Summary
Hier zeigen wir ein Verfahren zur Induktion und Aufzeichnung des Fortschritts einer verzögerten Typ-Überempfindlichkeit (DTH)-Reaktion bei der Ratte Ohr. Dies wird durch eine Demonstration der Vorbereitung der Ratte Ohrgewebe für Zwei-Photonen-Imaging der Effektor / Memory T-Zell-Antwort folgte.
Abstract
Verzögerte Überempfindlichkeitsreaktionen (DTH) ist eine Immun-Reaktion, bei der die wichtigsten Akteure sind CCR7 - Effektor / Memory T-Lymphozyten. Hier zeigen wir ein Verfahren zur Induktion und Aufzeichnung des Fortschritts einer DTH-Reaktion bei der Ratte Ohr. Effektor / Memory T-Zell-Antwort - Dies ist eine Demonstration der Zubereitung von Ratten Ohrgewebe für Zwei-Photonen-Imaging der CCR7 gefolgt.
Effektor / Memory T-Zell-Linie (Beeton, C J. Visualisierte Experimente, Issue 8) - Ein Adoptiv-DTH wird durch die intraperitoneale Injektion von GFP-markierten Ova-spezifische CCR7 induziert. Die Zellen werden dann erlaubt, bei der Ratte für 48 Stunden ruhen, bevor Herausforderung durch die Injektion von einem Ohr mit Kochsalzlösung (Kontrollgruppe Ohr) und die andere mit einem 1:1-Mischung von Eizellen und Ova konjugiert Texas-Red (Ova-TR) zur Visualisierung ermöglichen der ansässigen Antigen-präsentierenden Zellen.
Wir beschreiben eine Methode, Gewebe Vorbereitung nützlich für die Bildgebung die Motilität von Zellen in den tiefen Hautschichten während einer Immunantwort in Verbindung mit Visualisierung von Kollagenfasern durch Erzeugung der zweiten Harmonischen. Ear Gewebe in 5 x 5 mm Quadrate (etwas größer ist besser) geschnitten und auf Kunststoff Deckgläser mit Vetbond ™, die dann gesichert werden mit Silikonfett in einem bildgebenden Kammer und superfundiert durch Sauerstoff-Blasen Gewebekultur-Medium bei 37 ° C .
Protocol
Induktion von Adoptive DTH
Bitte beachten Sie JoVE Artikel: Induktion und Überwachung von Adoptive Allergien vom verzögerten Typ in Ratten
Christine Beeton, George K. Chandy
Institut für Physiologie und Biophysik, University of California, Irvine
J. Visualisierte Experimente, Issue 8
Hier haben wir dieses Protokoll mit Antigen (Ovalbumin), konjugiert mit Texas-Red in einem Verhältnis von 1:1 mit unmarkiertem Antigen um zur Visualisierung von Phagozyten Antigen-präsentierenden Zellen können modifiziert werden.
Ohrgewebe Ernte
- Euthanize der Ratte in der gewünschten Zeit-Punkt durch Verfahren in Ihrem genehmigten Tier-Protokoll beschrieben. Hier verwenden wir eine Überdosis des Narkosemittels, Isofluran. Dies ist in einem geschlossenen Behälter in einem gut belüfteten Motorhaube getan. Stellen Sie sicher, das Tier tot ist entweder durch Enthauptung durch die Eröffnung der Brusthöhle und Schneiden des Herzens.
- Mit großen Schere entfernen das Ohr mit einem einzigen Schnitt, möglichst nahe an den Körper des Tieres wie möglich (Abbildung 1).
Abbildung 1. Die Entfernung der Ratte Ohr - Legen Sie das Ohr in einer 15 ml konische Röhrchen mit ca. 10 ml eiskaltem 1x PBS oder RPMI-1640. Halten Sie die Gewebeproben auf Eis, bis Sie bereit, um das Gewebe für die Bildgebung herzustellen sind.
- Bild des Gewebes so schnell wie möglich, wir finden aber, dass 1 bis 2 Stunden auf Eis keine erkennbare Wirkung auf die Zellbewegung in das Gewebe, wenn das Gewebe geerntet und abgebildet sofort verglichen.
Tissue Vorbereitung für Imaging
I. Entfernung von epidermalen und dermalen Schicht
* Hinweis: Die tiefe Hautschicht muss beibehalten werden. Wenn es richtig gemacht großen Blutgefäße bleiben erhalten und der Knorpel des Ohres nicht ausgesetzt werden. Dies ist eine schwierige Technik, vor allem, wenn es keine Entzündung (Kontrollbedingungen) und es ist hilfreich, ein Binokular verwenden.
- Legen Sie beide das Gewebe und Medien aus dem konischen Rohr in einer 10 cm Gewebe Kulturschale.
- Mit behandschuhten Händen halten die Ratte Ohr sanft an der Spitze des Ohres (distalen) mit der Dorsalseite des Ohres nach oben (Abbildung 2).
Abbildung 2. Trim Fell aus dem Ohr - Mit dem Daumen auf der Oberseite des Ohrs, steady das Gewebe während der Verwendung der Spitze des geschlossenen Dumont Nr. 5 Schere, um die Dermis aus der tiefen Dermis zu trennen. Alternativ, wenn der Rand des Ohres hat einen Überhang von Haut / tiefe Dermis, kann dies mit einer Pinzette fassen und vorsichtig herausgezogen, um diese aus dem Gewebe darunter (Abbildung 3) zu trennen.
Abbildung 3. Die Entfernung der oberen Dermis - Nach einem kleinen Bereich der Haut hat sich von dem darunter liegenden Gewebe abgetrennt wurde, wiederholen Sie die Schritte Trennung alternativ mit einer Schere zu schneiden zwischen den Hautschichten und Pinzette vorsichtig entfernen und Abziehen der Haut abgelöst.
- Expose eine 5 x 5 mm oder größere Fläche Ohrgewebe, dass mindestens 3 mm von der ersten Seite der Antigen-Injektion (Abbildung 4).
Abbildung 4. Tissue für die Bildgebung ausgesetzt
II. Sicherung Tissue Imaging zur Bühne
- Schneiden Sie ein Kunststoff Deckglas zu einer Größe etwas größer als vorbereitet Gewebe.
- Verteilen Sie eine dünne Schicht von 3M Vetbond ™ Gewebe-safe Kleber auf den Objektträger.
- Fassen Sie die Ecke der präparierten Gewebe (wo Sie sind nicht geeignet, Bild), von Medien zu entfernen, und tupfen Sie die Unterseite des Gewebes auf der Linse Papier oder Kym wischen, um überschüssige Medien zu entfernen.
- Tippen Sie auf die Kante des Gewebes auf den Leim bedeckt Schlitten (die Vetbond härtet sofort auf nassen Gewebe). Vorsichtig dehnen das Gewebe flach, mit dem anderen Ende ist der letzte, der die Folie berühren (Abbildung 5)
Abbildung 5. Berg Gewebe Slip Cover - Cure den Vetbond ™ durch Umkehrung der Gewebeprobe / Rutsche und Eintauchen in ein Reservoir von Medien, so dass das Gewebe und ziehen nach unten und rund sind in einem Winkel von 45 Grad. Halten Sie das Gewebe auf den Kopf in einem Winkel hilft, überschüssigen Kleber aus Aushärtung an der exponierten Gewebeoberfläche verhindern. Kleber auf der Oberfläche des Gewebes blockiert den Laser (Abbildung 6).
Abbildung 6. Cure vetbond Gewebe glue durch Eintauchen in den Medien
Hinweis: Die Schritte 2-5 können ein wenig Übung zu meistern. Versuchen Sie üben mit weggeworfenen oder extra Gewebestücke, bevor zum ersten Mal. - Dab eine kleine Menge Silikonfett auf den unteren Rand der Folie.
- Legen Sie die Folie in der Perfusionskammer. Stellen Sie sicher, dass die Perfusion Medien ist fließend, 37 ° C und mit Sauerstoff versorgt, bevor Sie Gewebe. Drücken Sie vorsichtig auf die Ränder der Folie machen ein Siegel mit dem Silikonfett zwischen der Unterseite des Perfusionskammer und die Kunststoff-Deckglas.
III. Zwei-Photonen-Imaging
- Mit Hellfeld-Durchlicht, auf der Oberseite des Gewebes zu konzentrieren. Schalten Sie alle Lichter.
- Schalten Sie den Laser, PMTs wie von Ihrem Multi-Photonen-Mikroskop-System erforderlich.
- Second Harmonic Generation (SHG) in hoch geordneten faserige Proteine (Kollagen und Myosin) erzeugt ein Signal mit der halben Wellenlänge des zur Anregung verwendeten Lasers. Wir verwenden Anregung bei 900 nm, was zu SHG bei 450 nm, die visualisiert werden können mit dem "blue"-Kanal des Mikroskops. SHG-Generation ist eine nicht-lineare (Zwei-Photonen-) Prozess, und bietet somit eine optische "Schneiden"-Effekt ähnlich dem der Zwei-Photonen-Anregung der Fluoreszenz. Die maximale Effizienz des SHG tritt auf, wenn die Fibrillen senkrecht zur Laser, während Fibrillen, die parallel ausgeführt werden nicht visualisiert. 1
- Suchen Sie einen guten Imaging-Bereich mit reichlich Zellen, stellen Sie Ihren Erwerb Bereich, so dass die Mehrzahl der Zellen in der Mitte sind und beginnen Bildgebung. Hinweis: In DTH-Reaktionen, T-Zellen und anderen Zellen infiltriert sind oft zusammen konzentriert werden, während andere Bereiche frei von infiltrierenden Zellen 2 sind. Daher kann es einige Zeit dauern, die Suche im Gewebe um die beste Gegend, um Bild zu finden.
- Prüfen Sie, ob die Lebensfähigkeit der Zellen durch die Beurteilung Zelle Geschwindigkeit und Polarität während der Bildgebung. Verwenden Sie die niedrigste Laserleistung, dass akzeptable Bildqualität bietet, um minimal Foto-Schäden zu gewährleisten.
- Swap in eine neue Gewebe Vorbereitung wie nötig.
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References
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