した（丁ら、2000;。Maら、1991）。簡単に言えば、フリーフローティングのセクションでは、PBSでリンスし、10％正常ロバ血清（NDS）でブロックし、3％ウシ血清をアルブミン0.1 M PBSは、0.3％トリトンX - 100（PBS /トリトン）1時間、その後でインキュベートした。 4℃で12時間の1％を含むPBS /トリトンのNDS℃、抗GFAP抗体（シグマケミカル社、セントルイス、MO 1:500）ウサギセクションをPBSで洗浄およびAlexa Fluor ® 594ロバ抗ウサギ二次抗体とともにインキュベートし、室温で1時間、5％NDSを含むPBSで（1:500モレキュラープローブス社、オレゴン州ユージーン）。セクションは、徹底的に再びPBSですすぎ、NeuroTraceで対比染色した®緑色蛍光ニッスル染色（5分間PBSで1:500に、モレキュラープローブス社、オレゴン州ユージーン）。 PBSですすぎ、最終的な後、切片をゼラチンコートしたスライド上にマウントされ、スローフェード（Molecular Probes）で封入。すべての顕微鏡写真をAxioVisionのソフトウェア（カールツァイス社、ソーンウッド、ニューヨーク州）とツァイスAxioskop顕微鏡を用いて取得した。
結果
インビトロ検査
動物での評価に先立って、三microinfusionシステムは、1つのコンパートメント（15 mlコニカルチューブ）でに彼らのファーストグリーン充填MOPSを配置し、2番目の区画でそのmicrocannulasを配置することによって調製した（1ミリリットルエップ Endorfのチューブ）、37℃で滅菌生理食塩水を含む両方℃に各システムは、観測の12時間以上の染料の連続的な流れを示しました。図4は、3時間以上の典型的なシステムの機能を示しています。
図4：microinfusionシステムの機能のin vitroでのデモンストレーションで。 （A）高速グリーン染料の流れは容易にin vitroの試験期間での開始時にmicrocannulaから妨げられることなく見られている。流れが続いている（B）、リザーバーのソリューションは、（B）飽和、および発色（C）と、最終的に不透明になります。
生体microinfusionシステムでの評価
灌流後、削除さmicrocannulasとそれらの接続は慎重に検査され、そしてすべては完全に無傷であることがわかった。したがって、組織内のホウケイ酸ガラスのない破損が存在発生していない、またそこにシステムコンポーネントの接続で任意の欠陥であった。その針に取り付けられたシリコンチューブの短い長さ10。L生理食塩水を充填したハミルトンシリンジはmicrocannulaに接続されたポリエチレンチューブの切断端に穏やかな流れを適用するために使用されていました。 microcannulasのすべての12個の継続的な流れを許可して遮られるため表示されませんでした。さらに、動物から各MOPを除去した後、残りの溶液の体積を測定し、MOPの流量（0.125μL/時間）と、それが機能するために許された時間のために適切であることが判明した。
インビボ送達の
高速グリーンを流し込んで組織の冠状切片の評価は、任意の時点（12時間、1日、2日、4日間）でグループ内の動物の間で分布にはほとんど変動を示した。図5は、4日間染料浸透の漸進的増加を示し、これらの時点でファストグリーン拡散の代表的な領域を示しています。したがって、時間の経過とともにmicroinfusionシステムの機能の正確な評価を曖昧に、柔組織の急速な混濁をもたらした - ファストグリーンの高濃度（15％など、5）を使用して事前の実験があることに注意してください。 1％の染料の拡散の全範囲が正確に総点検を決定するのが困難になることができますが、浸潤の分野は2.5倍の倍率で容易に識別された、と図5の破線で示されている。
図5：ファストグリーンの持続的なmicroinfusionのin vivo demonstationで。 （）12時間ファストグリーンロードされてmicroinfusionシステムの線条体内の配置後に、染料はmicrocannulaサイトを周囲柔組織中に拡散見られている。 1日（B）、2日間（C）、および4日間（D）での観測では、染料の浸透の増加地域とファストグリーンソリューションの継続的な配信を示している。拡散の外側の限界は、低消費電力の顕微鏡下で観察され、破線でここに示されています。スケールバーは2mm。
外傷と反応性神経膠症の評価
新鮮なカット、未染色組織切片の総観察はmicroinfusionシステムは、配信のサイトでローカライズされた外傷の減少をもたらしたことを示した。標準カニューレは、常により良いH＆E（図6D＆E）でより高い電力で認識されている組織の大きい領域（図6B＆C）を、混乱させると変位に見られた。また、血液は頻繁に血管系への妥協の大きい程度を示唆し、血液脳関門の減少整合性を意味する、標準的な注入部位（図6D）で蓄積が認められた。
標準的なカニューレ（図6F）と比較すると、microcannula（図6G）を経由して注入の近傍におけるGFAPのため減少した免疫反応により実証されるようにmicroinfusionシステムも大幅に減少反応性神経膠症になりました。 microcannula誘発性GFAPの染色は通常レベル（図6H）より上に挙上していた間microinfusionシステムを採用したときに、標準的なカニューレの配置と注入（6F）と反応性神経膠症の印象的なエスカレーションは見られなかった。
生理食塩水注入の5日後のiveryのカニューレ。 （A）microcannulaは、mが最も神経活性剤を含まない、無制限の流れを可能にする。50の先端径とホウケイ酸塩チューブからプル、まだ標準配信カニューレ（28 GA、0.30ミリメートル）よりも小さい6Xです。 （B、C）によって引き起こされる大きな局所組織の損傷（矢印）を示す冠状切片の染色、ウェットマウント（厚さ、70。m）を標準カニューレ（B）microcannula（C）と比較した場合。それぞれ、BおよびCに示すようにH＆E染色切片の（D、E）高電力顕微鏡写真。標準のカニューレは、組織の大きな面積を避難し、病変空洞（矢印）の中で血のコレクションにより実証されるように血管系に大きな侮辱を引き起こしした、Dに示すように、より広範な外傷を引き起こした。 microcannulaによって引き起こされる病変は、しかし、かなり少ないと点滴の部位の組織に混乱が少ないです。 （F、G、H）GFAPに対する免疫はmicrocannula（G）と、通常、unlesioned線条体（H）のそれと比較して（F）標準カニューレの病変周囲GFAP +アストロサイトの劇的に増加数を示しています。スケールバー：＆Bは、1mm、D - H、250メートル"/>。
図6：生理食塩水注入の5日後に標準的な配信カニューレに比べてmicrocannulaによって引き起こされるローカライズされたトラウマ。 （A）50μmの先端径を持つホウケイ酸塩チューブから取り出さmicrocannulaは標準的な配信カニューレ（28 GA、0.30ミリメートル）よりも小さい6Xですまだ、ほとんどの神経活性剤の自由、自由な流れを可能にします。 （B）microcannula（C）と比較して標準のカニューレによって引き起こされる大きな局所組織の損傷（矢印）を示す冠状セクションの（B、C）未染色、ウェットマウント（厚さ、70ミクロン）。それぞれ、BおよびCに示すようにH＆E染色切片の（D、E）高電力顕微鏡写真。標準のカニューレは、組織の大きな面積を避難し、病変空洞（矢印）の中で血のコレクションにより実証されるように血管系に大きな侮辱を引き起こしした、Dに示すように、より広範な外傷を引き起こした。 microcannulaによって引き起こされる病変は、しかし、かなり少ないと点滴の部位の組織に混乱が少ないです。 （F、G、H）GFAPに対する免疫はmicrocannula（G）と、通常、unlesioned線条体（H）のそれと比較して（F）標準カニューレの病変周囲GFAP +アストロサイトの劇的に増加数を示しています。スケールバー：＆Bは、1mm、D - H、250μmと。
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Discussion
様々な研究が脳内輸液、組織の外傷や血液脳関門への侮辱の配信カニューレのサイズを小さくすることで（ペリーら、1993）に減少していることが示されている、炎症が減少している免疫応答減衰（フィンセンら、1991）、及び反応性神経膠症が減少です（Nikkhahら、1994）。ここでは、従来使用されて配信カニューレのそれに比べて6倍に減少され、直径microcannulaを経由して脳内の神経活性剤の慢性的な配信のための方法を提示する。我々はこのシステムが確実に時間をかけて代表的なソリューションを提供し、ローカライズされたトラウマと反応性神経膠症のレベルが劇的に減少することを明らかにした。これらの研究は、50 mの最後の先端径を持つ配信のカニューレを用いているが、より小さい先端径を利用することができる。注入の近傍で最小の外傷を負うことながら、そのようなmicroinfusionシステムの主要な美徳は、非常に小さな、離散的なターゲットにエージェントを提供する能力です。
我々は説明する輸液システムの構築に使用されるmicrocannulasは、簡単にカスタム構築された所定の長さと先端の直径を持つことができます。 microinfusionシステムは、安全な、ロープロファイルの固定を可能にし、大規模な頭蓋台座の必要性を排除し、動物の頭蓋骨の表面に適合するように設計されています。手術創は、したがって、容易にこのように動物に不快感や感染症のリスクの両方を削減、合理化されたmicroinfusionの台座を介して縫合することができます。さらに、頭蓋骨にシステムを保護することは少ない頭蓋骨の表面積を必要とするため、追加のまたはそれ以降の手順はより大きな台座からの干渉なしに実施されることがあります。
ここで説明する方法論を採用するときに一つは、しかし、アカウントの特定の技術的な考慮に入れる必要があります。スキルの高いレベルが必要であり、生産と移植の手順は、短時間で効率は、標準的な注入システムのためであることがよりです。一方、これは、非常に精密度の高いテクニックを実践することによって免れる時間（や動物）が、上回るか、少なくとも相殺されることがあります。もう一つの困難は、microcannulaが実質的にあらゆる直径でカスタマイズすることができますが、非常に小さな内腔を持つmicrocannulaは注入物の成分によってまたは注入（例えば、血液、脳組織）中に発生した組織のいずれかによって、妨げになることができるということです。このリスクは、microcannulaの先端が注入手順の間、きれいな、"血のない"手術を行うことにより（例えば、水または注入物溶質の乾燥を防ぐために、生理食塩水、飽和綿棒を使用して）湿ら保つことによって低減されます。
我々は、研究者は、特定の組成物および/またはMOPにロードされる溶液の粘度に適したmicrocannulaの先端径を確立することをお勧めします。これは、簡単にプロトコル（図4）で説明されているものと同様のin vitro試験系で使用することにより達成、または単に37℃の生理食塩水浴に組み立てられたシステムを浸漬し、浴組成および/または体積を測定し監視することによりさ時間をかけてMOPの内容の。欠点は、microcannulaが（例えば、〜10から50ミクロン）の先端径が非常に小さい場合は特に、相対的に不安定なことです。誤って手術中にmicrocannulaを破壊すると、通常、システム全体を交換する必要があります、そのユニットを修復または再構築と大幅に手術時間が延長される。しかし、このような技術に熟練の科学者と人はめったに実践厳格な法の経験の破損、。
実験の終了時に、microinfusionシステムはmicrocannulaが損傷されていないこと、それが特許を残っていることを保証するために検査することができます。我々は、ポンプをリサイクルまたは再使用はお勧めしません、しかし、ミニ浸透圧ポンプの容積も神経活性剤の適切な量が配信されていることを保証するために測定することができます。本発明の方法は、成体ラットで実証されたが、外傷を減少させ、固定するための以下の頭蓋骨の表面積は、例えばマウスや幼若ラットなどの小動物、実験のために、従来の方法よりも望ましいとみなされることが必要とするシステムを使用してください。
本方法は、実験者によって習熟度と技能のやや高度なレベルが必要ですが、それは大きさの順で、おそらく精度を高めるために、と関心領域の外傷に関連する実験的な困惑を最小限にするために提供しています。当研究室では、我々は発見したその実験的な介入のより信頼性と堅牢な効果につながります。
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Mini-osmotic pumps (MOPs) | Tool |  ALZET |
model #1002 | |
| Electrode puller | Tool | Stoelting Co. | ||
| Borosilicate tubing | Surgery | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-6 | |
| Microforceps | Surgery | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Polyethylene tubing | Surgery | Plastics One | #C312 VT | |
| LumaBond | Reagent | myNeuroLab, Inc |
References
- Berretta, S., Lange, N., Bhattacharyya, S., Sebro, R., Garces, J., Benes, F. M. Long-term effectsof amygdala GABA receptor blockade on specific subpopulations of hippocampalinterneurons. Hippocampus. 14, 876-894 (2004).
- Clinton, S. M., Sucharski, I. L., Finlay, J. M. Desipramine attenuates working memoryimpairments induced by partial loss of catecholamines in the rat medial prefrontal cortex. Psychopharmacology. 183, 404-412 (2006).
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神経科学、問題13、ミニ浸透圧ポンプ、慢性的な注入、microcannula、速いグリーンErratum
Formal Correction: Erratum: Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents.
Posted by JoVE Editors on 04/01/2012.
Citeable Link.
A correction was made to: Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents. A key reference was excluded and a revised abstract was republished.
Additional Reference:
22. Cunningham, M.G., Ames, H.M., Donalds, R.A., & Benes, F.M. Construction and implantation of a microinfusion system for sustained delivery of neuroactive agents. Journal of Neuroscience Methods 167, 213-220, doi:10.1016/j.jneumeth.2007.08.016 (2008).
Revised Abstract:
Sustained delivery of neuroactive agents is widely used in neuroscience, but poses many technical challenges. It is necessary to deliver the agent with high precision while minimizing localized trauma and inflammation. Also, the ability to customize the system to accommodate animals of different species and sizes is desirable. This video presentation demonstrates the construction of an infusion system that can be fitted to any particular research animal. The delivery microcannula diameter is approximately 10-fold smaller than most infusion cannulas presently used. This translates into enhanced accuracy and reduced trauma to the brain region under study. The delivery cannula can also be sculpted to fit the contour of the surface of the animal's skull, thereby allowing closure of the scalp incision neatly over the infusion system, precluding the need for a skull-mounted pedestal, reducing risk of infection, and ensuring a greater level of comfort to the animal. The system is assembled in an air-free environment and requires the researcher to fashion glass micropipettes with a heat source. These construction methods require special skills that are best acquired, if not in person, using video instruction. (This article is based on work first reported in J Neurosci Methods. 2008 Jan 30;167(2):213-20. Epub 2007 Aug 28.).
Original Abstract:
Experimental protocols used for chronic infusion of neuroactive agents within regions of the brain often utilize a mini-osmotic pump system. Agents are commonly delivered via a stainless steel cannula with a diameter of 0.30 mm or greater. Systems utilizing a cannula of this caliber may impose trauma to the area of interest resulting in architectural damage, thereby compromising structural integrity and normal functioning. As neuroscience inquiry becomes more sophisticated, investigation of brain structures and circuitry requires improved levels of accuracy and higher resolution. We have developed a method for the preparation and implantation of a chronic infusion system within the brain utilizing a borosilicate microcannula with a tip diameter of 50 microns. This technique reduces damage to the local environment and diminishes reactive gliosis at the site of infusion. The configuration of the microinfusion system is also able to conform to the surface of the animal's skull, precluding the need for large cranial pedestals, thus facilitating closure of the scalp incision and reducing the risk of infection. We demonstrate reliable sustained delivery of a dye having a representative molecular weight using an in vitro model and in vivo studies in rats.
