Primaria dissociato mesencefalo colture di cellule della dopamina permettono per lo studio delle caratteristiche presinaptici dei neuroni dopaminergici. Possono essere utilizzati per monitorare in tempo reale la cinetica di rilascio di dopamina e proteine / mRNA livelli di regolatori di esocitosi dopamina. Qui vi mostriamo come generare queste culture da neonati di roditori.
Abstract
La possibilità di creare colture cellulari primarie di neuroni dopaminergici permette per lo studio delle caratteristiche presinaptici dei neuroni dopaminergici in isolamento da ingresso sistemica da altre parti del cervello. Nel nostro laboratorio, usiamo questi neuroni per valutare la cinetica di rilascio di dopamina amperometria utilizzando fibra di carbonio, così come i livelli di espressione di geni correlati dopamina e proteine mediante PCR quantitativa e immunocitochimica. In questo video vi mostriamo come si generano queste culture da neonati di roditori.
Il processo prevede diverse fasi, tra cui la placcatura di corticale astrociti gliali, il condizionamento dei mezzi di coltura delle cellule neuronali del substrato gliale, la dissezione del mesencefalo nei neonati, la digestione, l'estrazione e la placcatura dei neuroni della dopamina e l'aggiunta di fattori neurotrofici per garantire la sopravvivenza delle cellule.
Le applicazioni adatte per tali preparati sono elettrofisiologia, immunocitochimica, PCR quantitativa, microscopia video (ad es, in tempo reale fusione vescicolare con la membrana plasmatica), saggi di vitalità cellulare e di altri schermi tossicologico.
Protocol
Preparazione precedente la Cultura Nota: le cellule gliali ** deve essere placcato con largo anticipo in modo da avere il tempo di proliferare e coprire il fondo dei piatti. Per mouse con atipica o sperimentale background genetico, assicurarsi di corrispondere culture gliali e neuroni in termini di genotipo. Nota: ** 1-7 giorni prima della dissezione, preparare fresca media neuronale e sostituire il supporto gliali nei piatti con 2 ml. <p clas…
Discussion
I metodi descritti permettono di risoluzione fine delle caratteristiche morfologiche e neurochimica dei neuroni dopaminergici centrali che non sono altrimenti disponibili in un approccio sistemico o in vivo.
Acknowledgements
Il lavoro è stato supportato da DK065872 (PEV), una famiglia Smith Award Foundation di eccellenza nella ricerca biomedica (PEV), F31 DA023760 (BMG, PEV) e P30 NS047243 (Tufts Center for Neuroscience Research).
Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates. J. Vis. Exp. (21), e820, doi:10.3791/820 (2008).