ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Som neurovetenskap utredningen blir mer sofistikerad, undersökning av hjärnans strukturer och kretsar kräver förbättrade nivåer av noggrannhet och högre upplösning. Vi har utvecklat en metod för att förbereda och implantation av en kronisk infusionssystem i hjärnan använder ett borosilikatglas microcannula med en spets diameter på 50 mikrometer.
Abstract
Experimentella protokoll som används för kronisk infusion av neuroactive agenter inom regioner av hjärnan använder ofta en mini-osmotiska pumpsystem. Agenter är vanligt levereras via en rostfri kanyl med en diameter på 0,30 mm eller större. System som använder en kanyl av den här kalibern ålägga trauma till området av intresse resulterar i arkitektoniska skada, och därmed göra avkall strukturell integritet och normala funktion. Som neurovetenskap utredningen blir mer sofistikerad, undersökning av hjärnans strukturer och kretsar kräver förbättrade nivåer av noggrannhet och högre upplösning. Vi har utvecklat en metod för att förbereda och implantation av en kronisk infusionssystem i hjärnan använder ett borosilikatglas microcannula med en spets diameter på 50 mikrometer. Denna teknik minskar skador på den lokala miljön och minskar reaktiv gliosis vid infusionsstället. Konfigurationen av mikroinfusion systemet är också förmåga att följa ytan av djurets skalle, något som utesluter behovet av stora kraniell piedestaler, vilket underlättar stängning av hårbotten snitt och minska risken för infektion. Vi visar pålitliga fortsatt leverans av ett färgämne som har en representant molekylvikt med hjälp av ett in vitro-modell och in vivo studier på råttor.
Protocol
Inledning
Direkt infusion av neuroactive agenter gör specifika delar av hjärnan som ska studeras medan förbi blod-hjärnbarriären. Tillämpningar av denna metod inom neurovetenskap är varierande och innefattar en ändring av nivån av hjärnaktivitet i diskreta delregioner (Berretta et al, 2004;. Gliddon et al, 2005;.. Kim et al, 2000), undersöka handlingar psykotropa ämnen ( Clinton et al, 2006;.. Di Benedetto et al, 2004), vilket ger kontrollerad modeller av hjärninflammation (Hauss-Wegrzyniak et al, 1998;. Marchalant et al, 2007;.. Rosi et al, 2004), studera de mekanismer av missbruk (Kim et al, 2005;. Lockman et al, 2005;. Zhang et al, 2006.) och möjliggör långsiktig tillförsel av trofiska faktorer (nært et al, 2006;.. Radecki et al, 2005; Takahashi et al., 2006).
Standardmetoder för kronisk leverans av agenter utnyttjar ofta en mini-osmotisk pump (t ex ALZET Osmotisk Pumpar, Cupertino, Kalifornien) laddad med en neuroactive agent, som levereras i hjärnan med hjälp av en rostfri kanyl med en diameter som kan variera från 0,25 mm (Williams et al, 1987.) till 0,5 mm, men vanligast är ca 0,3 mm (Plast One, Roanoke, VA, se figur 6A). Medan leverans kanyler i den här storleken kan vara lämpliga för många applikationer där hög precision krävs inte och trauma för mikromiljön är inte ett stort problem, dessa kanyler är suboptimala för att leverera läkemedel till små, fina platser där kanylen är jämförbar i storlek (eller större än) den målinriktade strukturen i sig, eller där funktionen inte får äventyras av traumatiska förolämpning.
Presenteras här är en metod för att förbereda och implantation av en kronisk infusion system för leverans av neuroactive ämnen i hjärnan som använder en "microcannula" med en mycket reducerad spets diameter. Denna teknik gör att små understrukturer att vara målinriktad och minskar trauma till i området av intresse. Det nuvarande förfarandet är därför undervisas som ett alternativ till konventionella metoder för forskare som vill minimera störningarna i hjärnan regionen under utredning.
Material och metoder
Djur och design
Arton vuxna (400-450 GM) hane Sprague-Dawley råttor användes för att demonstrera förfarandet och testa funktionen av den nuvarande metoden. Tolv djur implanteras med mikroinfusion system och bidrog till en tid-kurs utvärdering av ihållande funktion över 4 dagar. Sex djuren användes för att jämföra nivån av trauma och reaktiv gliosis 5 dagar efter implantation av antingen en standard 28 GA leverans kanyl (N = 3) eller en microcannula (N = 3) som fästs en saltlösning som fylls mini-osmotisk pump. Djuren var inrymt i klar plast burar, och underhållas på ett 12-timmars ljus / mörker schema, med mat och vatten enligt ad lib. Alla förfaranden har godkänts av McLean Hospital Institutional Animal Care och använda kommittén i enlighet med gällande nationella och lokala riktlinjer för experimentell användning av djur.
Mikroinfusion systemet montering
Figur 1 visar de olika komponenterna och montering av mikroinfusion systemet. Vi rekommenderar att bygga och implantation av systemet med steril teknik. Dessutom, för att förhindra att luft kommer in i systemet, är det monteras samtidigt nedsänkt i en saltlösning bad. För närvarande tester, var mini-osmotiska pumpar (MOPS) anställd (ALZET, modell # 1002, Cupertino, CA) med 14 dagars löptid, flödeshastighet på 0,25 ml / timme, och en fyllning kapacitet på 98,6 mikroliter. Men eftersom stora flöden kan översvämmas mindre intressanta områden i hjärnan och orsaka strukturella skador, flödet för dessa studier var minskade till 0,125 ml / h genom ytbeläggning hälften av MOP med paraffin enligt instruktioner från tillverkaren. För utvärdering av lokal trauma, var MOPS fylld med steril koksaltlösning. För utvärdering av ihållande funktion mikroinfusion system, Fast grön (1% i saltlösning, Fisher Scientific, Park Lane Pittsburgh, PA) valdes som ett test lösning på grund av sin låga giftighet, dess förmåga att sprida inom livskraftiga hjärnvävnad, och eftersom det har en molekylvikt (808,84) i den övre delen av intervallet för "små molekyler" (<1000) som är vanligt av intresse för kronisk infusion (t ex muscimol, picrotoxin, fluoxetin, mm).
Figur 1: AssemBly i mikroinfusion systemet. (A) Komponenterna i systemet som tas i deras relativa positioner för montering. Notera flänsen från flödet modulater slangen har brutits bort. Vi rekommenderar anpassning kabeln säkras strax innan implantationen (se text). (B) sammansatta mikroinfusion systemet före montering av anpassning tråd och implantation.
Microcannula förberedelse
Den microcannula kan vara formade med en vanlig horisontell eller vertikal elektrod avdragare (Stoelting Co, Wood Dale, IL) med inställningar för att producera en glaselektrod med en lång, svagt avsmalnande skaft (Fig. 2A). Borosilicate slang är lämplig för detta ändamål (del 1B100F-6, mm 1,0, 6, World precisionsinstrument, Inc., Sarasota, FL), eftersom det har en relativt låg smältpunkt, vilket gör att efterföljande bockning med fokuserade värme. Distala-mest delen av en rak microcannula kan skäras med dissektion sax eller en kontrollerad paus kan göras med microforceps (World precisionsinstrument, Inc., Sarasota, FL) för att ge önskad sista tips diameter (50 ìm för den nuvarande demonstrationerna ) och ett mikroskop objektmikrometern är användbar för att vägleda och bekräfta önskad diameter. Snittet tips kan kortfattat uppvärmd, eller "brand-polerad", för att ta bort grova eller skarpa kanter. Värmebatteriet av elektroden avdragare eller en Bunsenbrännare används sedan för att införa en rätt vinkel på microcannula på en förutbestämd avstånd från spetsen av microcannula (Fig. 2B) genom att placera borosilikat slangen i värmebatteriet (eller en Bunsen låga ) och ett lätt kraft vid den distala delen med pincett så att slangen värms upp. Den förutbestämda längden på microcannula distalt om införs rätt vinkel bestäms baserat på djupet av hjärnan regionen att vara riktade (t.ex. 5 mm) och med hänsyn till skallen tjocklek (~ 1 mm) och arbetsavstånd ovanför skallen ( t ex 1-2 mm). Således förutbestämda avståndet från spetsen på microcannula att de utdömda rätt vinkel för den nuvarande demonstrationerna var 7-8 mm. En diamant penna används sedan för att klippa borosilikat slangen ca 8 mm proximalt rätt vinkel.
Figur 2: Förberedelse av microcannula. (A) En elektrod avdragare (Stoelting Co Wood Dale, IL) används för att producera en microcannula med en lång, avsmalnande skaft. (B) värmebatteriet kan omorienteras för enkel användning, och microcannula placeras inom spolen, så att en rät vinkel böja ska bildas med hjälp av pincetten som glasrör värms upp.
Efter önskat antal microcannulas har gjorts, rekommenderar vi sterilisering med etylenoxid eller använda en autoklav. Distala-mest 1-2 mm i microcannula kan färgas med en steril kirurgisk markör (eller permanent bläck före sterilisering) så att microcannula tips till enkelt visualiseras under det kirurgiska ingreppet.
MOP förberedelse
MOPS har upprättats enligt tillverkarens anvisningar. Kortfattat är plast flänsen från den rostfria MOP slang ("flow-modulator") först bort med sax eller rongeurs. En längd av polyeten slang (plast One, Roanoke, VA, # C312 VT, OD, 1,22 mm, ID: 0,72 mm) är ansluten till området för rostfria rör som tidigare ockuperats av flänsen (~ 4 mm) genom att sätta den rostfria stålrör i lumen i polyeten slangen och säkra med en lämplig tejp runt den yttre omkretsen av anslutningen. LumaBond (myNeuroLab, Inc., St Louis, MO) är särskilt användbart eftersom det härdar inom sekunder vid exponering för fokuserat ljus (t.ex. från en fiberoptisk lampa). Längden på slangen ska ungefärliga avståndet mellan basen av djurets skallen och rostralt-mesta delen av scapulae (t.ex. ca 1,5-3,0 cm för laboratorie råtta). Pumpen är fylld enligt instruktionerna, och rostfritt stål ALZET slang, med längden av polyeten slang fäst dess slut, sätts in i den fyllda pumpen. En liten volym lösning från pumpen kommer att tvingas runt utsidan av pumpen-slang gränssnitt (och bör dabbed bort) och även i proximala region i polyeten slangen. Den fylls pumpen med bifogade slangen är inkuberas därefter i steril koksaltlösning för 12 timmar vid 37 ° C. Om pumpen fungerar, efter denna inkubationstid kommer vätska anses ha rest ett par millimeter i polyeten slangen.
Konstruera joner mikroinfusion systemet
Pumpen med dess fäste slang är nedsänkt i en 10 cm petriskål som innehåller steril koksaltlösning och resterande luften i polyeten slangen tas bort med hjälp av en spruta fylld med samma lösning som finns i pumpen och som har utrustats med liten diameter slangar som kan infogas i polyeten slangen. Lösningen kan därför injiceras i polyeten slangen att byta ut luften. Likaså är microcannula doppas i saltvatten badet och luften tas bort genom att injicera med lösning. Det är lätt att uppnå med en andra lösning, förfylld spruta försedd med flexibla (t.ex. silikon) slang som passar över den stora (proximal) slut microcannula.
Den proximala änden av borosilikatglas slang sedan in i polyeten slangen. Observera att detta kan kräva utvidgning av polyeten slangen genom att försiktigt trycka den slutna tips av microforceps i lumen vilket fackling öppning för enkel insättning av borosilikatglas slangen. Luften utan infusionssystemet är sedan bort från saltvatten bad och placeras på en steril yta och försiktigt torkas av med gasväv eller en bomullspinne. Den microcannula-polyeten slangen förbindelsen är krypterad med en omkrets lager lim (t.ex. LumaBond).
Om systemet har monterats på rätt sätt, och om MOP fortsätter att fungera som den ska, under det sista steget i detta förfarande en droppe av lösning kommer vanligtvis att synas på spetsen av microcannula som osmotiska mekanismen i pumpen fortsätter under beredning. MOP flöde kan minskas proportionellt med beläggning lämplig yta med paraffin enligt instruktioner från tillverkaren. För närvarande demonstrationerna, var 50% av varje MOP belagt genom att kort dunking den i smält paraffin och låta det svalna och därmed minska flödet med hälften till 0,125 ml / tim. Den färdiga mikroinfusion Systemet är sedan nedsänkt i steril koksaltlösning och förvaras vid 37 ° C tills implantation.
Implantation av mikroinfusion systemet
Det mikroinfusion systemet är implanterat med standard stereotaxic metoder som tidigare beskrivits (Cooley, 1990). Efter beredning av kirurgiska området, är en Burr hål borras för inmatning av microcannula. Om så önskas kan skallen skruvar också positionerat för att stabilisera bindning förening används för att säkra microcannula. Den förening som används i detta laboratorium (Geribond, Danmark Mat Inc., Santa Maria, Kalifornien) kräver ingen ytterligare förankring, men måste skallen ytan utarbetas av rengöring med en acetonedampened bomullspinne. En 1-2 mm i diameter "krok" är gjord i distala änden av anpassning tråd (se bild. 1), gör det möjligt att omringa böja i borosilikat slangen. Det är då säkrad (med LumaBond), i en riktning längs samma axel som den distala delen av microcannula (som ska långt in i hjärnan, se bild. 3B). Infusionssystemet är sedan monterat på stereotaxic bärare (Fig. 3), fastspänning anpassning kabeln på hållaren. Sterila sutur används för att tjudra infusionspumpen till toppen av stereotaxic manipulatorn och därmed avbryta den och förhindra förlust av orientering under förfarandet på grund av vikten (och vridmoment) av pumpen (Fig. 3B). Den microcannula kan sedan placeras i önskad riktning (t.ex. exakt vertikalt) genom att använda pincett för att försiktigt böja anpassning tråden distalt transportören klämman. Den microcannula spets är placerad över en referenspunkt (t.ex. bregma eller lambda) och sedan manövreras till den punkt träder i hjärnan. Koordinaterna som används för djur i dessa experiment var: Bregma 0,2 mm, lateral 3,2 mm och ventrala 5,0 mm under dura med djurets huvud i en dödskalle-flat position.
Efter microcannula är avancerat till lämpligt djup i hjärnan, är systemet fast på plats med en piedestal förening (t.ex. Geribond). Sockeln kan skulpterade nära ytan av skallen för att underlätta för tillslutning av sår. Efter piedestal förening har härdat (~ 2 min) är anpassning tråd klippa jäms med piedestal med borrmaskin är kapskiva. En liten mängd substans kan användas för att täcka och jämna resterande hulling från avhuggna tråd. MOP införs därefter subkutant placerad mellan djurets scapulae. Slutligen är såret lavaged med steril koksaltlösning, och snittet stängs med sutur eller klipp sår (Fig. 3, panel D).
croinfusion system är positionerat för placering och fixering i ett djur. (D) Utformningen av mikroinfusion systemet gör det lätt att stänga snittet över en låg profil piedestal, vilket minskar risken infektion och minimera obehag för djuret. "Width =" 511 "height =" 381 "/>
Figur 3: Implantation av mikroinfusion system. (A) Placering av mikroinfusion systemet på stereotaxic instrument. (B) MOP är tjudrad med steril sutur för att förhindra dess vikt från att störa orientering microcannula. Den microcannula är placerad för exakt vertikala inträde i hjärnan med inriktningen tråd. (C) en mikroinfusion system är positionerat för placering och fixering i ett djur. (D) Utformningen av mikroinfusion systemet gör det lätt att stänga snittet över en låg profil piedestal, vilket minskar risken infektion och minimera obehag för djuret.
Upprättande och implantation av standard infusionssystem
Den ordning för beredning av standarden infusionssystemet är densamma som för mikroinfusion systemet utom microcannula ersätts av ett "osmotiskt pump kontakt kanyl" med en diameter på 300 ìm (28 GA, Plast One, Roanoke, VA, # 3300PM / SPC, se figur 5a). Implantation av standarden systemet är också identisk med den i mikroinfusion systemet, inklusive anslutning av en anpassning tråd för att exakt vertikal placering av kanylen träder i hjärnan.
Histologi och analys
För att undersöka mikroinfusion systemets förmåga att ge långvarig leverans av Fast Green, grupper av tre djur som offras på 12 tim, 1 dag, 2 dagar och 4 dagar efter operationen. Ämnen var djupt sövda med natrium pentobarbital (120 mg / kg, ip) och transcardially perfusion med 200 ml 0,1 M fosfatbuffrad saltlösning (PBS) följt av 400 ml 4% paraformaldehyd i 0,1 miljoner fosfatsyntasgen buffert. Perfusion lösningar hölls vid 4 ° C, med ett pH på 7,4 och perfusion med en hastighet av 50 ml per minut med en peristaltiska pumpar. För att ta bort kanyler utan att skada döden vävnaden var perfusion djuret fast i en stereotaxic ram, var piedestal säkrad med lim till en styv fäst vid den påverkande armen klämman, och skallen var försiktigt bort från runt sockeln med hjälp av en tand Burr. Sockeln och den underliggande kanylen var därmed bort längs samma bana där kanylen var avancerade för placering. Hjärnor var då bort från calvaria och inbäddat i 12 timmar i samma fixativ.
För utvärdering av ihållande infusion av Fast Green, sektioner med en tjocklek av minst 200 ìm skars med en Vibratome (myNeuroLab, St Louis, MO) och våt monterade på objektglas. Representativa sektioner avbildas med en Canon CanoScan LiDE 600F scanner. För utvärdering av lokal trauma och reaktiv gliosis var 70μm Vibratome avsnitt först vått monterade och fotograferade ofärgade att förhindra vävnad distorsion som kan uppstå med histologiska processer såsom torkning, färgning, och uttorkning. Samma avsnitt har sedan torka på sina gelatin-belagt glas slides, och de var färgade med hematoxylin och eosin (H & E), torkad med graderad alkoholer, och täck-halkade med Permount.
Intill 70 ìm sektioner genomgick en standard immunofluorescens förfarande för att upptäcka gliaceller fibrillära surt protein (GFAP), som uttrycks av astrocyter under processen med reaktiva gliosis som svar på trauma (Ding et al, 2000;.. Ma et al, 1991). Kortfattat var fritt flytande sektioner sköljas med PBS och blockerade med 10% normal åsna serum (NDS) och 3% bovint serumalbumin i 0,1 M PBS med 0,3% Triton X-100 och (PBS / Triton) i en timme sedan inkuberas i kanin anti-GFAP antikropp (1:500, Sigma Chemical Co, St Louis, MO) i PBS / Triton med 1% NDS för 12 timmar vid 4 ° C. Avsnitten har sedan sköljas med PBS och inkuberas med Alexa Fluor ® 594 åsna-antirabbit sekundär antikropp (1:500, molekylära sonder, Inc., Eugene, OR) i PBS med 5% NDS i en timme vid rumstemperatur. Avsnitten var noga sköljas på nytt med PBS och counterstained med NeuroTrace ® grönt fluorescerande Nissl fläcken (1:500 i PBS i 5 minuter, molekylära sonder, Inc., Eugene, OR). Efter en sista sköljning med PBS, var delar monterade på gelatin-belagda diabilder och täckas med Slow-Fade (molekylära sonder). Alla mikrofotografier har förvärvats med hjälp av ett Zeiss Axioskop mikroskop med AxioVision programvara (Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY).
Resultat
In vitro-testning
Innan utvärdering hos djur har tre mikroinfusion system beredd genom att placera sin Snabb Grön-fyllda MOPS till i ett fack (15 ml koniska rör) och placera sina microcannulas i en andra fack (1 ml Epp Endorf rör), som båda innehåller steril koksaltlösning vid 37 ° C. Varje system visade kontinuerligt flöde av färgämnet över 12 timmars observation. Figur 4 illustrerar funktionen hos ett typiskt system under 3 timmar.
Figur 4: In vitro demonstration av mikroinfusion systemets funktion. (A) Flöde av Fast grönt färgämne är lätt sett obehindrat från microcannula i början av ett in vitro-test period. (B) som flödet fortsätter, blir behållaren lösningen mättad (B), och slutligen ogenomskinligt med färg (C).
Utvärdering av in vivo mikroinfusion systemet
Efter perfusion var borttagna microcannulas och deras anslutningar noggrant inspekteras, och alla visade sig vara helt intakt. Således inträffade inga brott på borosilikatglas inom mjukpapper, inte heller fanns det några brister i anslutningarna av systemkomponenter. A 10. L saltlösning-fyllda Hamilton spruta med en kort längd av kisel slang fäst vid sin nål användes för att försiktigt strömma till avskurna ändan av polyeten slang fäst vid microcannula. Alla tolv av de microcannulas tillstånd till fortsatt flöde och verkade inte blockeras. Dessutom tagit bort alla MOP från djuren, var volymen av den återstående lösningen uppmätts och befunnits vara lämpliga för MOP: s flöde (0,125 ml / timme) och den tid det var tillåtet att fungera.
In vivo leverans
Utvärdering av koronalt delar av vävnad infunderas med Fast grön uppvisat liten variabilitet i fördelning mellan djur inom grupper vid en given tidpunkt (12 timmar, 1 dag, 2 dagar och 4 dagar). Figur 5 illustrerar representativa områden av Fast Grönt spridning vid dessa tidpunkter visar en progressiv ökning av färgämne infiltration under fyra dagar. Observera att tidigare försök med högre koncentrationer av Fast Grön (t.ex. 5 - 15%) resulterade i en snabb grumling av parenkymet, vilket döljer korrekt utvärdering av mikroinfusion systemets funktion över tiden. Medan den fulla omfattningen av 1% färg diffusion kan vara svårt att exakt fastställa om grov inspektion, var delar av infiltration lätt urskiljbara på 2,5 X förstoring, och anges med streckade linjer i figur 5.
Figur 5: In vivo demonstation av ihållande mikroinfusion av Fast Green. (A) Tolv timmar efter intrastriatal placering av en snabb Green-laddad mikroinfusion systemet, färgämne ses sprids i parenkymet kring microcannula sajten. Observationer på 1 dag (b), 2 dagar (C), och 4 dagar (D) tyder på en fortsatt leverans av Fast grön lösning med ökande områden färgämne infiltration. Den yttre gränsen för spridning observerades i låg effekt mikroskopi och indikeras här med streckade linjer. Skala bar, 2 mm.
Utvärdering av trauma och reaktiva gliosis
Gross observation av nyklippt, ofärgade vävnadssnitt visade att mikroinfusion systemet resulterat i en minskning av lokaliserad trauma på platsen för leveransen. Standarden kanylen var alltid sett att störa och tränga undan ett större område av vävnad (Fig. 6B & C), som är mer uppskattat med högre effekt med H & E (Fig. 6D & E). Dessutom var blod ofta sett samlade på standarden infusionsstället (bild 6D), vilket tyder på en högre grad av kompromiss till kärlsystemet och som innebär minskad integritet blod-hjärnbarriären.
Det mikroinfusion systemet ledde också till kraftigt minskade reaktiva gliosis vilket framgår av minskad immunreaktivitet för GFAP i närheten av infusion via en microcannula (bild 6G) jämfört med en vanlig kanyl (fig. 6f). Medan microcannula-inducerad GFAP färgning upphöjdes över normala nivåer (fig. 6h) var slående upptrappning av reaktiva gliosis med standard kanyl placering och infusion (6F) inte sett när mikroinfusion systemet var anställd.
ivery kanyl efter 5 dagar av saltvatten infusion. (A) en microcannula dras från borosilikatglas rör med en spets diameter på 50. M tillåter fritt och obegränsat flöde av de flesta neuroactive agenter, men är 6X mindre än en vanlig leverans kanyl (28 GA, 0,30 mm). (B, C) Obehandlat, våta fästen för koronala sektioner (tjocklek, 70. M) illustrerar större lokal vävnadsskada (pilar) som orsakas av en vanlig kanyl (B) jämfört med en microcannula (C). (D, E) Högre makt mikrofotografier från H & E färgade snitt visas i B och C, respektive. Standarden kanylen orsakat mer omfattande traumatiska skador som illustreras i D, efter att ha fördrivits ett större område av vävnad och orsakar större förolämpning mot kärlsystemet vilket visas av insamling av blod inom lesionen hålighet (pil). Lesionen orsakas av microcannula är dock betydligt mindre och mindre störande för vävnaden vid injektionsstället. (F, G, H) Immunofluorescens mot GFAP visar dramatiskt ökat antal GFAP + astrocyter runt lesionen av standarden kanyl (F) jämfört med den i microcannula (G) och normal, unlesioned striatum (H). Skala staplar: A & B, 1 mm, D - H, 250 m. "/>.
Figur 6: Lokaliserade skador orsakade av en microcannula jämfört med en standard leverans kanyl efter 5 dagar av saltvatten infusion. (A) en microcannula dras från borosilikatglas rör med en spets diameter på 50 ìm tillåter fritt och obegränsat flöde av de flesta neuroactive agenter, men är 6X mindre än en vanlig leverans kanyl (28 GA, 0,30 mm). (B, C) Obehandlat, våta fästen för koronala sektioner (tjocklek, 70 mikrometer) illustrerar större lokal vävnadsskada (pilar) som orsakas av en vanlig kanyl (B) jämfört med en microcannula (C). (D, E) Högre makt mikrofotografier från H & E färgade snitt visas i B och C, respektive. Standarden kanylen orsakat mer omfattande traumatiska skador som illustreras i D, efter att ha fördrivits ett större område av vävnad och orsakar större förolämpning mot kärlsystemet vilket visas av insamling av blod inom lesionen hålighet (pil). Lesionen orsakas av microcannula är dock betydligt mindre och mindre störande för vävnaden vid injektionsstället. (F, G, H) Immunofluorescens mot GFAP visar dramatiskt ökat antal GFAP + astrocyter runt lesionen av standarden kanyl (F) jämfört med den i microcannula (G) och normal, unlesioned striatum (H). Skala staplar: A & B, 1 mm, D - H, 250 ìm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Olika studier har visat att genom att minska storleken på leveransen kanylen för intracerebral infusioner, vävnads trauma och förolämpning mot blod-hjärnbarriären reduceras (Perry et al., 1993), är inflammation minskade och immun-respons försvagade (Finsen et al ., 1991), och reaktiv gliosis minskar (Nikkhah et al., 1994). Vi presenterar här en metod för kroniska leverans av neuroactive ämnen i hjärnan via en microcannula med en diameter som minskas 6-faldigt jämfört med den konventionellt använda leverans kanyler. Vi har visat att detta system tillförlitligt sätt ger en representativ lösning över tiden och nivån på lokal trauma och reaktiva gliosis minskar dramatiskt. Dessa studier använde en leverans kanyl med ett sista tips diameter på 50 m, men kanske mindre tip diameter utnyttjas. Det primära stöd av sådana mikroinfusion system är deras förmåga att leverera läkemedel till mycket små, diskreta mål, medan ådra minimal trauma i närheten av infusionen.
Den microcannulas används vid konstruktion av infusionssystemet vi beskriver kan enkelt specialbyggd med förutbestämda längder och diametrar spets. Det mikroinfusion Systemet är utformat för att anpassa sig till ytan av djurets skalle så säker, låg profil fixering och utesluta behovet av en stor kraniell piedestal. Operationssåret kan därför lätt sys över den strömlinjeformade mikroinfusion piedestal, vilket minskar både obehag för djuret och risken för infektion. Dessutom säkrar systemet att skallen kräver mindre område skallen ytan, och därför kan ytterligare eller efterföljande procedurer utföras utan inblandning från en större piedestal.
Man bör dock beakta vissa tekniska överväganden när de anställer den metod som beskrivs här. En högre nivå av skicklighet krävs, samt produktion och implantation förfarandet är mindre tidseffektivt än det kan vara för standard infusionssystem. Å andra sidan kan detta uppvägas, eller åtminstone uppvägs av tiden (och djur) skonas genom att träna med hög precision teknik. En annan svårighet är att medan microcannula kan anpassas med praktiskt taget alla diameter, kan en microcannula med en mycket liten lumen blir blockerad, antingen genom att delar av infusate eller vävnad som uppstått under implantation (t.ex. blod, hjärnvävnad). Denna risk reduceras genom att hålla microcannula spetsen fuktad (t.ex. med en vatten-eller saltlösning mättade bomullspinne att motverka uttorkning av infusate lösta ämnen) under implantation förfarandet och genom att utföra rena, "blod-free" kirurgi.
Vi rekommenderar att forskaren etablera en microcannula tips diameter som är lämplig för den aktuella sammansättning och / eller lösningsviskositet som ska laddas i MOP. Detta är lätt uppnås med hjälp av ett in vitro-testsystem som liknar den som beskrivs i protokollet (bild 4), eller genom att helt enkelt sänka ner den samlade systemet i ett 37 ° C saltlösning bad och övervakning badet sammansättning och / eller mätning av volymen av MOP innehållet över tid. En nackdel är att microcannula är relativt ömtålig, särskilt om spetsen diametern är mycket liten (t.ex. ~ 10-50 mikron). Oavsiktligt bryta microcannula under operationen oftast kräver att hela systemet bytas ut, som reparation eller ombyggnad som enhet skulle förlänga operationen avsevärt. Forskare skickliga i sådana tekniker och som utövar krävande metod sällan upplever brott, dock.
Vid slutet av experimentet, kan mikroinfusion systemet kontrolleras för att säkerställa att microcannula inte har skadats och att det har förblivit patent. Volymen av mini-osmotiska pump kan också mätas för att säkerställa att lämplig mängd neuroactive agent har levererats, vi rekommenderar inte återvinna eller återanvända pumparna, dock. Samtidigt som den nuvarande metoder visades hos vuxna råttor, användning av ett system som minskar trauma och kräver mindre skalle yta för fixering kan anses vara att föredra jämfört med konventionella metoder för experiment med mindre djur, som möss eller unga råttor.
Även om den nuvarande metoden kräver en något mer avancerad nivå av kompetens och skicklighet av försöksledaren, erbjuder det för att öka precisionen kanske genom en storleksordning, och minimera experimentella blandar ihop samband med trauma till området av intresse. I vårt laboratorium har vi funnit att detta leder till mer tillförlitlig och robust effekterna av experimentella ingrepp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Mini-osmotic pumps (MOPs) | Tool |  ALZET |
model #1002 | |
| Electrode puller | Tool | Stoelting Co. | ||
| Borosilicate tubing | Surgery | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-6 | |
| Microforceps | Surgery | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Polyethylene tubing | Surgery | Plastics One | #C312 VT | |
| LumaBond | Reagent | myNeuroLab, Inc |
References
- Berretta, S., Lange, N., Bhattacharyya, S., Sebro, R., Garces, J., Benes, F. M. Long-term effectsof amygdala GABA receptor blockade on specific subpopulations of hippocampalinterneurons. Hippocampus. 14, 876-894 (2004).
- Clinton, S. M., Sucharski, I. L., Finlay, J. M. Desipramine attenuates working memoryimpairments induced by partial loss of catecholamines in the rat medial prefrontal cortex. Psychopharmacology. 183, 404-412 (2006).
- Cooley, R., et al. Stereotaxic surgery in the rat. , A.J. Kirby Co. Ontario, Canada. (1990).
- Di Benedetto, M., Feliciani, D., D'Addario, C., Izenwasser, S., Candeletti, S. Romualdi P.Effects of the selective norepinephrine uptake inhibitor nisoxetine on prodynorphin geneexpression in rat CNS. Brain Res Mol Brain Res. 127, 115-120 (2004).
- Ding, M., Haglid, K. G., Hamberger, A. Quantitative immunochemistry on neuronal loss,reactive gliosis and BBB damage in cortex/striatum and hippocampus/amygdala aftersystemic kainic acid administration. Neurochemistry international. 36, 313-318 (2000).
- Finsen, B. R., Sorensen, T., Castellano, B., Pedersen, E. B., Zimmer, J. Leukocyte infiltrationand glial reactions in xenografts of mouse brain tissue undergoing rejection in the adultrat brain. A light and electron microscopical immunocytochemical study. JNeuroimmunol. 32, 159-183 (1991).
- Gliddon, C. M., Darlington, C. L., Smith, P. F. Effects of chronic infusion of a GABAA receptoragonist or antagonist into the vestibular nuclear complex on vestibular compensation inthe guinea pig. J Pharmacol Exp Ther. 313, 1126-1135 (2005).
- Hauss-Wegrzyniak, B., Dobrzanski, P., Stoehr, J. D., Wenk, G. L. Chronic neuroinflammation in rats reproduces components of the neurobiology of Alzheimer's disease. Brain Res. 780, 294-303 (1998).
- Kim, H. S., Choi, H. S., Lee, S. Y., Oh, S. Changes of GABA(A) receptor binding and subunitmRNA level in rat brain by infusion of subtoxic dose of MK-801. Brain Res. 880, 28-37 (2000).
- Kim, S. Y., Chudapongse, N., Lee, S. M., Levin, M. C., Oh, J. T., Park, H. J., Ho, I. K. Proteomicanalysis of phosphotyrosyl proteins in morphine-dependent rat brains. Brain Res MolBrain Res. 133, 58-70 (2005).
- Lockman, P. R., McAfee, G., Geldenhuys, W. J., Schyf, C. J., Abbruscato, T. J., Van Allen, D. D. der Schyf CJ, Abbruscato TJ, Allen DD.Brain uptake kinetics of nicotine and cotinine after chronic nicotine exposure. J Pharmacol Exp Ther. 314, 636-642 (2005).
- MA, K. C., Chang, Z. H., Shih, H., Zhu, J. H., Wu, J. Y. The compensatory 'rebound' of reactiveastrogliosis: glial fibrillary acidic protein immunohistochemical analysis of reactiveastrogliosis after a puncture wound to the brain of rats with portocaval anastomosis. Acta neuropathologica. 82, 72-77 (1991).
- Marchalant, Y., Rosi, S., Wenk, G. L. Anti-inflammatory property of the cannabinoid agonistWIN-55212-2 in a rodent model of chronic brain inflammation. Neuroscience. 144, 1516-1522 (2007).
- Naert, G., Ixart, G., Tapia-Arancibia, L., Givalois, L. Continuous i.c.v. infusion of brainderivedneurotrophic factor modifies hypothalamic-pituitary-adrenal axis activity,locomotor activity and body temperature rhythms in adult male rats. Neuroscience. 139, 779-789 (2006).
- Nikkhah, G., Olsson, M., Eberhard, J., Bentlage, C., Cunningham, M. G., Bjorklund, A. Amicrotransplantation approach for cell suspension grafting in the rat Parkinson model: adetailed account of the methodology. Neuroscience. 63, 57-72 (1994).
- Perry, V. H., Andersson, P. B., Gordon, S. Macrophages and inflammation in the centralnervous system. Trends Neurosci. 16, 268-273 (1993).
- Radecki, D. T., Brown, L. M., Martinez, J., Teyler, T. J. BDNF protects against stress-inducedimpairments in spatial learning and memory and LTP. Hippocampus. 15, 246-253 (2005).
- Rosi, S., Ramirez-Amaya, V., Hauss-Wegrzyniak, B., Wenk, G. L. Chronic brain inflammationleads to a decline in hippocampal NMDA-R1 receptors. J Neuroinflammation. 1, 12-12 (2004).
- Takahashi, M., Kakita, A., Futamura, T., Watanabe, Y., Mizuno, M., Sakimura, K., Castren, E., Nabeshima, T., Someya, T., Nawa, H. Sustained brain-derived neurotrophic factor upregulationand sensorimotor gating abnormality induced by postnatal exposure tophencyclidine: comparison with adult treatment. J Neurochem. 99, 770-780 (2006).
- Williams, L. R., Vahlsing, H. L., Lindamood, T., Varon, S., Gage, F. H., Manthorpe, M. A smallgaugecannula device for continuous infusion of exogenous agents into the brain. Experimental neurology. 95, 743-754 (1987).
- Zhang, X., Lee, T. H., Xiong, X., Chen, Q., Davidson, C., Wetsel, W. C. Ellinwood EH.Methamphetamine induces long-term changes in GABAA receptor alpha2 subunit andGAD67 expression. Biochem Biophys Res Commun. 351, 300-305 (2006).
Tags
Neurovetenskap 13 frågan mini osmotisk pump kronisk infusion microcannula snabb grönErratum
Formal Correction: Erratum: Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents.
Posted by JoVE Editors on 04/01/2012.
Citeable Link.
A correction was made to: Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents. A key reference was excluded and a revised abstract was republished.
Additional Reference:
22. Cunningham, M.G., Ames, H.M., Donalds, R.A., & Benes, F.M. Construction and implantation of a microinfusion system for sustained delivery of neuroactive agents. Journal of Neuroscience Methods 167, 213-220, doi:10.1016/j.jneumeth.2007.08.016 (2008).
Revised Abstract:
Sustained delivery of neuroactive agents is widely used in neuroscience, but poses many technical challenges. It is necessary to deliver the agent with high precision while minimizing localized trauma and inflammation. Also, the ability to customize the system to accommodate animals of different species and sizes is desirable. This video presentation demonstrates the construction of an infusion system that can be fitted to any particular research animal. The delivery microcannula diameter is approximately 10-fold smaller than most infusion cannulas presently used. This translates into enhanced accuracy and reduced trauma to the brain region under study. The delivery cannula can also be sculpted to fit the contour of the surface of the animal's skull, thereby allowing closure of the scalp incision neatly over the infusion system, precluding the need for a skull-mounted pedestal, reducing risk of infection, and ensuring a greater level of comfort to the animal. The system is assembled in an air-free environment and requires the researcher to fashion glass micropipettes with a heat source. These construction methods require special skills that are best acquired, if not in person, using video instruction. (This article is based on work first reported in J Neurosci Methods. 2008 Jan 30;167(2):213-20. Epub 2007 Aug 28.).
Original Abstract:
Experimental protocols used for chronic infusion of neuroactive agents within regions of the brain often utilize a mini-osmotic pump system. Agents are commonly delivered via a stainless steel cannula with a diameter of 0.30 mm or greater. Systems utilizing a cannula of this caliber may impose trauma to the area of interest resulting in architectural damage, thereby compromising structural integrity and normal functioning. As neuroscience inquiry becomes more sophisticated, investigation of brain structures and circuitry requires improved levels of accuracy and higher resolution. We have developed a method for the preparation and implantation of a chronic infusion system within the brain utilizing a borosilicate microcannula with a tip diameter of 50 microns. This technique reduces damage to the local environment and diminishes reactive gliosis at the site of infusion. The configuration of the microinfusion system is also able to conform to the surface of the animal's skull, precluding the need for large cranial pedestals, thus facilitating closure of the scalp incision and reducing the risk of infection. We demonstrate reliable sustained delivery of a dye having a representative molecular weight using an in vitro model and in vivo studies in rats.
