Standardize Hazırlık gentleMACS Dissociator kullanarak Fare Akciğer Doku Tek Hücre Cezalar

Bu video protokolünde, akciğer dokusunun ayrışmasını takiben GENTLE MAX kullanarak yetişkin fare akciğer dokusunun nasıl ayrıştırılacağını göreceksiniz. Kollajenaz d ve DNAS varlığında, bir hücre süspansiyonları 70 mikronluk bir hücre süzgeç santrifüjü kullanılarak filtrelenir ve daha sonraki uygulamalar için askıya alınır. Merhaba, ben Almanya'daki Mil Biotech'ten Melanie Mlu.

Bugün size GenX ayrışmasını kullanarak fare akciğer dokusundan tek hücreli bir süspansiyonun hazırlanması için tekrarlanabilir ve otomatik bir prosedür göstereceğim. Bu prosedürü laboratuvarımızda, lökositlerin veya endotel hücrelerinin hazırlanması için tek hücreli süspansiyonlar hazırlamak için kullanıyoruz. Tamam, başlayalım.

Protokole başlamadan önce, birkaç standart çözelti hazırlanmalı ve hazır olmalıdır. İlk olarak, Hebes tamponuna ihtiyacımız olacak. İkincisi, mililitre başına 100 miligram enzim ve hebes tamponu içeren bir kollajenaz D çözeltisi.

Üçüncüsü, mililitre başına 20.000 birim içeren bir dase bir çözelti. Son olarak, iki yaygın tamponlama çözümü. pH 7.2'de tipik bir PBS tamponu ve AutoMax durulama çözeltisi ve BSA stok çözeltisinden türetilen bir PEB tamponu.

Protokolümüze, altı ila yedi haftalık bir dişi biyopsi faresinden elde edilen diseke bir akciğer ile başlıyoruz. Akciğerin kalp ve timüs, efferent ve afferent kan damarları, trakea ve bağ dokuları gibi bitişik organlardan arınmış olduğundan emin olun. Eritrositleri çıkarmak için dokuyu PBS içeren bir Petri kabında durulayın.

Tipik olarak, bu yaştaki bir fare akciğeri 110 ila 150 miligram ağırlığındadır. Yaşlı hayvanlardan veya diğer fare türlerinden akciğerleri ilişkilendirmeyi planlıyorsanız, dokuyu ve tamponu tartın. Bir tüp başına en fazla 450 miligram doku ayrıştırılabilir.

Akciğer dokusunu 4.9 mililitre heis tamponu ile yüklenmiş yumuşak bir max C tüpüne aktarın. Akciğer dokusuna ve tampona mililitre başına iki miligramlık bir son konsantrasyona 100 mikrolitre kollajen D çözeltisi ekleyin. Şimdi 10 mikrolitre dase.

150 miligramdan fazla doku için bir çözüm. Bir çözelti 20 mikrolitre dase ekleyin. C tüpünün sıkıca kapatıldığından emin olun ve baş aşağı nazik max dis'in üzerine yerleştirin.

Dokunun rotor ile stator arasında yer aldığından emin olun. Akciğer programını seçin ve program bittiğinde başlat düğmesine basarak çalıştırın. C tüpünü cihazdan çıkarın ve numuneyi 30 dakika inkübe edin.

İnkübasyon sırasında 37 santigrat derecelik bir inkübatörde, tüp maksimum karışım tüpü döndürücü kullanılarak döndürülmeli veya her beş dakikada bir manuel olarak döndürülmelidir. İnkübasyondan sonra, C tüpünü nazik max Birleştiriciye geri koyun ve ikinci akciğer programını çalıştırın Program çalışırken, kapağı 70 mikrometre gözenekli hücre süzgeci ile değiştirerek filtrelenmiş hücreleri toplamak için 50 mililitrelik bir tüp hazırlayın. Ayrıştırma programı sona erdiğinde, numune materyalinin tüp içindeki dağılımına bağlı olarak, numune materyalini konsantre etmek için tüpü kısa bir süre santrifüjlemek isteyebilirsiniz.

Ayrışmış hücreler, C tüpünün septum sızdırmaz kapağından pipetlenerek tüpten çıkarılabilir. Uygun bir 1000 mikrolitrelik pipet ucu kullanılarak, daha büyük partikülleri veya agregaları uzaklaştırmak için hücre süzgecine hücre süspansiyonu uygulanır. Çözelti boşaldıktan sonra, filtrelenmiş hücreleri peletlemek için ek beş mililitre oda sıcaklığı ve hees tamponu ekleyerek hücre süzgecini yıkayın.

50 mililitrelik tüpü 300 GS'de 10 dakika santrifüjleyin. Şimdi süpernatanı aspire edin ve hücre peletini istediğiniz oda sıcaklığında yeniden süspanse edin. PEB tamponu.

Süpernatanı boşaltmayın. Artık aşağı akış uygulamanıza devam edebilirsiniz. Bu prosedür kullanılarak fare akciğer dokusunun ayrışması, yüksek oranda canlı lökosit ve endotel hücresi verecektir.

Türetilmiş tek hücreli süspansiyonlar, CD 1 46 FITC veya CD 31 FITC olarak CD 45 PE ile boyandı ve akış sitometrisi ile analiz edildi. Bu grafik, CD 11 C mikro boncukları, bir minimax ayırıcı ve iki MS sütunu kullanılarak dendritik hücrelerin zenginleştirilmesini göstermektedir. Tamam. Az önce size fare akciğer dokusundan tek hücreli süspansiyonların standart bir şekilde nasıl hazırlanacağını gösterdim.

Bu yöntem dokuların verimli ve gen bir şekilde ayrıştırılmasını sağlar. Bu prosedürü yaparken, akciğeri düzgün bir şekilde incelemek ve diseksiyondan hemen sonra dokuyu işlemek önemlidir. Hazırlanan tek hücreli süspansiyonlar daha sonra daha ileri deneyler için kullanılabilir.

Örneğin, hücrelerin manyetik olarak etiketlenmesi ve daha sonra lökositlerin veya endotel hücrelerinin ayrılması. Tamam, bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde iyi şanslar.