Primaria dissociato mesencefalo colture cellulari dopamina da roditori neonati

Summary

Primaria dissociato mesencefalo colture di cellule della dopamina permettono per lo studio delle caratteristiche presinaptici dei neuroni dopaminergici. Possono essere utilizzati per monitorare in tempo reale la cinetica di rilascio di dopamina e proteine ​​/ mRNA livelli di regolatori di esocitosi dopamina. Qui vi mostriamo come generare queste culture da neonati di roditori.

Abstract

La possibilità di creare colture cellulari primarie di neuroni dopaminergici permette per lo studio delle caratteristiche presinaptici dei neuroni dopaminergici in isolamento da ingresso sistemica da altre parti del cervello. Nel nostro laboratorio, usiamo questi neuroni per valutare la cinetica di rilascio di dopamina amperometria utilizzando fibra di carbonio, così come i livelli di espressione di geni correlati dopamina e proteine ​​mediante PCR quantitativa e immunocitochimica. In questo video vi mostriamo come si generano queste culture da neonati di roditori.

Il processo prevede diverse fasi, tra cui la placcatura di corticale astrociti gliali, il condizionamento dei mezzi di coltura delle cellule neuronali del substrato gliale, la dissezione del mesencefalo nei neonati, la digestione, l'estrazione e la placcatura dei neuroni della dopamina e l'aggiunta di fattori neurotrofici per garantire la sopravvivenza delle cellule.

Le applicazioni adatte per tali preparati sono elettrofisiologia, immunocitochimica, PCR quantitativa, microscopia video (ad es, in tempo reale fusione vescicolare con la membrana plasmatica), saggi di vitalità cellulare e di altri schermi tossicologico.

Protocol

Preparazione precedente la Cultura

Nota: le cellule gliali ** deve essere placcato con largo anticipo in modo da avere il tempo di proliferare e coprire il fondo dei piatti. Per mouse con atipica o sperimentale background genetico, assicurarsi di corrispondere culture gliali e neuroni in termini di genotipo.

Nota: ** 1-7 giorni prima della dissezione, preparare fresca media neuronale e sostituire il supporto gliali nei piatti con 2 ml.

Note: ** Il giorno prima della dissezione, i seguenti elementi devono essere lasciati ai raggi UV durante la notte:

• 4 piastre di dissezione
• 2 flaconi dissociazione con un micro-magnetico ancoretta
• 2 tappi flaconcino (con 2 piccoli fori infilò nella parte superiore)
• Stendere anelli scorrimento (e cappotto in 70% EtOH) - lasciare la finestra aperta anche
• ALMENO 2 scatole piene di colore giallo (10-200μl) puntali
• 1 confezione di blu (100-1000μl) puntali

Giornata della Cultura

Nota: * Assicurarsi di non toccare nulla che è stato lasciato OUT PER UV NOTTE!

Mantenimento di un ambiente sterile sotto il cofano è molto importante.

1) Set Up:

Nota: ** Mettere da parte tutti gli ingredienti congelati per rendere soluzione papaina.

1. Pinze pulite, con il 70% EtOH. Coprire ogni punta con una punta sterile pipetta gialla. Utilizzato per effettuare gli anelli scivolare sterili nella loro scatola.
2. Placca di cottura:
   1. Posizionare un piatto mini-magnetic/hot sotto il cofano con un bicchiere pieno 1000ml a 500-600ml dH ₂ O e un grande bar ancoretta magnetica.
   2. Inserire un disco di polistirolo nel bicchiere appena sopra il livello dell'acqua.
   3. Far scorrere il termometro in un piccolo foro nel disco di polistirolo. Quadrante di calore deve essere leggermente superiore al 2 (per una temperatura di 34 ° C) e mescolare il quadrante dovrebbe essere ~ 5-6.
3. PBS:
   1. Preparare PBS sterile e riempire 15 provette sterili 15ml con 4-6 ml (essere sicuri di mantenere sterile
      tecnica).
   2. Posizionare i tubi e la bottiglia magazzino su ghiaccio accanto alla cappa.
4. Carbogen:
   1. Rompere un stripette 5 ml a metà e spingerlo attraverso un tappo di gomma, quindi la punta del stripette si sporge la parte più larga del tappo.
   2. Posizionare il tappo in un pallone da 500 ml con 400-500ml dH ₂ O (fine rotto stripette dovrebbe essere nei ₂ dH O).
   3. Collegare un tubo per l'apertura laterale del pallone.
   4. Tagliare la punta fuori di un puntale giallo e collegare questo alla fine del tubo (con il lato tagliato rivolto verso l'esterno).
      
      Collegare il serbatoio CarboGen alla punta del stripette 5 ml.
      
      
5. Preparare la papaina sol'n:
   1. * Utilizzare attenta tecnica sterile.
   2. Mescolare in una sterile tubo 50ml.
6. Filtro papaina sol'n nel flaconcino dissociazione:
   1. Utilizzare una unità di filtrazione Steriflip e trasferimento in fiala dissociazione via 25ml stripette (OR posto un nuovo filtro siringa 0.2μm sulla punta di una siringa stantuffo 20ml,
      togliere lo stantuffo e utilizzare un stripette (25 ml) per trasferire tutti i sol'n papaina nella siringa.
   2. Filtro nel flacone dissociazione).
   3. Tappo del flacone, inserire una siringa sterile attraverso il foro nel tappo e porre un filtro siringa sterile 0.2μm alla base della siringa.
   4. Collegare il CarboGen al filtro e parafilm questo luogo in. Posizionare il flaconcino nel polistirolo disco / supporto.
      
      * Il micro-ancoretta magnetica deve essere in movimento.
      * Il gas DEVE essere rendendola nel flaconcino.
      * La temperatura deve stabilizzarsi a 34 ° C.
      
      
7. Dissezione di preparazione:
   1. Portare il microscopio dissezione sotto il cofano.
   2. Disporre tutti gli strumenti di dissezione su lamina di alluminio, spruzzare con il 70% EtOH, versate in eccesso e lasciare sotto il cofano ad asciugare.
8. Preparare media neuronale:
   1. Lascia 30ml di fresco media neuronale nell'incubatrice.
9. Lay out 1 grande piazza di fogli di alluminio e 12 quadrati più piccoli. Lasciare le forbici decapitazione con il foglio di alluminio. Riempire una piccola scatola di polistirolo con acqua ghiacciata e lasciare tutto al di fuori della cappa.
10. Prep l'anestesia (0.075ml ketamina e 0.075ml xzylazine).
11. Ottenere almeno 12 cuccioli (P0-P2) per 100 piastre. Per i topi, assicurarsi che vi sia una corrispondenza genotipo per l'intera cucciolata. Se il genotipo non è noto, le cellule lastra da ogni cucciolo su un piatto a parte, registrando accuratamente le cifre del mouse e di abbinarle con i piatti di coltura cellulare e assicurarsi che il background genetico del substrato gliale è uniforme in colture cellulari.

2) La dissezione

1. Anestetizzare il primo animale con un'iniezione intraperitoneale. Quando animale mostra sedazione e non risponde alla coda-flick test, metterlo in ghiaccio per 30 secondi (fino a ipotermia). Risciacquare un piccolo foglio di alluminio quadrata, Decapitation forbici, e la testa con il 70% EtOH.
2. Decapitare, permettono testa a cadere sulla piazza foglio di alluminio e passare sotto il cofano. Rimuovere delicatamente il cervello in una provetta da 15 ml di PBS ghiacciato. Posizionare il tubo di ritorno sul ghiaccio durante la rimozione del cervello successivo.
3. Ripetere questi primi passi fino a quando ci sono 3 cervelli sul ghiaccio. Versare tutti e 3 i cervelli e PBS sul piatto prima dissezione sotto il microscopio. Rimuovere sezione appropriata del cervello (VTA) e utilizzare una pipetta di trasferimento per mettere i segmenti in papaina sol'n. Avviare un timer quando i segmenti prima andare in
4. Ripetere le precedenti 3 passi fino a quando tutti i cervelli vengono digeriti in papaina. Il tempo medio di digestione deve essere di 2 ore. I segmenti prima sono stati in per circa 1 ora per il momento gli ultimi entrare,
   
   Provate a dividere la differenza.
   
   
5. * Durante la digestione:
   1. Assicurarsi che la temperatura nella vasca da bagno è di 34 ° C.
   2. Segmenti possono aderire al ancoretta in un primo momento, ma dovrebbe sparsi col passare del tempo. Se non lo fanno, toccare il fondo della fiala.

3) Triturazione:

1. Con una pipetta di trasferimento, il trasferimento dei segmenti cervello in una provetta sterile 15 ml (cercare di evitare l'eccesso papaina sol'n) e lavarli 3 volte con 2 ml di medium gliali riscaldato dal termostato. Dopo aver messo i media gliali nel tubo, consentono segmenti di stabilirsi e poi rimuovere con attenzione il sol'n più possibile senza disturbare i segmenti. Cambia pipette per evitare l'inquinamento!
   
   ** NON TENERE il sol'n che viene rimosso.
   
   
2. Con una pipetta fresca trasferimento iniziare triturazioni in 2 ml di media gliali. Triturare 25 volte (evitare di lasciare in bolle d'aria) e lasciare che il tubo di sedersi per 3 minuti fino a quando i segmenti non dissociato stabilirsi. Utilizzare una pipetta di trasferimento per rimuovere e TENERE sol'n il più possibile senza disturbare i segmenti in basso. Conservare il surnatante in un nuovo (sterile) tubo di 15m.
3. Ripetere il passaggio precedente con una pipetta 1000μl e pipettare 200μl fino a completo dissociato.
4. Triturare 10 volte con una pipetta di trasferimento, o fino a quando le cellule sono completamente risospeso in sol'n.

4) Placcatura Cellule

1. Utilizzando una punta sterile pipetta gialla che copre ogni punta della pinza, con attenzione cadere un anello diapositiva come centrato al vetro nel miglior modo possibile all'interno di ogni piatto.
2. Mettere 10μl della soluzione di cella sul emocitometro e contare. (Escludere masse spazzatura).
3. Moltiplicare il numero di celle per 10. Questo è il numero di cellule / ml. Dividere 1,000,000-1,500,000 (o densità desiderata) da questo numero. Questo è il numero di microlitri per aggiungere al piatto.
4. Utilizzare la punta della pipetta di scivolare gli anelli sul centro-bene di ogni piatto, come si aggiunge microlitri appropriato / piatto. Piastra delicatamente e passare suggerimenti per ogni piatto.
5. Aggiungere 100μl (di diluito) sol'n GDNF all'interno dell'anello scivolo di ogni piatto.
6. A questo punto, posto i vassoi nell'incubatrice e portare la media neuronale nella stanza fredda.
7. Consentono alle cellule di riposare una notte.
8. Giorno dopo: rimuovere gli anelli (con nuovi puntali sterili che copre le punte pinza per ogni piatto)
   

5) Inibizione mitotica: IL GIORNO SUCCESSIVO

1. Diluire aliquote FDU di 1:10 magazzino 1000X con l'aggiunta di 200μl magazzino FDU a 1,8 ml di MEM sterile.
2. Aggiungere 20μl diluito FDU sol'n all'anello esterno di ogni piatto. Cambia puntali spesso. Coprire e tornare alla incubatrice.
   
   * I piatti disturbare il meno possibile per i prossimi giorni 7-10. Verificare la presenza di piatti infetto e rimuovere eventuali piatti infette ai primi segni di infezione. Le culture sono pronti per i test entro 3 settimane.

MEDIA / SOLUZIONI

Media neuronale

(Per 200 ml)

** Meglio se condizione che glia da palloni durante la notte prima di utilizzarlo per lavaggi / triturazione

Ingrediente	Quantità	Note
BSA al 5%	0,5 g	Frazione V
MEM liquido	94,0 ml	Sigma
DMEM liquido	80,0 ml	Sigma
F-12 liquido	20,0 ml	Sigma
Glucosio liquido 45%	1,50 ml	Sigma soluzione
Glutammina 200mm	0,5 ml	Aliquotted Sigma soluzione
Diporzio Conc.	2,0 ml	Sigma soluzione
Liquido Catalase	0,1 ml
Acido Kynurenic 0.5M	200μl	In NaOH 1N
HCL 5N	50 microlitri

1. Unire gli ingredienti (BSA va scorso) in una 250ml bottiglia di plastica.
2. Filtro, etichetta, e conservare in frigorifero.

Acido Kynurenic
(FW = 189,2)
0.5M = 94.6mg/ml
Fai 8ml magazzino: 756.8mgKA/8ml 1N NaOH e pipettare in aliquote STERILE di 200μl

DiPorzio media

A) Conc. DiPorzio. Azioni:

BISOGNO			Combinare			Alliquot
Additivo	Solvente	Tubo	Quantità	ml	ml / tubo	Conc.	Quantità	# Aliq.
Insulina	20 mM HCL (1)	plastica	Bottiglia 250mg	10	1	25mg/ml	25mg	10
Transferrina	Hank		Bottiglia 500mg	5	1	100mg/ml	100mg	5
SOD	Hank		Bottiglia 70mg	14	1	5mg/ml	5mg	14
Putrescina	Hank		50mg	3	0,12	20mg/ml	2.4mg	21
Na 2 SeO 3	Hank		0.104mg	10	0,5	10μg/ml	5.2μg	20
T3	NaOH 10mM		2mg	10	0,1	0.20mg/ml	0mg	100
Progesterone	100% EtOH	Vetro	12.5mg	10	0,05	1.25mg/ml	Usa pipetta
Cortisolo	100% EtOH	Vetro	20mg	10	0,02	2.00mg / ml	Usa pipetta

1. 20 mM HCl = 41.5μl conc. HCl/25ml.
2. Fai magazzino 1mg/ml e aggiungere 104μl di 10ml.

B) DiPorzio di supporto di stampa:

Additivo	Quantità (ml)	Quantità (ml) X2	Conc. finale. mcg / ml	Conc. finale. Molarità
Progesterone	0,05	0,1	0,06	200nm
Cortisolo	0,02	0,04	0,04	125nM
Hank BSS	6,21	12,42
Insulina	1	2	25
Na 2 SeO 3	0,5	1	0,01	30nm
T3	0,1	0,2	0,02	30nm
SOD	1	2	5
Putrescina	0,12	0,24	2,4	15Nm
Transferrina	1	2	100

1. Utilizzare un tubo in polipropilene da 15 ml sterile per aggiungere il progesterone e cortisolo. Utilizzare una pipetta aspiratore ed il vuoto a velocità di evaporazione di EtOH: (utilizzare un stripette 5ml spezzato a metà e posto a metà strada giù nel tubo facendo molta attenzione a non aspirare il liquido EtOH pipetta Tenere saldamente in posizione con Kimwipes e poi portare la punta. verso il marchio 500μl situato sul lato del tubo.
2. Aggiungere le aliquote successive nell'ordine in cui appaiono sul grafico di cui sopra.
3. Dopo l'aggiunta di insulina, che rende la nuvoloso sol'n, aggiungere 20μl di 1N NaOH per neutralizzare il pH. Sol'n dovrebbe andare dal giallo al rosa e subito chiaro. INOLTRE, dopo l'aggiunta di transferrina, subito aggiungere 20μl di NaOH 1N, per neutralizzare il pH e prevenire la formazione di precipitati.
4. Elaborare 10ml in una pipetta sierologica e dividere in 5 aliquote (una partita).
5. Conservare @ -20 ° C.
6. Possono fare 2 partite in una sola volta.

Dissociazione media

A. papaina (per 1 fiala):

** Preparare giorno della placcatura a destra prima di dissezione.

Ingrediente	Importo </ Strong>	(Note) Conc. finale.
Cisteina acqua	7.8mL	1 mM cisteina
Papaina	Varia (* 190μl per la bottiglia di 44.0mg/ml)	20 unità / ml (400 unità totali per un valore di sol'n 20ml)
H & B conc.	2 ml
Carbogen	95% O2 + 5% di CO2
HCl 5N	10μl
0,5% rosso fenolo	20μl	0,001%
Kynurenate 0.5M	10μl	(In 1N NaOH) 0,5 mm

1. Aggiungi papaina all'acqua cisteina PRIMO.
2. Aggiungere il H & B conc., Kynurenate, HCl, e il rosso fenolo.
3. Filtro nella fiala dissociazione (come descritto nel set-up le direzioni) e connettersi al CarboGen.
   

B. H & B Concentrato (100 ml di 5X):

Ingredienti	MW	Powder/50ml H 2 O	Conc. (M)	Combina (ml)	Conc. finale. (MM)
NaCl	58,44	11,699 g	4	14,5	116
KCl	74,56	3,728 g	1	2,7	5,4
NaHCO 3	84,01	4,2 g	1	13	26
NaH 2 PO 4 * H 2 O	137,99	6,90 g	1	1	2
MgSO 4	120,38	6,019 g	1	0,5	1
EDTA (ED2-SS)	292	Sigma 5% (fare 5g/100ml stock)	0,134	0,3722	0,5
Glucosio	180	Sigma 45%	2,5	5	25
TC H 2 O				62,93

1. Combina somme da soluzioni di riserva.
2. Dividere in aliquote 4ml.
3. Aggiungi aliquota all'acqua cisteina dopo l'aggiunta di papaina.
   

C. L'acqua cisteina (157.5ml di 1X):

Ingredienti	MW	Componenti Polvere (mg)	H 2 O (ml)	Conc. magazzino. (MM)	Combina (ml)	Conc. finale. (MM)
CaCl 2	147,2	736	10	500	0,6	1.9mm
Cisteina	121,7	(1.5)	24	20mm (0.02M)	10	1,27 mm (0.88)
TC acqua					146,9

1. Fare e mantenere un sol'n stock di CaCl2 0,5 M a 4 ° C
2. Fai una sol'n uso di cisteina e combinare con altri ingredienti
3. Dividere in aliquote da 10 ml di 15,75 e conservare a 4 ° C
   

GDNF Preparazione

1. Aliquota di preparazione:
   1. Sciogliere sterile, pastiglia liofilizzata di 5μg GDNF con 2,4 ml di acqua deionizzata sterile. La concentrazione di questo sol'n GDNF = 2.08μg/mL.
   2. Distribuire il 2.08μg/mL GDNF sol'n in 76.9μl aliquote in cryovials sterile. Questo 160ng = per flaconcino.
   3. Conservare a -20 ° C.
2. Oltre alle culture:
   1. Scongelare 1 aliquota per ogni 8 piatti.
   2. Diluire un'aliquota aggiungendo 723.1μl mezzi neuronale / aliquota. Questo farà una sol'n di 160ng/800μl GDNF.
   3. Aggiungere 100μl di questo sol'n al 2 ml di mezzo in ogni piatto per una concentrazione finale di 10ng GDNF per ml.
      

FDU Preparazione

FDU-sol'n archivi 1000X:

Ingrediente	Quantità	(Note) Conc. finale.
Uridina	247 mg	16,5 mg / ml
5-FDU (5-fluorodeoxyuridine)	100 mg (bottiglia)	6,7 mg / ml
TC acqua	15 ml

1. Fai un po 'più di 15 ml di 16,5 mg / ml uridina.
2. Aggiungere 15 ml uridina sol'n a 100 mg di bottiglia FDU per fare 6,7 mg / ml sol'n FDU.
3. Dividere in aliquote da 200μl e congelare a -20 ° C.

Diluire per l'uso:

1. Inibire la crescita di cellule non neuronali. Diluire 1:10 magazzino 1000X con l'aggiunta di magazzino 200μl a 1,8 ml di MEM.
2. Aggiungere 20μl FDU diluito per l'anello al di fuori di ogni piatto. Cambia puntali spesso. Coprire e tornare alla incubatrice.

Discussion

I metodi descritti permettono di risoluzione fine delle caratteristiche morfologiche e neurochimica dei neuroni dopaminergici centrali che non sono altrimenti disponibili in un approccio sistemico o in vivo.

Materials

Materials are included in the protocol text.