자기 공명 영상을위한 인간 배아 줄기 세포의 체외 라벨에

Summary

이 비디오에서는, 우리는 망간 염화와 인간의 배아 줄기 세포를 (hESC) (MnCl 라벨하는 방법을 보여주는데

Abstract

인간 배아 줄기 세포는 (hESC) 부상 myocardium를 복원하는 능력을 증명하고있다. 자기 공명 영상 (MRI)는 부상 myocardium의 복원을 평가하는 주된 이미징 modalities 중 하나로 떠오르고있다. 또한, 이러한 철 - 산화 nanoparticles으로 전 생체내 라벨 에이전트는, 추적하기 위해 고용 및 이식 줄기 세포를 집중하고 있습니다. 그러나,이 방법은 이식 세포의 생존에 관한 근본적인 세포 생물학 속성을 모니터하지 않습니다. 그것은 망간 염화 (MnCl ₂₎ 전압 - 문이 칼슘 (칼슘 ^{2 +)} 세포 생물학적으로 활성화되어 채널을 통해 세포를 입력하고, T ¹ 단축 효과를 생성하는 intracellularly 축적되는 것으로 알려져있다. 따라서, 우리는 망간 - 안내 MRI는 myocardium에 hESC의 이식 후 세포 생존을 모니터하는 데 유용할 수 있습니다하는 것이 좋습니다.

이 비디오에서는, 우리는 MnCl ₂ 어떻게 이들 세포는 명확하게 체외에서 MRI를 사용하여 볼 수와 hESC 레이블을하는 방법을 보여줍니다. 동시에, CA ² 생물 학적 활동 ⁺ - 채널 수반하는 신호 변경을 평가하기 위해 칼슘 ^{2 +} 채널 작용제 및 길항제를 모두 활용 변조된 것이다.

Protocol

인간 배아 줄기 세포의 망간 라벨링

1. 피더없이 5 분 조건에서 양식되고있는 인간의 배아 줄기를 Trypsinize. 문화 미디어를 추가하여 트립신을 중화.
2. 20 5 분 800 rpm으로 centrifuging하여 세포를 스핀 다운 ° 섭씨. 다시 보류 세포 펠릿 후, trypan 파랑 얼룩에 의해 세포의 개수를 계산합니다. 얻은 세포 개수에 따라 원뿔 튜브에 3,000,000 세포 네 가지 aliquots으로 세포를 나눕니다. 원심 분리하여 다시 펠렛 세포.
3. 그냥 망간 상표를 시작하기 전에, 0.1mM 망간 염화 솔루션을 만들기 위해 0.9 %의 나트륨 염화물 솔루션 신선한 망간 염화을 풀다.
4. 칼슘 채널의 활동을 관찰하기 위해서는, 넷 샘플이 준비되었습니다. 첫 번째 예제는 혼자서 0.9 %의 나트륨 염화물에 incubated 세포를 포함 우리의 컨트롤입니다. 두 번째 예제 0.1 MM MnCl ₂ incubated 세포가 포함되어 있습니다. 샘플 3 4 칼슘 ^{2 +} 채널 작용제 5 μm의 하나와 0.1 MM MnCl ₂ incubated 세포 (S )-(-)- 베이 K8644, 또는 칼슘 ^{2 +} 채널 길항제, verapamil 250 μm의이 포함되어 있습니다. 37 네 개의 샘플을 품어 ° 30 분 5 % CO _2와 함께 섭씨.
5. 30 분 후에, 20 ° 섭씨에서 5 분 동안 800 rpm으로 세포를 스핀 다운. 그런 다음 뜨는을 대기음하고 PBS로 두 번 표시된 세포를 씻으십시오. 세척 후, PCR 튜브에 200 μL PBS 및 전송하여 각 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 이 알약은 보통 흰색입니다.

인간 배아 줄기 세포의 이런 라벨링

1. 1 MG / ML 재고 솔루션을 위해 증류수와 임상 수준 프로타민 황산을 섞는다.
2. 인간 배아 줄기 세포 배양 매체를 포함하는 튜브에 12 μg / ML 프로타민 황산의 또한 다음에 100 μg / ML에서 ferumoxides를 추가합니다. 5 분 동안 적극적으로 솔루션을 섞는다.
3. 50 μg / ferumoxides의 ML 6 레이블 세포에 프로타민 황산의 μg / ML의 최종 농도를 달성하기위한 세포 배양 매체의 동일한 금액에 혼합 솔루션을 추가합니다. 12 시간이 솔루션에 세포를 품어.
4. 세포외 ferumoxides - 프로타민 황산 복합을 해산하기 위해 10U/ml 헤파린이 들어있는 마지막으로 세척과 함께 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. 세척 후, 세포가 하나의 세포 현탁액을 얻는 trypsinize.
5. 샘플 필요한 번호로 세포가 나누어지는 카운트. 세척 후, PCR 튜브에 200 μL PBS 및 전송하여 각 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 이 알약은 색깔에서 짙은 주황색 갈색해야합니다.

세포 자기 공명 영상 공연

1. 셀 알약이 들어있는 튜브를 안정화하고 또한 스캔하는 동안 주위의 공기에서 유물을 피하기 위해 유령을 만듭니다. 이렇게하려면, 증류수에 한천의 0.8 %와 구리 황산의 1 %를 혼합하고 5~7분에 대한 microwaving하여 끓기 가져. 젤을 달성하기 위해 스캔 전에 최소한 1 시간 동안이 혼합물을 쿨.
2. 표시 셀 알약을 포함하는 튜브는 스캔에 대한 환상에 배치됩니다. 체외 세포 MRI 임상 무릎 코일을 사용하여 Signa HDx 3T MRI (GE 의료 시스템)에서 수행됩니다.
3. 스핀 에코 시퀀스를 사용 세 가지 샘플의 각 망간 전지 라벨 스캔 : TR을, 반복 시간 = 800 밀리초. TE, 에코 시간 = 최소, FOV,보​​기의 분야 = 12 X 12cm, 매트릭스 = 256x256, NEX 1.
4. 그라디언트 - 에코 시퀀스를 사용하여 철분 라벨 세포를 검사합니다. 이 영상에 대해 다음 매개 변수를 사용 : TR = 100 밀리초, TE = 10 밀리초, FA, 플립 각도 = 30 °, FOV = 12 X 12cm, 매트릭스 = 256 X 256, NEX 1.

MRI 결과 분석

1. 망간 - 라벨 세포의 4 개의 샘플에서 MRI 스캔 이미지를 분석 :
   • 샘플 # 1은 혼자 0.9 %의 나트륨 염화물에 incubated 세포를 포함 우리의 컨트롤입니다.
   • 샘플 # 2는 0.1 MM MnCl ₂ incubated 세포가 포함되어 있습니다.
   • 샘플 # 3 칼슘 ^{2 +} 채널 작용제 5 μm의, (S )-(-)- 베이 K8644과 함께 0.1 MM MnCl ₂ incubated 세포가 포함되어 있습니다.
   • 샘플 # 4 칼슘 ^{2 +} 채널 길항제, verapamil 250 μm의와 0.1 MM MnCl ₂ incubated 세포가 포함되어 있습니다.
2. 으로 예측, 망간 전지 라벨에서 신호 강도의 차이는 볼 수 있습니다. 망간과 순수라는 세포에 비해 신호 강도가 명확하게 칼슘 채널 작용제의 존재의 증가와 칼슘 채널 길항제의 존재에 줄어 듭니다. 신호 강도가 표시 망간 전지 증가 지역은 이미지 J을 (NIH, 베데스다, MD, 미국)를 사용하여 측정됩니다. 동일한 소프트웨어는 철 표시 세포의 어두운 오프 공명 신호의 영역을 분석하는 데 사용됩니다. 철 - 라벨 세포의 어두운 신호의 크기는 세포 또는 세포에 의해 포함된 철 입자의 숫자의 수에 따라 달라집니다. 이 경우에는, 백만 세포는 삼백만 세포의 신호에 비해 어두운 신호의 작은 영역을 보여줍니다.

Discussion

이러한 결과는 망간도 세포 생존을 보여줄 수 전압 - 게이 티드 칼슘 채널 및 망간은 MRI 대비 에이전트로 사용할 수를 통해 입력 않는다는 것을 나타냅니다. 따라서, 우리는 망간 - 안내 MRI는 myocardium로 인간 배아 줄기 세포의 이식 후 세포 생존을 모니터하는 데 유용할 수 있습니다하는 것이 좋습니다.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Manganese chloride tetrahydrate	Reagent	Sigma-Aldrich	M8054
(S)-(-)-Bay K8644	Reagent	Sigma-Aldrich	B133
(+)-Verapamil hydrochloride, minimum 99.0% titration	Reagent	Sigma-Aldrich	V4629
Sodium Chloride 0.85-0.90% W/V	Reagent	VWR international	VW 3257-1
Feridex I.V.	Reagent	Berlex Laboratories	NDC 59338-7035-5	ferumoxides injectable solution 11.2mg iron/mL
Protamine sulfate	Reagent	American Pharmaceutical Partners	NDC 63323-229-05	50 mg (10 mg/mL)
Knockout SR (Serum replacement for ES cells)	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10828
DMEM/F12 (1:1)	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11330
2- mercapt–thanol 98+%	Reagent	Sigma-Aldrich	M 3148
L-Glutamine 200mM 100x	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25030
Penicillin-Streptomyocin 10,000 units/ml	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
MEM Non-Essential Amino Acids 100x solution	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11140
Signa HDx 3T MRI	Tool	GE Healthcare
clinical Knee coil	Tool	GE Healthcare
DPBS	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14190