在人类胚胎干细胞体外培养的标签用于磁共振成像

Summary

在这段视频中，我们展示了如何标注人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）与氯化锰（MnCl

Abstract

人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）已经证明能够恢复受伤的心肌。磁共振成像（MRI）已成为主要的成像方法之一来评估受伤的心肌恢复。此外，前体内标签剂，如氧化铁纳米粒子，已被用于跟踪和本地化移植的干细胞。但是，这种方法不监视一个基本的细胞生物学特性，细胞移植的可行性。它已经知道，氯化锰（MnCl _2）进入细胞，通过电压门控钙（ ^钙离子）当细胞生物活性的渠道，并积累细胞^内产生T 1缩短的效果。因此，我们建议，锰制导MRI可有用的监视后的人类胚胎干细胞移植到心肌细胞的活力。

在这段视频中，我们将展示如何与MnCl ₂和如何使用MRI体外，这些细胞可以清楚地看到标签的人类胚胎干细胞。与此同时，生物活性的Ca ^{2 +}渠道将调制利用双方的Ca ^{2 +}通道激动剂和拮抗剂，以评估随之而来的信号变化。

Protocol

人类胚胎干细胞的锰标签

1. Trypsinize馈线免费5分钟的条件已在培养的人类胚胎茎。中加入文化传媒的胰蛋白酶。
2. 旋转下降的细胞，离心5分钟800转20摄氏度。重新悬浮的细胞沉淀后，通过台盼蓝染色计数细胞数量。根据获得的细胞计数，分为四个等分3万到锥形管的细胞的细胞。沉淀细胞再次离心。
3. 之前开始锰标签，氯化锰溶于0.9％氯化钠溶液做一个0.1mm的氯化锰溶液新鲜。
4. 为了观察钙离子通道的活动，4个样品的准备。第一个范例，是我们所能控制的，其中包含0.9％的氯化钠单独细胞。第二个样本含有细胞在0.1毫米MnCl _2。样品3和4包含在0.1毫米MnCl ₂或者5μM的Ca ^{2 +}通道激动剂孵育细胞，（S )-(-)-湾K8644，或250μM的Ca ^{2 +}通道阻滞剂，维拉帕米。 4个样品在37摄氏度5％CO ₂ 30分钟。
5. 30分钟后，降速为5分钟800转的细胞在20摄氏度。然后吸出上清液，用PBS洗两次标记的细胞。洗涤后，重新挂起用200μLPBS和转移到PCR管，每个颗粒。这些颗粒通常为白色。

铁人类胚胎干细胞的标记

1. 临床级硫酸鱼精蛋白与蒸馏​​水混合，得到1毫克/毫升的原液。
2. 在一个包含人类胚胎干细胞培养基的试管中，加增加12微克/毫升硫酸鱼精蛋白在100微克/毫升ferumoxides。混合的解决方案，大力为五分钟。
3. 混合溶液中加入等量的细胞培养介质，实现了终浓度为50微克/毫升的ferumoxides和6微克/毫升，硫酸鱼精蛋白标签细胞。在这12小时的解决方案，孵育细胞。
4. 两次用PBS清洗细胞，与去年洗含10U/ml肝素解散外ferumoxides硫酸鱼精蛋白复合物。洗涤后，trypsinize细胞获得单细胞悬液。
5. 计数细胞和分装到所需数量的样品。洗涤后，重新挂起用200μLPBS和转移到PCR管，每个颗粒。这些颗粒应该是深橙色棕色。

执行蜂窝磁共振成像

1. 设为一个幽灵，以稳定管细胞沉淀和从周围的空气，以避免在扫描文物。要做到这一点，琼脂0.8％和1％硫酸铜的蒸馏水混合，煮沸5-7分钟微波。至少1个小时前的扫描达到凝胶冷却该混合物。
2. 含有标记的细胞沉淀的试管放置在幽灵进行扫描。在体外细胞MRI Signa的HDX 3T MRI（GE医疗系统），通过临床膝关节线圈。
3. 扫描为每个使用自旋回波序列的三个样品的锰标记细胞：TR;重复时间= 800毫秒。 TE的回波时间=最低，视野，视野= 12 × 12厘米;矩阵= 256 × 256，NEX 1。
4. 使用梯度回波序列扫描铁标记的细胞。我们使用这种成像以下参数：TR = 100毫秒，TE = 10毫秒，足总杯;翻转角= 30 °; FOV = 12 × 12厘米;矩阵= 256 × 256，NEX 1。

MRI结果分析

1. 从4不同样品的锰标记细胞分析MRI扫描的图像：
   • 示例＃1是我们所能控制的，其中包含在0.9％氯化钠单独细胞。
   • 样品＃2包含0.1毫米MnCl ₂细胞。
   • 样品＃3包含在0.1毫米MnCl ₂ 5微米的Ca ^{2 +}通道激动剂，（S )-(-)-湾K8644孵育细胞。
   • 样品＃4包含在0.1毫米MnCl ₂培养细胞的Ca ^{2 +}通道阻滞剂，维拉帕米与250微米。
2. 据预测，从锰标记的细胞信号强度的差异是可见的。标记与锰纯粹的细胞相比，信号强度明显增加的钙离子通道激动剂的存在和在钙离子通道拮抗剂的存在减少。锰标记的细胞面积增加信号强度测量用Image J（美国国立卫生研究院，美国马里兰州贝塞斯达，）。相同的软件，用于分析暗铁标记细胞的共振信号领域。黑暗从铁标记的细胞信号的大小取决于细胞或细胞中的铁粒子的数目。在这种情况下，一万个单元格显示的暗信号相比，从三百万细胞的信号较小的区域。

Discussion

这些结果表明，锰输入通过电压门控性钙通道，锰可作为MRI造影剂的使用，还可以显示细胞活力。因此，我们建议，锰制导MRI可有用的监视后，人类胚胎干细胞移植到心肌细胞活力。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Manganese chloride tetrahydrate	Reagent	Sigma-Aldrich	M8054
(S)-(-)-Bay K8644	Reagent	Sigma-Aldrich	B133
(+)-Verapamil hydrochloride, minimum 99.0% titration	Reagent	Sigma-Aldrich	V4629
Sodium Chloride 0.85-0.90% W/V	Reagent	VWR international	VW 3257-1
Feridex I.V.	Reagent	Berlex Laboratories	NDC 59338-7035-5	ferumoxides injectable solution 11.2mg iron/mL
Protamine sulfate	Reagent	American Pharmaceutical Partners	NDC 63323-229-05	50 mg (10 mg/mL)
Knockout SR (Serum replacement for ES cells)	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10828
DMEM/F12 (1:1)	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11330
2- mercapt–thanol 98+%	Reagent	Sigma-Aldrich	M 3148
L-Glutamine 200mM 100x	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25030
Penicillin-Streptomyocin 10,000 units/ml	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
MEM Non-Essential Amino Acids 100x solution	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11140
Signa HDx 3T MRI	Tool	GE Healthcare
clinical Knee coil	Tool	GE Healthcare
DPBS	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14190