Summary
本视频演示了原位杂交的方法，其中2个不同的基因的时空表达模式可以在年轻的鸡胚显示2色整装。这种方法最初是由大卫威尔金森，多明戈斯恩里克，菲尔英厄姆和大卫ISH - Horowicz。
Abstract
鸡胚是一个有价值的工具，在早期胚胎发育的研究。其透明度，可获得性和易于操纵，使其用于研究基因表达在脑，神经管，体节和心脏原基形成的理想工具。本视频演示了不同的步骤，在2色整装原位杂交;首先，胚胎从卵解剖和多聚甲醛固定。二，预杂交胚胎处理。具有两种不同的探针，再加上挖一个，并再加以FITC标记的杂交胚胎。杂交过夜后，胚胎培养与辛加上抗体。辛基板颜色反应的进行，和感兴趣的区域显示为蓝色。胚胎，然后加上与FITC标记抗体孵育。胚胎处理颜色用FITC反应，和感兴趣的区域显示为红色。最后，胚胎是固定的，为phtograph处理和切片。还介绍了故障排除指南。
Protocol
第1部分：固定的胚胎
- 填充与冰冷的DEPC - PBS清扫菜。置于冰上。打开用镊子轻敲壳蛋和删除壳件。
- 用镊子取出厚厚的白蛋白。卵黄囊倾斜粗钳，使胚胎朝上。
- 用剪刀，切割围绕胚胎的卵黄囊平方米。
- 使用勺子，取出胚胎从卵黄和冰冷的DEPC - PBS。
- 在显微镜下，删除膜和蛋黄，并转移到固定菜。
- 牵制，除去DEPC - PBS。 DEPC - PBS在4％煤灰更换和修复O / N在4 ° C。
- 删除固定液。更换与冰冷的DEPC - PBS。使用钝年底microcapillary针或显微切割刀，穿孔的神经系统和心腔，防止探头诱捕。
- 2X 10分钟DEPC - PBS洗0.1％Tween - 20的（PBT）的。脱水10分钟每25％，50％，75％甲醇在PBT。两次在100％甲醇脱水胚胎。在甲醇储存在-20 ° C。
第2部分：预杂交
- 补充水分胚胎75％，50％和25％甲醇在PBT中的每个10分钟。在PBT洗净2X 10分钟。
- 同时，准备冰冷的固定液（4％多聚甲醛在PBT）。替换蛋白酶K溶液（3毫升/瓶; [5克/毫升]最后在PBT）PBT。确保整个小瓶暴露蛋白酶K溶液轻轻滚动小瓶;故障排除的曝光时间。
- 使用核糖核酸免费巴斯德吸管删除蛋白酶K，添加固色剂（2毫升）。整整20分钟，立即放在冰上。
- 所有RT洗上nutator执行。洗2X 10分钟，在PBT和1x在PBT 10MN含有50％的杂交缓冲液。
- 在杂交缓冲液清洗1X。孵育65 °彗星在4-5小时的杂交缓冲液2毫升。
第3部分：与探针的杂交胚胎
- 挖掘和FITC耦合探针合成是在附录中描述。预计将提供一个强有力的信号探头，应synhesized FITC含核苷酸;较弱的探头应与辛含核苷酸合成。
- Prewarm探针在杂交缓冲液（500毫微克/毫升），使用2 ml小瓶。及时更换探头解决方案的杂交缓冲液。不要让胚胎干。孵育16小时，在65 ° C。
- 替换探针杂交缓冲液，2洗，30分钟在65 ° C。在杂交缓冲液/ MABT中清洗15分钟（1 / 1 V / V /）在65 ° C。
第4部分：辛抗体孵育和显色反应
- 洗净MABT 2X20万。在2％BBR / MABT清洗1小时。洗5小时，在2％BBR/20％HISS / MABT（封闭液）。孵育封闭液稀释1:2000辛抗体，O / N在4 °上nutator彗星。
- 洗3X 10分钟在MABT，3X MABT每1小时。
- 洗净NTMT 2X 20分钟。加入200ul NBT / BCIP底物10毫升NTMT。立即从小瓶NTMT和更换1-2毫升NBT / BCIP显缓冲区。在黑暗的地方。 20分钟后，显示器的色彩反应，并在此后每隔20分钟。
- 显色反应（应该出现蓝色），在PBS洗10分钟，针用PBS填充的固定菜，并取代与4％的PBS PFA解决方案。修正/ O在4 ° C。
- 转移到新的闪烁瓶中。 PBST洗涤（PBS 1％吐温20）2X10万。在MABT 2X 10分钟洗净。
- 在63 ° C，在MABT 30分钟的孵育
第5部分：FITC标记抗体孵育和显色反应
- 洗2倍的MABT 10分钟，1小时2％，5小时的封闭液BBR / MABT
- 孵育在碱性磷酸酶偶联抗FITC抗体（1:500）的O / 4个N ° C。
- 洗3X 10分钟在MABT，3X MABT每1小时。
- 在TBS的pH值8.45与0.1％Tween - 20的（TBST）2X 20分钟洗净。
- 准备在TBST使用试剂盒提供的试剂1,2和3的矢量红溶液（5毫升）。立即从小瓶TBST和替换矢量红缓冲区。在黑暗的地方。监控显色反应后40分钟，30分钟，其后每隔。
- 下列颜色反应（应该会出现红色），将胚胎转移，以PBS。
第6部分：固定和加工
- 转移到含PBS的固定菜，和4％PFA固定在室温或O / N为20分钟，在4 ° C。
- 在PBS，2个10分钟洗净。摄影过程中，转移至20％甘油的PBS（这将使半透明的胚胎）。要创建一个会议厅，切2条PVC胶带，幻灯片上叠加。切方在使用刀片中心。去掉方使用产钳。
- 蜡切片的过程中，转让，以PBS冲洗2X 10分钟，脱水甲醇梯度（25％，50％，75％和100％的PBS，每10分钟）。
- 丙醇，3MN更换。 1,2,3,4 - 四氢更换，20分钟之后Histoclear（2个1小时）。更换histoclear /蜡1 / 1（V / V）60 ° C时为1小时。替换一个过程蜡为组织学。
第7部分：解决方案
杂交缓冲液中，保存在-20 ° C的猎鹰，50毫升25毫升甲酰胺; 3.25毫升（20xSSC）; 0.5毫升（0.5M EDTA）; 1毫升（10％Tween - 20的）; 2.5毫升（1％SDS） 125 UL（20mg/ml tRNA的）; MABT 100ul（50毫克/毫升的肝素），准备100MM马来酸，pH值至7.5氢氧化钠颗粒。 150MM氯化钠和0.1％Tween - 20的。
NTMT（在使用前），50毫升：1毫升（5M氯化钠）; 2.5毫升（2M的Tris - HCl pH9.5）; 1.25毫升（2M氯化镁2）; 5毫升（10％Tween - 20的）。
TBST：0.1M的Tris - HCl，pH值8.45，0.15米，氯化钠0.1％Tween - 20的。
第8部分：故障排除
| 问题 | 原因 | 补救 |
|---|---|---|
| 胚胎蜷缩 | 脱水/补液不足 | 维持在10分钟的间隔连续脱水/补液步骤 |
| 有没有探头的信号 | 探头是退化RNase的污染小瓶 | 1％琼脂糖凝胶上运行的探头确保整个小瓶蛋白酶K溶液暴露在第2步 |
| 探头是标签的心腔神经管 | 探头被困住 | 在第2步，确保所有空腔穿孔采用显微切割刀或microcapillary |
| 胚胎解体以下杂交（步骤3） | 蛋白酶K一步离开太久杂交温度过高 | 蛋白酶K不应该离开不再比1mn（阶段3和4），2分钟（第一阶段5至7），3分钟（8-10期），4分钟（第一阶段11-13）不要在 T O杂交更高超过摄氏65度 |
第9部分：代表结果
代表胚胎如下：（一）胚胎（阶段HH7），是标示与DIG - SOX探头（蓝色）和一个FITC -δ- 1的探头（红色）。 （二）胚胎（阶段HH8）都标有一挖，PAX6探头（蓝色）和FITC - SHH探头（红色）。 NF，神经倍，ANP，前神经板，PSM，presomitic中胚层，N，NT，脊索，神经管）。从博士实验室的探头礼物。 C.塔宾，古尔丁，D.恩里克，和J.布里斯科。 
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Discussion
2色整装原位杂交方法是用来确定空间和时间的基因表达模式，使用一个或两个基因的兴趣。应用领域包括新基因的基因表达模式的评估 （如1,2，以及以下侮辱基因表达的变化（3 胚胎操作 ，珠4，RNA 或DNA电构造5）。
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Acknowledgments
这项工作是支持的玛格丽特M. Alkek基金会RHF。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 | |
| Marsh Automatic Incubator | Tool | Lyon | RX | |
| Hybridization Incubator | Tool | Hybaid | Micro-4 | |
| Adams Nutator orbital mixer | Tool | Fisher Scientific | 14-062 | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Spoon | Tool | Fine Science Tools | 10370-18 | |
| Pasteur Capillary Pipette | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | ||
| Microcapillary tube | Sigma-Aldrich | P1049-1PAK | Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps | |
| Microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization | |
| Minuten pins 0.2mm diam | Fine Science Tools | 26002-20 | Keep pins together using a magnetic stirrer; | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Reagent | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave |
| 16% PFA | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Tween-20 | Reagent | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308-5MG | Stock at 10 mg/ml in depc-H2O in 10ul aliquots. Store at -20C. | |
| Formamide, deionized | Reagent | Ambion | 9342 | |
| Yeast tRNA-25 mg | Reagent | Invitrogen | 15401-011 | Stock at 20 mg/ml in depc-H2O in 125ul aliquots. Store at -20C |
| Heparin Sodium salt | Reagent | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | Stock at 50 mg/ml in depc-H2O in 100ul aliquots. Store at -20C. |
| SSC x20 pH5.5 | Reagent | Fisher Scientific | PR-V4261 | |
| EDTA (0.5M) | PR-V4231 | Fisher Scientific | ||
| SDS | Reagent | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| Maleic acid | Reagent | Fluka | 63189 | |
| B–hringer Blocking Reagent | Reagent | Roche Group | 11096176001 | Use at 2% in MABT. To make, heat with MABT for 20 mn at 60C. Can make a stock and store in 1-5 ml aliquots at 20C. |
| Heat inactivated sheep serum | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 013-000-121 | Dissolve in 10 ml H2O; heat 550C, 30 mn. Aliquot at 1ml, -20C. |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Reagent | Roche Group | 11093274910 | |
| NBT/BCIP stock solution | Reagent | Roche Group | 11681451001 | |
| Anti-Fluorescein-AP, Fab fragments | Reagent | Roche Group | 11426338910 | |
| 2M Tris | BP1759-500 | Fisher Scientific | ||
| Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit | Reagent | Vector Laboratories | SK-5100 | |
| 1,2,3,4-tetrahydronaphthalene | Reagent | Sigma-Aldrich | 429325-100ML | Under hood |
References
- Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. 406, 74-78 (2000).
- Rodríguez Esteban, C., Capdevila, J., Economides, A. N., Pascual, J., Ortiz, A., Izpisúa Belmonte, J. C. The novel Cer-like protein Caronte mediates the establishment of embryonic left-right asymmetry. Nature. 401, 243-251 (1999).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Kawakami, M., Nakanishi, N. The role of an endogenous PKA inhibitor, PKIalpha, in organizing left-right axis formation. Development. 128, 2509-2515 (2001).
- Basch, M. L., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. I. Specification of the neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
