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Summary
Come indagine delle neuroscienze diventa più sofisticato, l'indagine delle strutture cerebrali e circuiti richiede migliori livelli di accuratezza e alta risoluzione. Abbiamo sviluppato un metodo per la preparazione e l'impianto di un sistema di infusione cronica all'interno del cervello utilizzando un microcannula borosilicato con una punta di diametro 50 micron.
Abstract
Protocolli sperimentali utilizzati per l'infusione cronica di agenti neuroattivi all'interno delle regioni del cervello utilizzano spesso una mini-pompa osmotica. Gli agenti sono comunemente forniti tramite una cannula in acciaio inossidabile con un diametro di 0,30 mm o maggiore. Sistemi che utilizzano una cannula di questo calibro può imporre un trauma alla zona di interesse con conseguente danno architettonico, compromettendo l'integrità strutturale e il funzionamento normale. Come indagine delle neuroscienze diventa più sofisticato, l'indagine delle strutture cerebrali e circuiti richiede migliori livelli di accuratezza e alta risoluzione. Abbiamo sviluppato un metodo per la preparazione e l'impianto di un sistema di infusione cronica all'interno del cervello utilizzando un microcannula borosilicato con una punta di diametro 50 micron. Questa tecnica riduce i danni all'ambiente locale e diminuisce gliosi reattiva nel sito di infusione. La configurazione del sistema microinfusion è anche in grado di conformarsi alla superficie del cranio dell'animale, precludendo la necessità di grandi piedistalli cranica, facilitando così la chiusura della ferita del cuoio capelluto e riducendo il rischio di infezione. Dimostriamo affidabile consegna sostenuta di un colorante con peso molecolare rappresentante utilizzando un modello in vitro e in vivo sui ratti.
Protocol
Introduzione
Infusione diretta degli agenti neuroattivi consente alle regioni specifiche del cervello di essere studiato, mentre bypassando la barriera ematoencefalica. Le applicazioni di questo approccio nel campo delle neuroscienze sono diversi e comprendono la modifica del livello di attività cerebrale in subregioni discreti (Berretta et al, 2004;. Gliddon et al, 2005;.. Kim et al, 2000), studiando l'azione di agenti psicotropi ( Clinton et al, 2006;.. Di Benedetto et al, 2004), fornendo modelli controllata di infiammazione cerebrale (Hauss-Wegrzyniak et al, 1998;. Marchalant et al, 2007;.. Rosi et al, 2004), studiando i meccanismi di dipendenza (Kim et al, 2005;. Lockman et al, 2005;. Zhang et al, 2006.), e consentendo a lungo termine somministrazione di fattori trofici (Naert et al, 2006;.. Radecki et al, 2005; Takahashi et al., 2006).
Metodi standard per la consegna cronica di agenti utilizzano spesso una mini-pompa osmotica (ad esempio, Pompe ALZET osmotica, Cupertino, CA) caricato con un agente neuroattivi, che viene consegnato entro il cervello attraverso una cannula in acciaio inox con un diametro che può variare da 0,25 mm (Williams et al, 1987.) a 0,5 mm, ma più comunemente è di circa 0,3 mm (plastiche Uno, Roanoke, VA; vedi Fig. 6A). Mentre cannule consegna di queste dimensioni può essere adatto per molte applicazioni in cui alti livelli di precisione non sono necessari e traumi al microambiente non è una grande preoccupazione, queste cannule sono ottimali per la distribuzione di agenti di piccole dimensioni, siti delicato in cui la cannula è paragonabile dimensioni a (o più grande) la struttura mirata stessa, o in cui la funzione non deve essere compromessa da insulto traumatico.
Qui presentato è un metodo per la preparazione e l'impianto di un sistema di infusione cronica per la consegna di agenti neuroattivi all'interno del cervello utilizzando un "microcannula" con una punta di diametro molto ridotto. Questa tecnica permette sottostrutture piccoli per essere mirati e riduce il trauma alla dell'area di interesse. La presente procedura è quindi insegnato come alternativa ai metodi tradizionali per i ricercatori che vogliono minimizzare i disagi per la regione del cervello sotto inchiesta.
Materiali e metodi
Animali e design
Diciotto adulti (400-450 gr) maschi Sprague-Dawley sono stati utilizzati per dimostrare la procedura e prova la funzione del metodo attuale. Dodici animali sono stati impiantati con sistemi microinfusion e contribuito ad un time-corso la valutazione della funzionalità sostenuta oltre 4 giorni. Sei animali sono stati utilizzati per confrontare il livello del trauma e gliosi reattiva 5 giorni dopo l'impianto di uno standard di consegna 28 cannula ga (n = 3) o un microcannula (N = 3) attaccato ad una soluzione salina mini-pompa osmotica. Gli animali sono stati alloggiati in gabbie di plastica trasparente, e mantenuto in una 12-ore di luce / buio programma, con cibo e acqua fornita ad libitum. Tutte le procedure sono state approvate dal Servizio Animal Hospital McLean Comitato Istituzionale e Usa, in conformità alle linee guida federali e locali per uso sperimentale di animali.
Microinfusion sistema di assemblaggio
La figura 1 illustra le componenti e l'assemblaggio del sistema microinfusion. Si consiglia la costruzione e l'impianto del sistema utilizzando una tecnica sterile. Inoltre, al fine di prevenire l'introduzione di aria nel sistema, è assemblato in immersione in una vasca salina. Per le prove attuali, mini-pompe osmotiche (MOP) sono stati impiegati (ALZET, modello # 1002, Cupertino, CA) con una durata di 14 giorni, la portata di 0,25 microlitri / h, e una capacità di riempimento del 98,6 microlitri. Tuttavia, poiché i tassi di flusso eccessivo può diluvio piccole aree di interesse per il cervello e causare danni strutturali, la portata di questi studi è stato ridotto a 0,125 microlitri / h da rivestimento metà della MOP con paraffina secondo le istruzioni del produttore. Per la valutazione dei traumi locali, MOP sono stati riempiti con soluzione salina sterile. Per la valutazione della funzionalità dei sistemi sostenuto microinfusion, Fast Verde (1% in soluzione salina, Fisher Scientific, Park Lane, Pittsburgh, PA) è stato scelto come soluzione di test a causa della sua bassa tossicità, la sua capacità di diffondere nel tessuto cerebrale vitali, e perché ha un peso molecolare (808,84) al limite superiore del range di "piccole molecole" (<1000) che sono comunemente di interesse per infusione cronica (ad esempio muscimolo, picrotossina, fluoxetina, ecc.)
Figura 1: AssemBly del sistema microinfusion. (A) I componenti del sistema che saranno messi nelle loro posizioni relative per il montaggio. Nota la flangia dal tubo modulater flusso è stato rotto. Si consiglia il filo di allineamento essere assicurato poco prima che l'impianto (vedi testo). (B) assemblato sistema microinfusion prima di attaccamento di filo di allineamento e di impianto.
Microcannula preparazione
La microcannula può essere modellato con un estrattore normale elettrodo orizzontale o verticale (Stoelting Co., Wood Dale, IL) con impostazioni per la produzione di un elettrodo di vetro con un lungo gambo leggermente affusolata (Fig. 2A). Tubi borosilicato è adatto a questo scopo (parte 1B100F-6, 1,0 mm, 6 a, Strumenti di precisione del Mondo, Inc., Sarasota, FL), in quanto ha un punto di fusione relativamente basso, permettendo successivamente di piegatura con il calore concentrato. La maggior parte distale-porzione di un microcannula rettilineo può essere tagliato con le forbici dissezione o una rottura controllata può essere fatta con microforceps (Strumenti di precisione del Mondo, Inc., Sarasota, FL) per dare il diametro desiderato punta finale (50 micron per le manifestazioni presenti ) e un microscopio micrometrico è utile per orientare e confermare il diametro desiderato. La punta di taglio può essere brevemente riscaldati, o "fuoco lucido", per rimuovere i bordi ruvidi o taglienti. La bobina di riscaldamento del estrattore elettrodo o un becco Bunsen viene poi utilizzato per imporre un angolo a destra per la microcannula ad una distanza predeterminata dalla punta della microcannula (Fig. 2B), ponendo il tubo borosilicato all'interno della batteria di riscaldamento (o una fiamma Bunsen ) e applicando forza gentile nella porzione distale con una pinza il tubo è riscaldata. La lunghezza predeterminata del microcannula distale all'angolo imposto destra è deciso in base alla profondità della regione del cervello di essere mirati (ad esempio, 5 mm) e tenendo conto dello spessore cranio (~ 1 mm) e distanza di lavoro al di sopra del cranio ( ad esempio, 1-2 mm). Così la distanza prestabilita dalla punta del microcannula all'angolo imposto giusto per le dimostrazioni presente era 7-8 mm. Una matita diamante viene quindi utilizzato per tagliare il tubo in vetro borosilicato circa 8 mm prossimale al retto.
Figura 2: Preparazione di microcannula. (A) Un elettrodo estrattore (Stoelting Co. Wood Dale, IL) è utilizzato per produrre un microcannula con un lungo gambo si assottiglia. (B) La batteria di riscaldamento può essere riorientato per la facilità d'uso e la microcannula è collocato all'interno della bobina, permettendo una curva ad angolo retto a formare con pinze come il tubo di vetro è riscaldato.
Dopo il numero desiderato di microcannule è stato fatto, si consiglia di sterilizzazione con ossido di etilene o con autoclave. La distale più a 1-2 mm di microcannula può essere colorato con un pennarello sterile chirurgica (o inchiostro permanente prima della sterilizzazione) per consentire la punta microcannula di essere facilmente visualizzati durante la procedura chirurgica.
MOP preparazione
POM sono stati preparati secondo le istruzioni del produttore. In breve, la flangia in plastica dal tubo in acciaio inox MOP ("flusso modulatore") è il primo eliminato con le forbici o Rongeurs. Una lunghezza di tubo in polietilene (Plastica Uno, Roanoke, VA, VT # C312, OD, 1.22 mm, ID: 0,72 mm) è collegato alla zona di tubi in acciaio inox precedentemente occupata dalla flangia (~ 4 mm) inserendo il inox tubi d'acciaio nel lume del tubo in polietilene e la protezione con un adesivo adatto lungo la circonferenza esterna della connessione. LumaBond (myNeuroLab, Inc., St. Louis, MO) è particolarmente utile in quanto guarisce in pochi secondi dopo l'esposizione a luce concentrata (ad esempio, da una lampada a fibre ottiche). La lunghezza del tubo dovrebbe approssimare la distanza tra la base del cranio dell'animale e la maggior parte rostrale-aspetto delle scapole (per esempio, circa 1,5-3,0 cm per topi di laboratorio). La pompa è riempito come da istruzioni, e l'inossidabile ALZET tubi d'acciaio, con la lunghezza dei tubi in polietilene attaccato alla sua fine, è inserita nella pompa riempito. Una piccola quantità di soluzione della pompa sarà costretto intorno alla parte esterna della pompa-tubi di interfaccia (e dovrebbe essere tamponò distanza) e anche nella regione prossimale del tubo in polietilene. La pompa piena di tubi collegato viene quindi incubato in soluzione salina sterile per 12 ore a 37 ° C. Se la pompa funziona correttamente, dopo questo periodo di incubazione, il fluido si vedrà di aver viaggiato pochi millimetri all'interno del tubo in polietilene.
Costruire ione del sistema microinfusion
La pompa con il suo tubo attaccato è immerso in un piatto da 10 cm di Petri contenente soluzione salina sterile, e l'aria residua all'interno del tubo in polietilene è rimosso usando una siringa riempita con la stessa soluzione contenuta nella pompa e che è stato dotato di piccolo diametro del tubo che può essere inserito all'interno del tubo in polietilene. Soluzione può quindi essere iniettata nel tubo di polietilene per sostituire l'aria. Analogamente, il microcannula è immerso nel bagno salino e l'aria viene rimossa mediante iniezione con la soluzione. Questo è facilmente ottenibile con una seconda soluzione siringa dotata di flessibile (ad esempio, silicone) tubo che si inserisce nel grande (prossimale) fine del microcannula.
L'estremità prossimale del tubo in vetro borosilicato viene poi inserito nel tubo di polietilene. Si noti che questo può richiedere la dilatazione dei tubi in polietilene da fermo premendo le punte chiuso microforceps nel lume così svasatura l'apertura per un facile inserimento del tubo in vetro borosilicato. L'aria priva di sistema di infusione viene quindi rimosso dal bagno salino e collocato su una superficie sterile e asciugati delicatamente con una garza o un batuffolo di cotone. Il microcannula-tubi in polietilene connessione è protetta con uno strato di adesivo circonferenziale (ad esempio, LumaBond).
Se il sistema è stato assemblato correttamente, e se il MOP continua a funzionare come dovrebbe, durante la fase finale di questa procedura una goccia di soluzione di solito si trova sulla punta della microcannula come il meccanismo osmotico all'interno della pompa continua durante la preparazione. Portata MOP può essere ridotto in proporzione dal rivestimento della superficie con paraffina appropriato secondo le istruzioni del produttore. Per le manifestazioni presenti, il 50% di ogni MOP è stato ricoperto da brevemente inzuppare in paraffina fuso e lasciato raffreddare, riducendo così la portata della metà a 0,125 microlitri / ora. Il sistema microinfusion completato viene poi immerso in soluzione fisiologica sterile e conservato a 37 ° C fino a quando l'impianto.
L'impianto di sistema microinfusion
Il sistema microinfusion è impiantato utilizzando metodi standard stereotassica come descritto in precedenza (Cooley, 1990). Dopo la preparazione del campo chirurgico, un buco bava si è esercitato per l'ingresso della microcannula. Se lo si desidera, le viti del cranio possono essere posizionati anche per stabilizzare il composto di incollaggio utilizzato per fissare il microcannula. Il composto usato in questo laboratorio (Geribond, Den-Mat Inc., Santa Maria, CA) non necessita di ancoraggio supplementari, ma la superficie del cranio deve essere preparato da pulire con un tampone di cotone acetonedampened. A 1-2 mm di diametro "gancio" è fatto alla fine distale del filo di allineamento (vedi fig. 1), permettendo così a circondare la curva del tubo borosilicato. E 'poi fissato (usando LumaBond), in un orientamento lungo l'asse stesso la porzione distale del microcannula (che deve essere avanzata nel cervello, vedi fig. 3B). Il sistema di infusione viene poi montato sul supporto stereotassica (Fig. 3), bloccaggio del filo di allineamento sul supporto. Suture chirurgiche viene usato per legare la pompa di infusione alla parte superiore del manipolatore stereotassica, così la sospensione e la prevenzione della perdita di orientamento durante la procedura a causa del peso (e la coppia) della pompa (Fig. 3B). Il microcannula può quindi essere posizionato con l'orientamento desiderato (ad esempio proprio verticale) utilizzando pinze per piegare delicatamente il filo di allineamento distale al morsetto vettore. La punta microcannula è posizionato su un punto di riferimento (ad esempio, bregma o lambda) e poi manovrò fino al punto di entrata nel cervello. Le coordinate per gli animali utilizzati in questi esperimenti sono stati: bregma 0,2 millimetri, laterale 3,2 mm, e ventrale 5,0 millimetri sotto la dura madre con la testa dell'animale in un teschio piatto posizione.
Dopo la microcannula è avanzato alla profondità appropriata all'interno del cervello, il sistema viene fissato in posizione con un composto piedistallo (ad esempio, Geribond). Il basamento può essere scolpita vicino alla superficie del cranio per facilitare la chiusura della ferita. Dopo il composto piedistallo ha curato (~ 2 min), il filo di allineamento è tagliato a filo con il piedistallo con ruota di taglio della macchina perforatrice. Una piccola quantità di composto può essere usato per coprire e liscia la sbavatura rimanenti dal filo reciso. Il MOP è quindi inserito per via sottocutanea, posizionato tra scapole dell'animale. Infine, la ferita è lavaged con soluzione salina sterile, e l'incisione chiusi con sutura o clip ferita (Fig. 3, pannello D).
sistema croinfusion è posizionato per il posizionamento e fissaggio all'interno di un animale. (D) La progettazione del sistema di chiusura microinfusion permette facilmente l'incisione su un basso profilo piedistallo, riducendo il rischio di infezioni e riducendo al minimo il disagio per l'animale. "Width =" "height =" 511 381 "/>
Figura 3: Impianto di sistema microinfusion. (A) Posizionamento del sistema microinfusion su strumento stereotassico. (B) Il MOP è legato con suture chirurgiche per evitare che il suo peso di compromettere l'orientamento della microcannula. Il microcannula è posizionato per un preciso ingresso verticale nel cervello usando il filo di allineamento. (C) Un sistema microinfusion è posizionato per il posizionamento e fissaggio all'interno di un animale. (D) La progettazione del sistema di chiusura microinfusion permette facilmente l'incisione su un basso profilo piedistallo, riducendo il rischio di infezioni e riducendo al minimo il disagio per l'animale.
Preparazione e impianto di sistema di infusione di serie
La procedura per la preparazione del sistema di infusione standard è identico a quello per il sistema microinfusion tranne il microcannula è sostituito da un "connettore cannula osmotico pompa" con un diametro di 300 micron (28 ga; plastiche Uno, Roanoke, VA, # 3300PM / SPC, vedi Fig. 5a). Impianto del sistema standard è identica a quella del sistema microinfusion, compreso il collegamento di un filo di allineamento per consentire un preciso posizionamento verticale della cannula di ingresso nel cervello.
Istologia e Analisi
Per esaminare la capacità del sistema microinfusion di fornire fornitura continua di verde veloce, gruppi di tre animali sono stati sacrificati a 12 ore, 1 giorno, 2 giorni e 4 giorni dopo l'intervento. I soggetti sono stati profondamente anestetizzati con sodio pentobarbital (120 mg / kg, ip) e transcardially perfusi con 200 ml di 0.1M tampone fosfato (PBS), seguiti da 400 ml di paraformaldeide 4% in tampone fosfato 0,1 M. Soluzioni di perfusione sono stati mantenuti a 4 ° C, con un pH di 7,4 e perfusi a una velocità di 50 mL per minuto con una pompa peristaltica. Al fine di rimuovere la cannula senza danneggiare i tessuti post-mortem, l'animale perfuso è stato fissato in un frame stereotassico, il piedistallo è stato fissato con adesivo ad un filo rigido collegato al morsetto braccio manipolatore, e il cranio è stato accuratamente rimosso da tutto il piedistallo con uno di frese. Il piedistallo e la cannula sottostante sono stati quindi eliminati lungo la stessa traiettoria in cui è stata avanzata la cannula per il posizionamento. Cervelli sono stati poi rimossi dalla calvaria e immerso per 12 ore nella stessa fissativo.
Per la valutazione di infusione continua di verde veloce, sezioni con spessore di 200 micron sono state tagliate con un Vibratome (myNeuroLab, St. Louis, MO) e bagnato montate su vetrini. Sezioni rappresentative sono state ripreso con un scanner Canon CanoScan LiDE 600F. Per la valutazione dei traumi locali e gliosi reattiva, 70μm sezioni Vibratome sono stati bagnati, montato e fotografato senza macchia per evitare distorsioni del tessuto che possono verificarsi con i processi istologici, quali l'essiccazione, macchie e disidratazione. Queste stesse sezioni sono state poi lasciate asciugare sui loro gelatina rivestita vetrini, e sono stati colorati con ematossilina e eosina (H & E), disidratati con alcoli classificato, e di copertura scivolato con Permount.
Adiacente 70 sezioni micron ha subito una procedura standard di immunofluorescenza per rilevare proteina acida gliale fibrillare (GFAP), che si esprime con astrociti durante il processo di gliosi reattiva in risposta al trauma (Ding et al, 2000;.. Ma et al, 1991). In breve, libero di fluttuare sezioni sono stati sciacquati con PBS e bloccato con il 10% normale asino siero (NDS) e il 3% di BSA in 0.1 M PBS con 0,3% Triton X-100 (PBS / Triton) per un'ora e poi incubate in coniglio anti-GFAP anticorpi (1:500; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in PBS / Triton con l'1% NDS per 12 ore a 4 ° C. Sezioni sono state poi sciacquati con PBS e incubate con Alexa Fluor ® 594 asini antirabbit anticorpo secondario (1:500; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) in PBS con 5% NDS per un'ora a temperatura ambiente. Le sezioni sono state accuratamente nuovamente sciacquati con PBS e di contrasto con NeuroTrace ® verde fluorescente Nissl macchia (1:500 in PBS per 5 minuti; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR). Dopo un ultimo risciacquo con PBS, le sezioni sono state montate su gelatina rivestita diapositive e coperti con Slow-Fade (Molecular Probes). Tutte le microfotografie sono state acquisite usando un microscopio Zeiss Axioskop con AxioVision software (Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY).
Risultati
In vitro
Prima della valutazione negli animali, tre sistemi microinfusion sono stati preparati mettendo la loro rapida verde pieno di MOP in in un compartimento (15 ml tubo) e mettere le loro microcannule in un secondo scomparto (1 ml Epp Endorf tubo), entrambi contenenti soluzione salina sterile a 37 ° C. Ogni sistema ha dimostrato flusso continuo di tintura oltre 12 ore di osservazione. Figura 4 illustra la funzione di un tipico sistema oltre 3 ore.
Figura 4: In dimostrazione in vitro della funzione microinfusion sistema. (A) Flusso di Fast colorante verde è facilmente visibile senza ostacoli dalla microcannula all'inizio di un periodo di test in vitro. (B) Come il flusso continua, la soluzione diventa satura serbatoio (B) e, infine, opaco con colorazione (C).
Valutazione del sistema di microinfusion vivo
Dopo la perfusione, la microcannule rimosse e le loro connessioni sono stati accuratamente controllati, e tutti sono risultati del tutto intatto. Così, si verificò nessuna rottura del vetro borosilicato all'interno dei tessuti, né ci sono stati dei difetti nelle connessioni dei componenti del sistema. A 10. L salina siringa Hamilton con un breve tratto di tubo in silicone attaccato al suo ago è stato usato per applicare leggera corrente fino alla fine taglio del tubo in polietilene attaccato al microcannula. Tutti e dodici i microcannule permesso flusso continuo e non sembrano essere ostruito. Inoltre, dopo aver rimosso ogni MOP dagli animali, il volume della soluzione rimanente è stata misurata ed è risultata essere appropriato per la portata della MOP è (0,125 microlitri / ora) e la quantità di tempo è stato permesso il funzionamento.
Nella consegna vivo
Valutazione delle sezioni coronali di tessuto intriso di verde veloce dimostrato poca variabilità nella distribuzione tra gli animali all'interno dei gruppi in un punto qualsiasi momento (12 ore, 1 giorno, 2 giorni e 4 giorni). La Figura 5 illustra aree rappresentative di Fast diffusione verde in questi punti tempo mostra un progressivo aumento infiltrazione colorante in quattro giorni. Da notare che gli esperimenti precedenti con concentrazioni più elevate di Fast verde (ad esempio, 5 - 15%) ha portato a una rapida opacizzazione del parenchima, occultando così accurata valutazione della funzione del sistema microinfusion nel tempo. Mentre la misura massima di diffusione colorante 1% può essere difficile determinare con precisione in materia di ispezione al lordo, le aree di infiltrazione erano facilmente distinguibili a ingrandimento 2.5X, e sono indicate con linee tratteggiate in Figura 5.
Figura 5: In demonstation vivo di microinfusion sostenuta del verde veloce. (A) Dodici ore dopo il posizionamento intrastriatal di un veloce sistema di Green-caricato microinfusion, colorante è visto diffondendo nel parenchima circostante il sito microcannula. Osservazioni a 1 giorno (B), 2 giorni (C), e 4 giorni (D) indicano la consegna continua di Fast soluzione verde con aree crescenti di infiltrazione colorante. Il limite esterno di diffusione è stato osservato in microscopia a bassa potenza ed è indicato qui con linee tratteggiate. Scala grafica, 2 mm.
Valutazione del trauma e gliosi reattiva
Osservazione lordo di appena tagliata, sezioni di tessuto senza macchia ha mostrato che il sistema microinfusion ha comportato una riduzione nei traumi localizzati presso il sito della consegna. La cannula standard è stato sempre visto di distruggere e spostare una maggiore area di tessuto (Fig. 6B e C), che è meglio apprezzata a più alta potenza con H & E (Fig. 6D & E). Inoltre, il sangue è stato spesso visto accumulato al sito di infusione standard (Fig. 6D), suggerendo un maggior grado di compromettere il sistema vascolare e che implica l'integrità diminuzione della barriera emato-encefalica.
Il sistema microinfusion ha comportato, notevolmente ridotti gliosi reattiva come dimostrato dalla diminuzione immunoreattività per GFAP nelle vicinanze di infusione attraverso un microcannula (Fig. 6G) rispetto ad una cannula standard (Fig. 6F). Mentre microcannula indotta colorazione GFAP è stata elevata al di sopra dei livelli normali (Fig. 6H), l'escalation impressionante di gliosi reattiva con standard di posizionamento cannula e infusione (6F) non è stato visto quando il sistema microinfusion è stato impiegato.
cannula Ivery dopo 5 giorni di infusione salina. (A) microcannula tirato da tubi in vetro borosilicato con un diametro di punta 50. M permette libero, senza restrizioni di flusso neuroattivi maggior parte degli agenti, ma è 6X più piccolo di una cannula standard di consegna (28 g, 0,30 mm). (B, C) senza macchia, monta bagnato di sezioni coronali (spessore, 70. M) che illustrano un danno maggiore del tessuto locale (frecce) causata da uno standard cannula (B) rispetto ad un microcannula (C). (D, E) microfotografie potenza superiore di sezioni H & E macchiato mostrato in B e C, rispettivamente. Lo standard cannula causato più ampia lesione traumatica come illustrato in D, dopo aver spostato una zona più ampia del tessuto e causando una maggiore insulto al sistema vascolare, come dimostrato dalla raccolta di sangue all'interno della cavità della lesione (freccia). La lesione causata dal microcannula, tuttavia, è notevolmente più piccolo e meno dannoso per i tessuti nel sito di infusione. (F, G, H) Immunofluorescenza contro GFAP dimostra drammaticamente aumento del numero di astrociti GFAP + intorno alla lesione della cannula standard (F) rispetto a quella del microcannula (G) e normale, striato unlesioned (H). Barre di scala: A & B, 1 mm; D - H, 250 m. "/>.
Figura 6: trauma localizzato causato da un microcannula rispetto ad una cannula di consegna standard dopo 5 giorni di infusione salina. (A) microcannula tirato da tubi in vetro borosilicato con una punta di diametro 50 micron permette libero, senza restrizioni di flusso neuroattivi maggior parte degli agenti, ma è 6X più piccolo di una cannula standard di consegna (28 g, 0,30 mm). (B, C) senza macchia, monta bagnato di sezioni coronali (spessore, 70 micron) che illustrano un danno maggiore del tessuto locale (frecce) causata da una cannula standard (B), rispetto ad un microcannula (C). (D, E) microfotografie potenza superiore di sezioni H & E macchiato mostrato in B e C, rispettivamente. Lo standard cannula causato più ampia lesione traumatica come illustrato in D, dopo aver spostato una zona più ampia del tessuto e causando una maggiore insulto al sistema vascolare, come dimostrato dalla raccolta di sangue all'interno della cavità della lesione (freccia). La lesione causata dal microcannula, tuttavia, è notevolmente più piccolo e meno dannoso per i tessuti nel sito di infusione. (F, G, H) Immunofluorescenza contro GFAP dimostra drammaticamente aumento del numero di astrociti GFAP + intorno alla lesione della cannula standard (F) rispetto a quella del microcannula (G) e normale, striato unlesioned (H). Barre di scala: A & B, 1 mm; D - H, 250 micron.
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Discussion
Vari studi hanno dimostrato che diminuendo le dimensioni della cannula di consegna per infusioni intracerebrale, traumi dei tessuti e insulto alla barriera emato-encefalica sono ridotte (Perry et al., 1993), l'infiammazione è diminuita e la risposta immunitaria attenuato (Finsen et al gliosi., 1991), e reattiva è diminuita (Nikkhah et al., 1994). Vi presentiamo qui un metodo per la consegna cronica di agenti neuroattivi all'interno del cervello attraverso un microcannula con un diametro che si riduce di 6 volte rispetto a quella di cannule consegna convenzionalmente utilizzati. Abbiamo dimostrato che questo sistema offre una soluzione affidabile rappresentante nel corso del tempo e il livello di traumi localizzati e gliosi reattiva è drasticamente ridotto. Questi studi hanno impiegato una cannula di consegna con un diametro punta finale di 50 m, tuttavia, punta diametri più piccoli possono essere utilizzati. La virtù principale di sistemi microinfusion tale è la loro capacità di fornire agli agenti di molto piccoli, discreti traguardi, mentre incorrere in traumi minimi in prossimità di infusione.
Il microcannule utilizzati nella costruzione del sistema di infusione che descriviamo può essere facilmente personalizzato costruito con lunghezze e diametri predeterminati punta. Il sistema microinfusion è inoltre conforme alla superficie del cranio dell'animale permettendo sicura, a basso profilo fissazione e precludendo la necessità di un piedistallo di grandi dimensioni del cranio. La ferita chirurgica può quindi essere facilmente suturato sopra il piedistallo microinfusion snella, riducendo così il disagio per l'animale e il rischio di infezione. Inoltre, il sistema di fissaggio al cranio richiede meno superficie del cranio, quindi, ulteriori procedure o successive possono essere eseguite senza interferenze da parte di un piedistallo più grande.
Si dovrebbe, comunque, tener conto di alcune considerazioni tecniche quando impiegando la metodologia descritta qui. Un più elevato livello di abilità è necessaria, e la procedura di produzione e l'impianto è meno tempo efficiente di quanto lo può essere per sistemi di infusione standard. D'altra parte, questo può essere superato, o almeno controbilanciato, per il momento (e animali) risparmiati attraverso la pratica di alta precisione tecnica. Un'altra difficoltà è che, mentre il microcannula può essere personalizzato con qualsiasi diametro, un microcannula con un lume molto piccoli possono ostruirsi, sia per i componenti del infusate o da tessuto incontrati durante l'impianto (ad esempio, sangue, tessuto cerebrale). Questo rischio si riduce tenendo la punta microcannula inumidito (ad esempio, utilizzando un acqua o soluzione salina satura batuffolo di cotone per l'essiccamento della soluti infusate) durante la procedura di impianto ed effettuando pulito, "sangue-free" un intervento chirurgico.
Si consiglia il ricercatore stabilire un diametro punta microcannula che è appropriato per la particolare composizione e / o la viscosità della soluzione che verrà caricato nel MOP. Questo è facilmente ottenibile utilizzando un sistema di test in vitro simile a quello descritto nel protocollo (Fig. 4), o semplicemente immergendo il sistema assemblato in un bagno a 37 ° C salina e il monitoraggio della composizione del bagno e / o la misura del volume dei contenuti MOP nel tempo. Uno svantaggio è che la microcannula è relativamente fragile, soprattutto se il suo diametro punta è molto piccolo (ad esempio, ~ 10-50 micron). Accidentalmente rompere il microcannula durante l'intervento chirurgico di solito richiede che l'intero sistema da sostituire, come la riparazione o la ricostruzione di tale unità sarebbe estendere il tempo di intervento chirurgico in modo considerevole. Gli scienziati esperti in tali tecniche e metodi che pratica esigenti raramente rottura esperienza, comunque.
Al termine della sperimentazione, il sistema microinfusion può essere ispezionata per garantire che il microcannula non è stato danneggiato e che è rimasto brevetto. Il volume della mini-pompa osmotica può essere misurata anche per assicurare che la giusta quantità di agente neuroattivi è stato consegnato, si sconsiglia di riciclo o riutilizzo delle pompe, comunque. Mentre i metodi presenti sono state dimostrate in ratti adulti, l'uso di un sistema che riduce il trauma e richiede meno superficie del cranio per il fissaggio può essere considerato preferibile rispetto ai metodi tradizionali per gli esperimenti con animali più piccoli, come i topi o ratti giovani.
Anche se il metodo attuale richiede un livello un po 'più avanzato di competenza e abilità dallo sperimentatore, offre per aumentare la precisione, forse da un ordine di grandezza, e di ridurre al minimo confonde sperimentali associate a traumi alla regione di interesse. Nel nostro laboratorio, abbiamo scoperto che questo si traduce in effetti più affidabile e robusto dell'intervento sperimentale.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Mini-osmotic pumps (MOPs) | Tool |  ALZET |
model #1002 | |
| Electrode puller | Tool | Stoelting Co. | ||
| Borosilicate tubing | Surgery | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-6 | |
| Microforceps | Surgery | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Polyethylene tubing | Surgery | Plastics One | #C312 VT | |
| LumaBond | Reagent | myNeuroLab, Inc |
References
- Berretta, S., Lange, N., Bhattacharyya, S., Sebro, R., Garces, J., Benes, F. M. Long-term effectsof amygdala GABA receptor blockade on specific subpopulations of hippocampalinterneurons. Hippocampus. 14, 876-894 (2004).
- Clinton, S. M., Sucharski, I. L., Finlay, J. M. Desipramine attenuates working memoryimpairments induced by partial loss of catecholamines in the rat medial prefrontal cortex. Psychopharmacology. 183, 404-412 (2006).
- Cooley, R., et al. Stereotaxic surgery in the rat. , A.J. Kirby Co. Ontario, Canada. (1990).
- Di Benedetto, M., Feliciani, D., D'Addario, C., Izenwasser, S., Candeletti, S. Romualdi P.Effects of the selective norepinephrine uptake inhibitor nisoxetine on prodynorphin geneexpression in rat CNS. Brain Res Mol Brain Res. 127, 115-120 (2004).
- Ding, M., Haglid, K. G., Hamberger, A. Quantitative immunochemistry on neuronal loss,reactive gliosis and BBB damage in cortex/striatum and hippocampus/amygdala aftersystemic kainic acid administration. Neurochemistry international. 36, 313-318 (2000).
- Finsen, B. R., Sorensen, T., Castellano, B., Pedersen, E. B., Zimmer, J. Leukocyte infiltrationand glial reactions in xenografts of mouse brain tissue undergoing rejection in the adultrat brain. A light and electron microscopical immunocytochemical study. JNeuroimmunol. 32, 159-183 (1991).
- Gliddon, C. M., Darlington, C. L., Smith, P. F. Effects of chronic infusion of a GABAA receptoragonist or antagonist into the vestibular nuclear complex on vestibular compensation inthe guinea pig. J Pharmacol Exp Ther. 313, 1126-1135 (2005).
- Hauss-Wegrzyniak, B., Dobrzanski, P., Stoehr, J. D., Wenk, G. L. Chronic neuroinflammation in rats reproduces components of the neurobiology of Alzheimer's disease. Brain Res. 780, 294-303 (1998).
- Kim, H. S., Choi, H. S., Lee, S. Y., Oh, S. Changes of GABA(A) receptor binding and subunitmRNA level in rat brain by infusion of subtoxic dose of MK-801. Brain Res. 880, 28-37 (2000).
- Kim, S. Y., Chudapongse, N., Lee, S. M., Levin, M. C., Oh, J. T., Park, H. J., Ho, I. K. Proteomicanalysis of phosphotyrosyl proteins in morphine-dependent rat brains. Brain Res MolBrain Res. 133, 58-70 (2005).
- Lockman, P. R., McAfee, G., Geldenhuys, W. J., Schyf, C. J., Abbruscato, T. J., Van Allen, D. D. der Schyf CJ, Abbruscato TJ, Allen DD.Brain uptake kinetics of nicotine and cotinine after chronic nicotine exposure. J Pharmacol Exp Ther. 314, 636-642 (2005).
- MA, K. C., Chang, Z. H., Shih, H., Zhu, J. H., Wu, J. Y. The compensatory 'rebound' of reactiveastrogliosis: glial fibrillary acidic protein immunohistochemical analysis of reactiveastrogliosis after a puncture wound to the brain of rats with portocaval anastomosis. Acta neuropathologica. 82, 72-77 (1991).
- Marchalant, Y., Rosi, S., Wenk, G. L. Anti-inflammatory property of the cannabinoid agonistWIN-55212-2 in a rodent model of chronic brain inflammation. Neuroscience. 144, 1516-1522 (2007).
- Naert, G., Ixart, G., Tapia-Arancibia, L., Givalois, L. Continuous i.c.v. infusion of brainderivedneurotrophic factor modifies hypothalamic-pituitary-adrenal axis activity,locomotor activity and body temperature rhythms in adult male rats. Neuroscience. 139, 779-789 (2006).
- Nikkhah, G., Olsson, M., Eberhard, J., Bentlage, C., Cunningham, M. G., Bjorklund, A. Amicrotransplantation approach for cell suspension grafting in the rat Parkinson model: adetailed account of the methodology. Neuroscience. 63, 57-72 (1994).
- Perry, V. H., Andersson, P. B., Gordon, S. Macrophages and inflammation in the centralnervous system. Trends Neurosci. 16, 268-273 (1993).
- Radecki, D. T., Brown, L. M., Martinez, J., Teyler, T. J. BDNF protects against stress-inducedimpairments in spatial learning and memory and LTP. Hippocampus. 15, 246-253 (2005).
- Rosi, S., Ramirez-Amaya, V., Hauss-Wegrzyniak, B., Wenk, G. L. Chronic brain inflammationleads to a decline in hippocampal NMDA-R1 receptors. J Neuroinflammation. 1, 12-12 (2004).
- Takahashi, M., Kakita, A., Futamura, T., Watanabe, Y., Mizuno, M., Sakimura, K., Castren, E., Nabeshima, T., Someya, T., Nawa, H. Sustained brain-derived neurotrophic factor upregulationand sensorimotor gating abnormality induced by postnatal exposure tophencyclidine: comparison with adult treatment. J Neurochem. 99, 770-780 (2006).
- Williams, L. R., Vahlsing, H. L., Lindamood, T., Varon, S., Gage, F. H., Manthorpe, M. A smallgaugecannula device for continuous infusion of exogenous agents into the brain. Experimental neurology. 95, 743-754 (1987).
- Zhang, X., Lee, T. H., Xiong, X., Chen, Q., Davidson, C., Wetsel, W. C. Ellinwood EH.Methamphetamine induces long-term changes in GABAA receptor alpha2 subunit andGAD67 expression. Biochem Biophys Res Commun. 351, 300-305 (2006).
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Neuroscienze Numero 13 mini pompa osmotica infusione cronica microcannula veloce verdeErratum
Formal Correction: Erratum: Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents.
Posted by JoVE Editors on 04/01/2012.
Citeable Link.
A correction was made to: Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents. A key reference was excluded and a revised abstract was republished.
Additional Reference:
22. Cunningham, M.G., Ames, H.M., Donalds, R.A., & Benes, F.M. Construction and implantation of a microinfusion system for sustained delivery of neuroactive agents. Journal of Neuroscience Methods 167, 213-220, doi:10.1016/j.jneumeth.2007.08.016 (2008).
Revised Abstract:
Sustained delivery of neuroactive agents is widely used in neuroscience, but poses many technical challenges. It is necessary to deliver the agent with high precision while minimizing localized trauma and inflammation. Also, the ability to customize the system to accommodate animals of different species and sizes is desirable. This video presentation demonstrates the construction of an infusion system that can be fitted to any particular research animal. The delivery microcannula diameter is approximately 10-fold smaller than most infusion cannulas presently used. This translates into enhanced accuracy and reduced trauma to the brain region under study. The delivery cannula can also be sculpted to fit the contour of the surface of the animal's skull, thereby allowing closure of the scalp incision neatly over the infusion system, precluding the need for a skull-mounted pedestal, reducing risk of infection, and ensuring a greater level of comfort to the animal. The system is assembled in an air-free environment and requires the researcher to fashion glass micropipettes with a heat source. These construction methods require special skills that are best acquired, if not in person, using video instruction. (This article is based on work first reported in J Neurosci Methods. 2008 Jan 30;167(2):213-20. Epub 2007 Aug 28.).
Original Abstract:
Experimental protocols used for chronic infusion of neuroactive agents within regions of the brain often utilize a mini-osmotic pump system. Agents are commonly delivered via a stainless steel cannula with a diameter of 0.30 mm or greater. Systems utilizing a cannula of this caliber may impose trauma to the area of interest resulting in architectural damage, thereby compromising structural integrity and normal functioning. As neuroscience inquiry becomes more sophisticated, investigation of brain structures and circuitry requires improved levels of accuracy and higher resolution. We have developed a method for the preparation and implantation of a chronic infusion system within the brain utilizing a borosilicate microcannula with a tip diameter of 50 microns. This technique reduces damage to the local environment and diminishes reactive gliosis at the site of infusion. The configuration of the microinfusion system is also able to conform to the surface of the animal's skull, precluding the need for large cranial pedestals, thus facilitating closure of the scalp incision and reducing the risk of infection. We demonstrate reliable sustained delivery of a dye having a representative molecular weight using an in vitro model and in vivo studies in rats.
