Summary
Dans cette vidéo, nous montrons comment étiqueter cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) avec du chlorure de manganèse (MnCl
Abstract
Cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) ont démontré la capacité de restaurer les blessés du myocarde. Imagerie par résonance magnétique (IRM) a émergé comme l'une des modalités d'imagerie prédominante pour évaluer la restauration de la blessés myocarde. Par ailleurs, des agents de marquage ex vivo, tels que l'oxyde de fer nanoparticules, ont été employés pour suivre et localiser les cellules souches transplantées. Cependant, cette méthode ne permet pas de surveiller une propriété fondamentale de biologie cellulaire quant à la viabilité des cellules transplantées. Il est connu que le chlorure de manganèse (MnCl2) pénètre dans les cellules via voltage-dépendants du calcium (Ca 2 +) des canaux lorsque les cellules sont biologiquement actifs, et s'accumule intracellulairement pour générer l'effet T shortening 1. Par conséquent, nous suggérons que le manganèse-guidée par IRM peut être utile de surveiller la viabilité des cellules après la transplantation de CSEh dans le myocarde.
Dans cette vidéo, nous allons montrer comment étiqueter CSEh avec MnCl2 et comment ces cellules peuvent être clairement vus en utilisant l'IRM in vitro. Dans le même temps, l'activité biologique de Ca 2 +-canaux seront modulées utilisant à la fois de Ca 2 +-canal agonistes et antagonistes pour évaluer les changements du signal concomitant.
Protocol
Étiquetage de manganèse de cellules souches embryonnaires humaines
- Trypsiniser les tiges embryonnaires humaines qui ont été cultivées dans des conditions exemptes d'alimentation pendant 5 minutes. Neutraliser la trypsine en ajoutant des milieux de culture.
- Isoler les cellules par centrifugation à 800 rpm pendant 5 minutes à 20 ° Celsius. Après remise en suspension du culot cellulaire, compter le nombre de cellules par coloration au bleu trypan. Basé sur le nombre de cellules obtenues, diviser les cellules en quatre parties aliquotes de 3 millions de cellules dans des tubes coniques. Pellet nouveau les cellules par centrifugation.
- Juste avant de commencer l'étiquetage de manganèse, de dissoudre le chlorure de manganèse fraîche avec une solution de chlorure de sodium 0,9% pour faire une solution de chlorure de 0,1 mM de manganèse.
- Afin d'observer l'activité des canaux calciques, quatre échantillons ont été préparés. Le premier échantillon est de notre contrôle, qui contient des cellules incubées dans du chlorure de sodium 0,9% seulement. Le deuxième échantillon contient des cellules incubées dans 0,1 mM de MnCl2. Exemple 3 et 4 contiennent des cellules incubées dans 0,1 mM de 2 MnCl soit avec 5 uM de Ca 2 +-canal agoniste (s )-(-)- Bay K8644, ou 250 M de Ca 2 +-canal antagoniste, le vérapamil. Incuber les quatre échantillons à 37 ° Celsius avec 5% de CO 2 pendant 30 minutes.
- Après 30 minutes, ralentit les cellules à 800 rpm pendant 5 minutes à 20 ° Celsius. Puis aspirer le surnageant et laver les cellules marquées à deux reprises avec du PBS. Après le lavage, remettre en suspension chaque culot avec 200 ul de PBS et le transfert dans des tubes PCR. Ces pastilles sont généralement blanches.
Etiquetage Fer de cellules souches embryonnaires humaines
- Mix de qualité clinique du sulfate de protamine à l'eau distillée pour obtenir une solution à 1 mg / ml.
- Dans un tube contenant embryonnaires humaines supports de culture de cellules souches, ajouter ferumoxides à 100 pg / mL suivie par l'addition de 12 pg / ml de sulfate de protamine. Mélanger la solution vigoureusement pendant cinq minutes.
- Ajouter solution mixte d'un montant égal du milieu de culture cellulaire pour obtenir une concentration finale de 50 pg / ml de ferumoxides et 6 pg / ml de sulfate de protamine l'étiquette pour les cellules. Incuber les cellules dans cette solution pendant 12 heures.
- Laver les cellules deux fois avec PBS, avec le dernier lavage contenant de l'héparine 10U/ml de dissoudre le complexe de sulfate extracellulaire ferumoxides-protamine. Après lavage, les cellules trypsiniser pour obtenir une suspension cellulaire unique.
- Compter les cellules et dans la partie aliquote nombre requis d'échantillons. Après le lavage, remettre en suspension chaque culot avec 200 ul de PBS et le transfert dans des tubes PCR. Ces pastilles doivent être orange foncé de couleur marron.
Exécution Cellulaire Imagerie par Résonance Magnétique
- Faire un fantôme afin de stabiliser les tubes contenant les pastilles de cellules et aussi pour éviter des artefacts de l'air ambiant lors de la numérisation. Pour ce faire, mélangez 0,8% d'agar-agar et 1% de sulfate de cuivre dans l'eau distillée et porter à ébullition par des micro-ondes pendant 5-7 minutes. Refroidir le mélange pendant au moins 1 heure avant de la numérisation pour atteindre un gel.
- Les tubes contenant les pastilles de cellules étiquetées sont placées dans le fantôme pour la numérisation. Cellulaire in vitro IRM est réalisée à Signa HDx IRM 3T (GE Medical Systems) en utilisant la bobine au genou clinique.
- Balayage des cellules de manganèse étiquetés pour chacun des trois échantillons en utilisant une séquence d'écho de spin: TR, temps de répétition = 800 ms. TE, le temps d'écho = minimum, FOV; champ de vision = 12 x 12 cm; matrice = 256x256, 1 NEX.
- Balayage des cellules fer marqué en utilisant une séquence d'écho de gradient. Nous utilisons les paramètres suivants pour cette imagerie: TR = 100 ms; TE = 10 ms, FA; angle de bascule = 30 °; FOV = 12 x 12 cm; matrice = 256 x 256, 1 NEX.
Analyser les résultats de l'IRM
- Analyser des images de l'IRM à partir de 4 échantillons différents de cellules de manganèse-étiqueté:
- Exemple # 1 est de notre contrôle, qui contient des cellules incubées dans du chlorure de sodium 0,9% seulement.
- Exemple n ° 2 contient des cellules incubées dans 0,1 mM de MnCl2.
- Exemple n ° 3 contient des cellules incubées dans 0,1 mM de 2 à 5 uM MnCl de Ca 2 +-canal agoniste (s )-(-)- Bay K8644.
- Exemple n ° 4 contient des cellules incubées dans 0,1 mM de 2 MnCl avec 250 uM de Ca 2 +-canal antagoniste, le vérapamil.
- Comme prévu, les différences dans l'intensité du signal du manganèse cellules marquées sont visibles. Comparé aux cellules marquées purement avec le manganèse, l'intensité du signal augmente nettement dans la présence de l'agoniste des canaux calciques et diminue en présence d'un antagoniste des canaux calciques. La zone où l'intensité du signal a augmenté pour le manganèse cellules marquées sont mesurés en utilisant Image J (NIH, Bethesda, MD, USA). Le même logiciel est utilisé pour analyser la zone d'obscurité hors résonance du signal à partir du fer cellules marquées. La taille du signal sombres du fer cellules marquées dépend du nombre de cellules ou le nombre de particules de fer contenue par les cellules. Dans ce cas,, Un million de cellules montre une zone plus petite des signaux sombres par rapport au signal des trois millions de cellules.
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Discussion
Ces résultats indiquent que le manganèse ne pénètrent par le canal calcique voltage-dépendants, et le manganèse peut être utilisé comme agent de contraste IRM, qui peut également montrer la viabilité cellulaire. Par conséquent, nous suggérons que le manganèse-guidée par IRM peut être utile de surveiller la viabilité des cellules après la transplantation de cellules souches embryonnaires humaines dans le myocarde.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Manganese chloride tetrahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | M8054 | |
| (S)-(-)-Bay K8644 | Reagent | Sigma-Aldrich | B133 | |
| (+)-Verapamil hydrochloride, minimum 99.0% titration | Reagent | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Sodium Chloride 0.85-0.90% W/V | Reagent | VWR international | VW 3257-1 | |
| Feridex I.V. | Reagent | Berlex Laboratories | NDC 59338-7035-5 | ferumoxides injectable solution 11.2mg iron/mL |
| Protamine sulfate | Reagent | American Pharmaceutical Partners | NDC 63323-229-05 | 50 mg (10 mg/mL) |
| Knockout SR (Serum replacement for ES cells) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828 | |
| DMEM/F12 (1:1) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330 | |
| 2- mercapt–thanol 98+% | Reagent | Sigma-Aldrich | M 3148 | |
| L-Glutamine 200mM 100x | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Penicillin-Streptomyocin 10,000 units/ml | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100x solution | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140 | |
| Signa HDx 3T MRI | Tool | GE Healthcare | ||
| clinical Knee coil | Tool | GE Healthcare | ||
| DPBS | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190 |
References
- Bruvold, M., Nordhoy, W., Anthonsen, H. W., Brurok, H., Jynge, P. Manganese-calcium interactions with contrast media for cardiac magnetic resonance imaging: a study of manganese chloride supplemented with calcium gluconate in isolated Guinea pig hearts. Invest Radiol. 40, 117-125 (2005).
- Aoki, I., et al. Cell labeling for magnetic resonance imaging with the T1 agent manganese chloride. NMR Biomed. 19, 50-59 (2006).
- Arbab, A. S., et al. Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI. Blood. 104, 1217-1223 (2004).
- Arbab, A. S., Frank, J. A. Cellular MRI and its role in stem cell therapy. Regen Med. 3, 199-215 (2008).
