Summary
Bu video, manganez klorür ile insan embriyonik kök hücreleri (hESC) (MnCl etiket nasıl gösteriyor
Abstract
İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC) yaralı miyokardın geri yeteneğini göstermiştir. Manyetik rezonans görüntüleme (MRG), yaralı miyokardın yeniden değerlendirmek için baskın görüntüleme yöntemlerinin biri olarak ortaya çıkmıştır. Ayrıca, demir-oksit nano gibi ex-vivo etiketleme ajanlar, izlemek için istihdam ve nakledilen kök hücrelerin lokalize edilmiştir. Ancak, bu yöntem nakledilen hücrelerin canlılığı ile ilgili temel bir hücre biyolojisi özelliği izlemez. Manganez klorür (MnCl 2) voltaj bağımlı kalsiyum (Ca 2 +) hücreleri biyolojik olarak aktif kanallar aracılığıyla hücrelere girer ve T 1 kısalma efekti oluşturmak için intraselüler olarak birikir bilinmektedir. Bu nedenle, mangan güdümlü MRG miyokard içine hESC nakli sonra hücre canlılığı izlemek için yararlı olabilir öneririz.
Bu video, MnCl 2 ve nasıl bu hücrelerin in vitro MRI kullanarak açıkça görüleceği hESC etiket nasıl gösterecektir. Aynı zamanda, biyolojik aktivite Ca 2 + kanalları eşlik eden sinyal değişiklikleri değerlendirmek için Ca 2 + kanal agonist ve antagonist kullanan modüle olacaktır.
Protocol
İnsan Embriyonik Kök Hücre Manganez Etiketleme
- Besleyici 5 dakika için koşullar kültüre sahip insan embriyonik kaynaklanıyor Trypsinize. Kültür ortamı ekleyerek tripsin nötralize.
- 20 800 rpm'de 5 dakika santrifüj hücreleri aşağı Spin ° C. Yeniden askıya hücre pelletini sonra, Tripan mavisi hücre sayısını. Elde edilen hücre sayımı dayanarak, dört alikotları konik tüpler içine 3 milyon hücre içine hücreleri bölün. Santrifüj tekrar Pelet hücreleri.
- Sadece manganez etiketleme başlamadan önce,% 0.9 sodyum klorür solüsyonu 0.1mm manganez klorür çözeltisi yapmak için taze manganez klorür çözülür.
- Kalsiyum kanal aktivitesini izlemek amacıyla dört örnekleri hazırlanmıştır. Ilk örnek, sadece% 0.9 sodyum klorür içinde inkübe hücreler içerir bizim kontrolümüz. Ikinci örnek, 0.1 mM MnCl 2 inkübe hücreler içerir . Örnek 3 ve 4, Ca 2 + kanal agonist ile 5 mcM 0.1 mM MnCl 2 inkübe hücre (ler )-(-)- Bay K8644, ya da Ca 2 +-kanal antagonisti olan verapamil 250 mcM içerir . 37 dört örnekleri inkübe ° 30 dakika süreyle% 5 CO2 ile Celcius.
- 30 dakika sonra, 20 ° C de 5 dakika boyunca 800 rpm'de hücreler aşağı doğru döndürün. Sonra süpernatant aspirat ve etiketli hücreler PBS ile iki kez yıkayın. 200 mcL PBS ve transfer ile yıkadıktan sonra, PCR tüpleri içine her pelet yeniden askıya. Bu pelet genellikle beyazdır.
İnsan Embriyonik Kök Hücre Demir Etiketleme
- Klinik dereceli protamin sülfat 1 mg / mL stok çözelti elde etmek için saf su ile karıştırın.
- Insan embriyonik kök hücre kültür ortamı içeren bir tüp, 12 mcg / ml protamin sülfat eklenmesi ile 100 mcg / mL ferumoxides ekleyin. Beş dakika boyunca şiddetle çözüm karıştırın.
- 50 mcg / ferumoxides ml ve 6 mg / ml protamin sülfat etiket hücrelere son bir konsantrasyon elde etmek için hücre kültürü medya eşit miktarda karışık çözüm ekleyin. 12 saat boyunca bu çözüm hücreleri inkübe edin.
- 10U/ml heparin içeren ekstrasellüler ferumoxides protamin sülfat kompleksi çözmek için son yıkama, hücreler PBS ile iki kez yıkayın. Yıkadıktan sonra, hücreler tek bir hücre süspansiyonu elde etmek trypsinize.
- Gerekli sayıda numune içine hücreleri ve kısım güvenin. 200 mcL PBS ve transfer ile yıkadıktan sonra, PCR tüpleri içine her pelet yeniden askıya. Bu pelet turuncu rengi koyu kahverengi olmalıdır.
Hücresel Manyetik Rezonans Görüntüleme Sahne
- Hücre pelletleri içeren tüpleri stabilize etmek ve aynı zamanda çevredeki havadan tarama sırasında bozulmaları önlemek için bir hayalet olun. Bunu yapmak için, agar% 0.8 ve% 1 bakır sülfat distile su ile karıştırın ve 5-7 dakika mikrodalga kaynatın getirmek. En az 1 saat önce bir jel ulaşmak için tarama için bu karışımı soğutun.
- Tarama için hayalet etiketli hücre pelletleri içeren tüpler yerleştirilir. In vitro hücre MRG klinik diz bobin kullanarak Signa HDX 3T MR (GE Medical Systems) yapılır.
- Her bir spin eko sekansı kullanarak üç örnek için manganez etiketli hücreleri Tarama: TR Tekrar süresi = 800 milisaniye. TE; Echo zaman = en az, FOV, görüş alanı = 12 x 12 cm; matrix = 256x256, 1 NEX.
- Gradient-eko sekansı ile demir etiketli hücreleri tarayın. Bu görüntüleme için aşağıdaki parametreleri kullanın: TR = 100 msn, TE = 10 msn, FA, flip angle = 30 °; FOV = 12 x 12 cm; matriks = 256 x 256, 1 NEX.
MR Sonuçlar Analizi
- Manganez etiketli hücreleri, 4 farklı örneklerinden MRI tarama görüntüleri analiz:
- Örnek # 1, yalnız% 0.9 sodyum klorür içinde inkübe hücreler içerir bizim kontrolümüz.
- Örnek # 2, 0.1 mM MnCl 2 inkübe hücreleri içerir .
- Örnek # 3 5 mcM, Ca 2 +-kanal agonist (s )-(-)- Bay K8644 ile 0.1 mM MnCl 2 inkübe hücreler içerir.
- Örnek # 4 Ca 2 +-kanal antagonisti olan verapamil 250 mcM ile 0.1 mM MnCl 2 inkübe hücreler içerir.
- Tahmin ettiğimiz gibi, manganez etiketli hücreleri sinyal intensitesi farklılıklar görülebilir. Mangan tamamen etiketli hücreleri ile karşılaştırıldığında, kalsiyum kanal agonist varlığı açıkça sinyal yoğunluğu artar ve kalsiyum kanal antagonisti varlığı azalır. Manganez etiketli hücreler için sinyal yoğunluğu artmıştır alan Image J (NIH, Bethesda, MD, ABD) kullanılarak ölçülür. Aynı yazılım alanında demir etiketli hücreleri koyu off-rezonans sinyali analiz etmek için kullanılır. Demir-işaretli hücrelerin karanlık sinyal boyutu, hücre veya hücrelerin içerdiği demir parçacıklarının sayısı sayısına bağlıdır. Bu durumda, Bir milyon hücre karanlık sinyal üç milyon hücre sinyal göre daha küçük bir alanı gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu sonuçlar, manganez de hücre canlılığı gösterebilir voltaj kapılı kalsiyum kanal ve manganez MRG kontrast madde olarak kullanılan, yoluyla girin. Göstermektedir. Bu nedenle, mangan güdümlü MRG, insan embriyonik kök hücre transplantasyonu sonrası miyokard hücre canlılığı izlemek için yararlı olabilir öneririz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Manganese chloride tetrahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | M8054 | |
| (S)-(-)-Bay K8644 | Reagent | Sigma-Aldrich | B133 | |
| (+)-Verapamil hydrochloride, minimum 99.0% titration | Reagent | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Sodium Chloride 0.85-0.90% W/V | Reagent | VWR international | VW 3257-1 | |
| Feridex I.V. | Reagent | Berlex Laboratories | NDC 59338-7035-5 | ferumoxides injectable solution 11.2mg iron/mL |
| Protamine sulfate | Reagent | American Pharmaceutical Partners | NDC 63323-229-05 | 50 mg (10 mg/mL) |
| Knockout SR (Serum replacement for ES cells) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828 | |
| DMEM/F12 (1:1) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330 | |
| 2- mercapt–thanol 98+% | Reagent | Sigma-Aldrich | M 3148 | |
| L-Glutamine 200mM 100x | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Penicillin-Streptomyocin 10,000 units/ml | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100x solution | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140 | |
| Signa HDx 3T MRI | Tool | GE Healthcare | ||
| clinical Knee coil | Tool | GE Healthcare | ||
| DPBS | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190 |
References
- Bruvold, M., Nordhoy, W., Anthonsen, H. W., Brurok, H., Jynge, P. Manganese-calcium interactions with contrast media for cardiac magnetic resonance imaging: a study of manganese chloride supplemented with calcium gluconate in isolated Guinea pig hearts. Invest Radiol. 40, 117-125 (2005).
- Aoki, I., et al. Cell labeling for magnetic resonance imaging with the T1 agent manganese chloride. NMR Biomed. 19, 50-59 (2006).
- Arbab, A. S., et al. Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI. Blood. 104, 1217-1223 (2004).
- Arbab, A. S., Frank, J. A. Cellular MRI and its role in stem cell therapy. Regen Med. 3, 199-215 (2008).
