Name: Hoechst İzolasyonu ve Karakterizasyonu Düşük CD45 Negatif Fare Akciğer Mezenkimal Kök Hücre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 55 s
Description: Öğrenin fare akciğer mezenkimal kök hücre izolasyonunu ve karakterizasyonunu akış sitometri ile. Bu yöntem, akciğer hastalıklarında doku onarımı ve immünomodülasyon çalışmaları için güvenilir bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

AHA GIA0855953G, NIH 1R01 HL091105-01: Bu çalışma SMM hibe tarafından finanse edildi. Ek destek: DW: NIH RO1DK075013, DDK ve Kléberg Vakfı; UCCC Flow Sitometri Çekirdek (NIH 5 P30 CA 46.934-15), UCCC Mikroarray çekirdekli (NCI P30 CA 46.934-14) tarafından sağlanan.

1. Akciğer İzolasyon <ol><li> Kurban steril tekniği kullanarak exsanguination tarafından takip izofluran aşırı dozda farelerin yetişkin farelerde (C57Bl6J; 18-20 g yaş 8-10 hafta). Profilleri suşları arasında biraz farklılık gösterecektir. </li><li> Cerrahi, diyafram kaldırmak, farenin her iki tarafında yanal göğüs kafesi kesim tarafından göğüs boşluğuna açılır. 3-fosfat 5mls kullanarak, hafifçe sağ kalp ventrikül perfüze akciğerlerden kan yıkayın tamponlu salin (PBS). </li><li> Tamponlu tuz (HBSS) Hanks ile dolu bir petri trakea ve büyük bronşların ve yer kaldırarak akciğer lobları parçalara ayır. Tüm akciğer lobları forseps aşağıdaki toplama çanağı kapağı üzerine doku yerleştirmek için kullanılır. Doku daha sonra float ve taşımak o kadar nemli değil tutmak için yeterli sıvı ile tek neşter kullanılarak küçük parçalar halinde doğranmış. </li><li> Farelerin biri bir hindlimb inceleyin ve flo ayarlamak için bir boyama kontrolü olarak kullanmak üzere kemik iliğinden izolew sitometri kapıları. Kemik iliği (BM) daha önce 1 açıklanan Leke. </li></ol> 2. Akciğer Doku bir Tek Hücre Süspansiyon hazırlanması <ol><li> 5mls steril HBSS çözünmüş önceden ısıtılmış% 0.2 Worthington tip 2 kollajenaz (kedi # LS004202 Biyokimyasallar Worthington, Lakewood, NJ): Her akciğer 0.2g hacmi oranı optimize edilmiş bir doku ağırlığı kullanılarak sindirilir. Karışım 30 dakika 2,3 37 ° C su banyosuna batırılır. </li><li> Akciğer dokusunda sindirimi 10ml pipet (yaklaşık 10 tekrarlar) aracılığıyla kolayca akar kadar iyi örnek Karışım. 37 ek 15 dakika boyunca inkübe ° C daha düzgün bir tek hücre süspansiyonu doku sindirir ve sağlar tamamlamak için. </li><li> HBSS ile akciğer hücre süspansiyonu seyreltilir ve kalıntı doku parçaları dağıtmak için 5ml pipet ile çiğnemek. </li><li> Filtre sindirilememiş doku parçaları kaldırmak için 70μM bir hücre süzgeç kullanarak süspansiyonu. Örnek multipl ayrılabilirBu noktada e konik tüpler tek bir hücre süzgecinden aşırı yüklenmesini önlemek ve süresini azaltmak için. </li><li> Pelet, 1500 rpm ve süzün süpernatantı 10 dakika için hücre süspansiyonu. </li><li> 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin; yeniden süspanse hücre pelletini yavaşça oda sıcaklığına eritrosit lizis tamponu (kedi # 00-4333-57 eBiosciences, San Diego, CA) kullanılarak. Lizis tamponu inaktive ve enkaz ve hücre agrega kaldırmak için 40μM bir hücre süzgeç kullanarak hücre süspansiyonu filtre HBSS bir eşit miktarda ekleyin. </li><li> Her numunenin Pipet 10μl lekeli ve hem de akciğer ve hemasitometre kullanarak BM numuneleri hücre sayıları saymak. Not: hücrelerinin toplam hacmi kaydedin. </li><li> Pelet için 1500 rpm'de 10 dakika santrifüj akciğer hücreleri tek hücre süspansiyonu. </li><li> Içeren kedi # 11.965-092)% 2 fetal bovi; prewarmed 1x10 6 hücre / ml (37 ° C) DMEM + (Dulbecco'nun modifiye Eagle orta, yüksek glukoz (Gibco, Carlsbad, CA, hem akciğer ve hem de BM hücrelerinin yeniden süspansene serum (FBS) ve 10mM Hepes. </li><li> Hoechst 33.342 boya (Sigma Chemical Company, St.Louis, MO; kedi # B2261) bir 1mg/ml stok solüsyonu hazırlayın, su ve 1,4 sterilize filtre . Hoechst boyası, -80 ° C alikotları olarak saklanabilir </li><li> Tek hücre süspansiyonu 5μg/ml nihai konsantrasyonu (1mg/ml stokunun 200x seyreltme) Hoescht 33.342 boya ekleyin. </li><li> 37 ° C su banyosunda tam 90 dakika boyunca hafifçe inversiyon ve inkübe hücreleri tarafından karıştırın. </li></ol> 3. Boyama ve Sitometrisi Analizi Akciğer Hücre Süspansiyon hazırlanması <ol><li> 90 dakika sonra Hoechst lekeli akciğer hücreleri ile tüm adımları, 4 ° C veya boya efflux önlemek için buz üzerinde yürütülmelidir. 4 az 10 dakika süreyle 1500 rpm'de santrifüj yoluyla Pelet hücreleri ° C ve buz boyama tamponu (PBS +% 2 FBS) hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Içeren PBS 2% 300 600μl kullanarak artık daha 1x10 7 hücre / tüp bir konsantrasyon yeniden süspanse hücrelerFBS ve 10mM Hepes. </li><li> Akciğer ve BM örnekleri kedi # 559.864) 10-15 dakika süreyle buz üzerinde inkübe sırasında bir lekesiz kontrolü dahil olmak üzere;. Yeterli CD45 antikoru (genellikle 1:200 seyreltme CD45 APC (BD Pharmingen, San Diego, CA tittered ekle deneysel işlemin analiz kapılarını ayarlamak için yararlıdır. </li><li> 4 Pelet hücreleri ° C 1500 rpm'de 5 dakika. Soğutulmuş boyama tamponu (PBS +% 2 FBS) 500 ul supernatant ve tekrar süspansiyon hücreleri Durusu. (; Kedinin # 14-956-1D Fisherbrand, Schaumburg, IL) prechilled ek bileşenini kap polipropilen tüplere aktarın. </li><li> 2μg/ml ölü hücreleri hariç son bir konsantrasyon için örnekler (PI, PBS içinde 200μg/ml stok) propidium iyodür ekleyin. PI, akım sitometri analizi üzerine doğru floresan bilgilerini elde etmek için Hoechst 33.342 boya ile birlikte kullanılması gerekir. </li><li> Mağaza tüpleri, buz üzerinde flow sitometri analizi kadar ışık korunmaktadır. </li></ol> 4. Sitometrisi Analizi tanımlayın ve yalıtınYan Nüfus (SP) Algılama Hoechst boyası efflux kullanarak Akciğer Mezenkimal Kök Hücre (akciğer MSC) Nüfus <ol><li> Bu testte aşağıdaki araç gereksinimleri vardır: </li><ul><li> 488 nm ve UV (350-355 nm) lazerler </li><li> UV lazer yolu üzerinde mavi (450/65) ve kırmızı (675/50) filtreleri ile 2 dedektörleri. </li><li> UV kırmızı dedektörü kırmızı sinyal için yüksek hassasiyete sahip olmalıdır. Bu, eski hücre sorters ile ilgili bir sorun olabilir. </li><li> 5-10 örnek korumak için Chiller birimi ° C </li></ul><li> Lazerler hizalayın ve hücre sıralama aşağıdaki üretici protokolü için ayarlanmış. </li><li> Kırmızı (x-ekseni) ve mavi (y-ekseni) doğrusal bir ölçek kullanılarak Hoechst sinyalleri toplayın. </li><li> Sondaki yan nüfusun yeterli görüntü için izin merkezinde arsa üzerinde sağ üst G0/G1 tepe photomultiplier tüp gerilimler ayarlayın. , Hücre döngüsü, S-faz ve tüm G2 bir kısmı arsa sağ üst ölçekli olabilir. Mavi signal kırmızı sinyal zayıfsa, nispeten parlak. Tipik MoFlo XDP (Beckman Coulter, Miami, FL) gerilimler için 425 mavi ve kırmızı için 650. </li><li> PI kullanılarak ölü hücreleri kapılı. Standart PI yolu (uyarma 488nm, emisyon 630nm) kullanılabilir. Alternatif olarak, PI de UV lazer tarafından heyecan ve ölü hücre popülasyonu, sağ tarafında yan nüfusun (SP) arsa üzerinde ölçekli yatıyor. Bu gibi FITC ve PE gibi diğer fluorochromes PI sinyal telafi etmek için ihtiyaç hafifletir. Orijinal Goodell yöntemi 5-7 ikinci prosedürleri takip etti. </li><li> Analizi sırasında nispeten düşük bir basınç farkı korumak ve yan nüfusun sıkı bir çözünürlük sağlamak için sıralama. </li><li> SP akciğer hücrelerinin ana nüfusu dışında bir yan kolu olarak görünür. Bu nüfus Hoechst düşük denir. </li><li> Hoechst düşük / SP histogram 2,3 (F kullanarak CD45 pozitif ve negatif popülasyonları ayırmak için analizigure 1). </li><li> Hoechst düşük CD45 negatif akciğer MSC nüfus seçimi ve yolluk ardından hücrelerin içine klonlar 96 plaka 3 izole etmek için, bir tüp ya da tek hücre içine da karışık bir nüfus olarak sıralayarak toplanmış olabilir . </li><li> Sıralama akışı saptırma sıralama plaka genellikle tüp sıralama için kullanılan daha fazla dikey bir sıralama akışı oluşturmak için% 25 ayarlanır için. </li><li> Sol üst üzerine bir test akışı darbe gönderip, daha sonra 96-iyi plaka iyi sağ alt sıralama akışı hedefliyoruz. </li><li> Sıralayıcı yazılım plaka harita, her bir kuyunun içine istenilen sayıda hücre yatırmak için ayarlayın. </li><li> Tek hücre klonları izole için tek bir akciğer MSC 96-iyi bir kültür ortamı 150μl (α-MEM% 20 FBS ile takviye) içine plaka kuyunun içine sıralanır. Sıralama ardından orta bir ek 100μl eklenir. </li></ol> 5. Akciğer MSC ve Klonlar izolasyonu, Kültür ve Karakterizasyonu <ol><li> Kültürsıralama aşağıdaki e karışık akciğer MSC nüfus ve tek bir hücre klonlar genişletilmesi ve standart kültür koşulları ile aynıdır (37 ° C,% 5 CO 2 ve% 95 nem). Hücreler 16 saat boyunca aşağıdaki izolasyon uymak için izin verilir. Medya (α-MEM% 20 FBS ile takviye) her 48 saatte bir değiştirilmelidir. Hücreler daha hızlı bir şekilde hızla artmaya başlar ve% 75-80 onlar geçişli kavşak (Şekil 2) arasında ulaşmak. </li><li> Hücreler prewarmed HBSS ile durulanır ve% 0,5 tripsin / EDTA (Cellgro, Manassas, VA, kedi # 25-053-Cl) ile inkübe 37 ° C 2 dakika daha az. Hücreler hücre süspansiyonu görünümünü teyit eden bir ters kapsamı kullanarak izlenir. </li><li> Akciğer MSC kültürünün mevcut proliferasyon hızı bağlı olarak 1:2 veya 1:3 oranlarında ayrılır. </li><li> Geleneksel mezenkimal adiposit ve kondrosit osteoblast soy ve kabul edilen mezenkimal belirteçlerin hücre yüzeyinde ifade ayırt etmek için akciğer MSC yeteneği iHer bir hücre hazırlama açısından değerlendirilmelidir. Sitogenetik bantlama analiz brüt kromozomal anormallikler 2,3,8-11 yokluğunda onaylamak için de yapılır . </li></ol> 6. Koloni Oluşturan Testi kullanılarak akciğer MSC sayımı (CFU-F) <ol><li> Komple MesenCult orta hücreler (Kök Hücre Teknolojileri, Vancouver, BC) 1x10 6 hücre / ml final konsantrasyonda seyreltilir. </li><li> 6x10 4 hücreler, 3x10 4 hücreler, medya 10ml 1,5 x10, 4 hücreli ve 0,75 x10 4 hücreli bir 100mm çanak final konsantrasyonları elde etmek için seri dilüsyonları gerçekleştirin . Analizler her hücre konsantrasyonu için yinelenen ya da üç nüsha halinde yapılır ve daha küçük yüzey alanları için ölçekli olabilir. </li><li> Standart şartlar altında 10 gün boyunca kültür hücreleri. Gününde 10 hücreler PBS ile yıkanır ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 100 metanol ile sabitlenir. </li><li> % 0.4 w / v Giemsa boyama çözümü ile boyanarak CFU-F koloniler Algılama(Sigma Chemical Co, St Louis, MO), deiyonize su ile 1:20 seyreltilir. Kurumaya örnekleri İzin ve koloni başına 25 veya daha fazla hücre (Şekil 3) içeren kolonilerin sayısını ölçmek. </li></ol> 7. T-hücre Silahların Yayılmasının Önlenmesi ve Apoptoz akciğer MSC Bağışıklık Özellikleri Analizi <ol><li> 6.25x10 4 akciğer MSC hücreleri de ortalama 96-kuyucuğu kaplama ve bir gecede 2 durmak için izin verilir. </li><li> CD4 + CD8 +, CD19 +, MHC-II + ve CD25 + hücreler ile tüketen ovalbumin 323-339 peptid tanıyan T hücreleri ile T-hücre reseptör (TCR) transgenik farelerin, OT-II, dalak hücreleri ile saflaştırılır Miltenyi AutoMACS hücre sıralayıcı (Miltenyi, Auburn, CA). Antijen sunan hücreler (APC), olumlu MHC-II + hücreler 12 sıralama izole edilmiştir. </li><li> APC, 4% paraformaldehid sabit PBS /% 5 BSA/2mM EDTA 3 kez yıkanmış ve 0.5μg/ml veya 5μg / m yüklül OVA323 peptid. </li><li> APC tutuklandı Simüle, büyüme, 96-kuyucuğu akciğer MSC eklenir. </li><li> Büyüktür% 95 saf CD4 + 1x10 5 hücre 5μM Carboxyfluorescein succinimidyl ester (KAKE Sigma, St.Louis MO) ile etiketli PBS içinde ve 5 dakika süreyle karanlıkta inkübe, PBS-5% BSA ile yıkanır ve sonra da eklendi DMEM% 5 FBS medya APC ve akciğer MSC hücreleri. Hücreler daha sonra 96 ​​saat inkübe edilir. </li><li> CD4 (APC Cy7), CD8 (ViolBlue); T-hücrelerinin sonra anti anti-CD40 (Cy5) ile boyanarak Vbeta 5 (PE) ve Miltenyi MacsQuant 7 kanal akış sitometresi (Miltenyi, Aurburn, CA) kullanılarak test FloJo analiz yazılımı (Treestar, Ashland, OR). Silahların Yayılmasını Önleme KAKE ortalama floresan yoğunluğunda azalma gibi arka plana göre ölçülür, T hücreleri KAKE ile etiketli ve (Şekil 4), APC için maruz kalmaz. T-hücreleri trypan mavisiyle boyama ile değerlendirildi ve canlılık bu sefer sayılır. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar: Şekil 1: Akış sitometrik analizi ve Akciğer MSC tanımı. Akciğer dokusunda sindirmek Tek hücre süspansiyonları Hoechst 33.342 ile boyanmış ve A farklılıkları saptayabilmek için flow sitometri ile analiz edilir. forward scatter (FSC) ve yan dağılım (SSC) ve B. Hoechst mavi ve kırmızı floresan. (SP) bir yan nüfusun varlığı kapı görünür. Hoechst düşük SP sonra C ayırmak için analiz edilir. CD45 negatif nüfus akciğer MSC. Akciğer SP negatif oranları CD45 pozitif tipik 70:30 / 60:40. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Akciğer MSC İzolasyon ve Kültür. Hücre sıralayarak akciğer MSC toplanması ardından, hücreleri α-MEM supplem kullanarak 30mm yemekler kaplama% 20 FBS ented. Taze sıralanmış hücreleri, küçük, yuvarlak ve parlak görünüyor. B . Mezenkimal fenotip ile yaklaşık 2-3 hafta koloniler belirginleştiği ve çoğalması daha açıktır. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3: Koloni Oluşturan Fibroblast Testi MSC sayımı Genişletilmiş akciğer MSC A., 10 gün sonra. CFU-F testi için açıklanan protokol başına kaplama ve Giemsa leke koloniler açıktır. B. Kolonileri büyük ve oluşan birkaç yüz hücrenin C. hücreler, mezenkimal fenotip gösterir . A &amp; B, Ölçek bar = 0,5 cm, C Ölçek çubuğu = 0.14 cm. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 KAKE Tabanlı T hücre Silahların Yayılmasının Önlenmesi Testi. Akciğer MSC antige varlığı ve yokluğun sunan hücreler (APC), + / - ovalbumin (OVA) CD40 pozitif efektör T hücre çoğalması (kırmızı daire) gösterir KAKE yoğunluğu azalma göstermektedir. T-hücre zarının KAKE floresan, her hücre bölünmesi yani ile stoichiometrically azalır. Her bölünme, ayrılma. + / - OVA akciğer MSC, APC, varlığı, CD40 pozitif efektör T hücre çoğalmasının (kırmızı daire) eksikliği gösterir KAKE yoğunluğu önemli bir değişiklik göstermektedir.

<ol><li>Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).</li>
<li>Jun, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pathology+of+Bleomycin+Induced+Fibrosis+is+Associated+with+Loss+of+Resident+Lung+Mesenchymal+Stem+Cells+Which+Regulate+Effector+T-Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22STEM+CELLS%22%5BJournal%5D)">The Pathology of Bleomycin Induced Fibrosis is Associated with Loss of Resident Lung Mesenchymal Stem Cells Which Regulate Effector T-Cell Proliferation.</a> STEM CELLS. , (2011).</li>
<li>Martin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+lung+side+population+cells+have+mesenchymal+stem+cell+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Adult lung side population cells have mesenchymal stem cell potential.</a> Cytotherapy. 10, 140-151 (2008).</li>
<li>Majka, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+progenitor+populations+in+skeletal+muscle+are+bone+marrow+derived+and+exhibit+different+cell+fates+during+vascular+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Distinct progenitor populations in skeletal muscle are bone marrow derived and exhibit different cell fates during vascular regeneration.</a> The Journal of Clinical Investigation. 111, 71-79 (2003).</li>
<li>Goodell, M. A., McKinney-Freeman, S., Camargo, F. D. Methods in Molecular Biology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGoodell%2C+MA+%22Basic+Cell+Culture+Protocols%22">Basic Cell Culture Protocols</a>. Helgason, D. C., Miller, C. L. 290, Humana Press. 343-352 (2005).</li>
<li>Tadjali, M., Zhou, S., Rehg, J., Sorrentino, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+Isolation+of+Murine+Hematopoietic+Stem+Cells+by+Expression+of+an%5BTitle%5D)+AND+%22Abcg2%2FGFP+Allele.+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Prospective Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells by Expression of an.</a> Abcg2/GFP Allele. Stem Cells. 24, 1556-1563 (2006).</li>
<li>Zhou, S., Schuetz, J. D., Bunting, K. D., Colapietro, A. -M., Sampath, J., Morris, J. J., Lagutina, I., Grosveld, G. C., Osawa, M., Nakauchi, H., Sorrentino, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ABC+transporter+Bcrp1%2FABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nature Medicine. 7, 1028-1034 (2001).</li>
<li>Chateauvieux, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profile+of+mouse+stromal+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Molecular profile of mouse stromal mesenchymal stem cells.</a> Physiological Genomics. 29, 128-138 (2007).</li>
<li>Gregory, C. A., Prockop, D. J., Spees, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-hematopoietic+bone+marrow+stem+cells%3A+Molecular+control+of+expansion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Non-hematopoietic bone marrow stem cells: Molecular control of expansion and differentiation.</a> Experimental Cell Research. 306, 330-335 (2005).</li>
<li>Menicanin, D., Bartold, P., Zannettino, A., Gronthos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Profiling+of+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Genomic Profiling of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 5, 36-50 (2009).</li>
<li>Summer, R., Fitzsimmons, K., Dwyer, D., Murphy, J., Fine, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+an+Adult+Mouse+Lung+Mesenchymal+Progenitor+Cell+Population%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of an Adult Mouse Lung Mesenchymal Progenitor Cell Population.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 37, 152-159 (2007).</li>
<li>Waid, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+T+cell+subset+described+as+CD4loCD40%2B+T+cells+%28TCD40%29+in+human+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">A unique T cell subset described as CD4loCD40+ T cells (TCD40) in human type 1 diabetes.</a> Clinical Immunology. 124, 138-148 (2007).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Biz başlangıçta belirli bir nüfusun ikamet akciğer MSC izole etmek için BM hematopoetik hücreleri tanımlamak için kullanılan bir yöntemdir adapte var. Izolasyon tekrarlanması nedeniyle bu hücreler daha sonra MSC olarak karakterize edilmiştir. Kökenlerine, yetişkin fare akciğer ikamet (elde edilen BM karşı) ve 2 belgelenmiş bir fenotipik ve moleküler profil olarak tanımlanmıştır . Bu karakterize nüfusun sürekli olarak izole etmek için doku homeostazı ve hastalık sırasında biyolojik önemi ve akciğer MSC rolü daha fazla çalışma yeteneği sağlar. In vivo fare ve insan akciğer dokusunda bu nüfus son tanımı, yaralanma ve hastalık sırasında akciğer onarım kolaylaştırmak için endojen hücreleri kurtarma yönelik bir tedavi stratejisi gelişimini kolaylaştırır .

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifi Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Fosfat tamponlu salin (PBS) </td><td> Sigma </td><td> P-5368 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks tamponlu tuz çözüm (HBSS) </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30588.01 </td><td></td
></tr><tr><td> % 0.2 Worthington tip 2 kollajenaz </td><td> Worthington Biyokimyasallar </td><td> LS004202 </td><td></td
></tr><tr><td> Kırmızı kan hücre lizis tamponu </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4333-57 </td><td></td
></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> 11965-092 </td><td></td
></tr><tr><td> Hoechst 33.342 boya </td><td> Sigma </td><td> B2261 </td><td></td
></tr><tr><td> CD45-APC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559864 </td><td></td
></tr><tr><td> Propidium iyodür </td><td> Sigma </td><td> 81845 </td><td></td
></tr><tr><td> a-MEM </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30265.01 </td><td>; </td
></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-069 </td><td></td
></tr><tr><td> % 0.5 &#39;lik tripsin / EDTA </td><td> Cellgro </td><td> 25-053-Cl </td><td></td
></tr><tr><td> Komple MesenCult Orta </td><td> Stem Cell Teknolojileri </td><td> 05511 </td><td></td
></tr><tr><td> % 0.4 w / v Giemsa boyama çözümü </td><td> Sigma </td><td> GS1L </td><td></td
></tr><tr><td> 4% paraformaldehid </td><td> Elektron Mikroskopi Hizmetleri </td><td> 15710 </td><td> % 16 paraformeldehyde PBS kullanılarak% 4 oranında sulandırılmış </td
></tr><tr><td> Carboxyfluorescein succinimidyl ester (KAKE) </td><td> Sigma </td><td> 21888 </td><td></td
></tr></tbody></table>

hoechst İzolasyonu ve karakterizasyonu düşük cd45 negatif fare akciğer mezenkimal kök hücre

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Doku ikamet mezenkimal kök hücreler (MSC), doku tamiri veya rejenerasyonu, fibrozis, inflamasyon, anjiyogenez ve tümör oluşumuna önemli düzenleyiciler. Bu çalışmaların yerleşik akciğer MSC, pulmoner fibrozis (PF) ve arteryel hipertansiyon (PAH) gibi hastalıklar sırasında akciğer doku homeostazı, yaralanma ve onarım sırasında bir rol oynadığını düşündürmektedir birlikte ele alındığında. Burada yerleşik akciğer MSC bir nüfus tanımlamak için bir teknoloji. Bir belirteç tanımlamanız kullanarak in vivo akciğer dokusunda bu nüfus tanımı, akım sitometri ve belirli bir hücre tipi ve fonksiyon çalışma iyi karakterize bir kök hücre popülasyonunun tekrarlanan izolasyon kolaylaştırır .

Bu yazıda, fare ikamet akciğer mezenkimal kök hücreler (akciğer MSC), genişleme, karakterizasyonu ve immünomodülatör özellikleri analiz izolasyonu göstermektedir.

Hoechst İzolasyonu ve Karakterizasyonu Düşük CD45 Negatif Fare Akciğer Mezenkimal Kök Hücre

Doku yerleşik mezenkimal kök hücreler (MKH), doku onarımı veya rejenerasyonu, fibrozis, inflamasyon, anjiyogenez ve tümör...

Bu video, konakçı düşük CD 45 negatif akciğer mezenkimal kök hücrelerinin izolasyonu için bir protokolü göstermektedir. Doku rezonan mezenkimal kök hücreler veya MSC'ler; doku onarımı veya rejenerasyonu, fibrozis, inflamasyon ve anjiyogenezin önemli düzenleyicileridir. İlk olarak, sakrifiye edilmiş bir fareden akciğerler diseke edilir.Tek hücre süspansiyonu elde etmek için akciğer dokusu sindirilir. Hücreler hoax boyası ve CD 45 ile boyanır ve konakçıya özgü düşük CD 45 negatif akciğer MSC'lerini elde etmek için akış sitometrisi ile ayrıştırılır. Akciğer MSC'leri daha sonra kültürde genişletilir ve MSC farklılaşma kapasitelerini değerlendirmek için bir koloni oluşturma analizi gerçekleştirilir.Daha sonra, MSC'lerin doku homeostazı ve hastalık sırasındaki rolünü incelemek için ek çalışmalar yürütülebilir. Burada gösterdiğimiz yöntem, fare veya insan akciğer mezenkimal kök hücrelerini izole etmek için kullanılabilir ve pulmoner fibrozis, pulmoner hipertansiyon ve KOAH gibi akciğer hastalıklarının çalışılmasına uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, doku hazırlama için mevcut yöntemlerin çeşitliliğinin yanı sıra akış sitometre kurulumu için uygun kontroller ve analizler nedeniyle zorluk yaşayabilirler.Sadece kelimelerle, hücrelerin optimum canlılığını sağlamak için akciğer dokusunun doğru kıyılma ve sindirilme tekniğini tarif etmek zor olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Ayrıca, akış sitometrisi cihazının kurulumu ve analizleri en iyi şekilde gösterim yoluyla aktarılabilir. Bu protokole, sakrifiye edilmiş yetişkin bir fareden mezenkimal kök hücreler elde etmek için kullanılacak olan akciğerleri çıkararak başlayın.Farenin her iki yanındaki göğüs kafesini küçük ve keskin bir makas kullanarak lateral olarak kesin. Göğüs boşluğunu açın ve ardından diyaframı çıkarın. Sağ kalp ventrikülüne 20,5 gauge iğneye sahip 10 mililitrelik bir şırınga yerleştirin ve akciğerlerdeki kanı temizlemek için 3-5 mililitre PBS ile perfüze etmek üzere pistonu nazikçe itin.Ardından, makas kullanarak trakeyi ve büyük bronşu kesin ve bunları atın. Sonra forseps yardımıyla, küçük beyaz akciğer loblarını alın ve Hank dengeli tuz çözeltisi veya HBSS ile doldurulmuş bir Petri kabına yerleştirin.Ardından kalbi çıkarın ve akciğer loblarını ayırın. Bu işlemi çalışmadaki tüm fareler için tekrarlayın. Akciğer loblarını kabın kapağına aktarın.Dokuların kurumasını önlemek için üzerlerine yeterli miktarda HBSS püskürterek nemlendirin. Ardından, akış sitometrisi için sürdürülebilir kontrol olarak kullanılacak kemik iliğini elde etmek amacıyla, tek kullanımlık bir bistüri ile akciğer loblarını ince parçalara ayırın. Ayak bileğinden ve femur başından kesmek için bir çift keskin makas kullanın.Uzvu yeni bir Petri kabına yerleştirin. Ardından, femurdan doğrusal bir parça ve tibia ile fibulayı içeren ikinci bir parça kalacak şekilde dizek kısmını kesin. Pens yardımıyla, tibia, fibula ve femuru açığa çıkarmak için kasları sıyırın.Şimdi, 26,5 gauge iğneye sahip beş mililitrelik bir şırınga alın ve iğneyi kemik iliği açıklığına yerleştirin. Tibianın bir ucundan kemiği tutun, diğer ucunu 15 mL HBSS ile doldurulmuş 50 mililitrelik konik bir tüpe yönlendirin ve HBSS'yi boşaltıp kemik iliğini tüpe yıkamak için pistonu bastırın. Bu işlemi fibula ve femur ile tekrarlayın.Kemik iliğini, takviye edilmiş yüksek glukozlu DMEM içerisinde final konsantrasyonu 5 µg/mL olacak şekilde host 3 3 3 4 2 boyası ile boyayın. Ardından, izole edilen dokudan akciğer dokusunun tek hücre süspansiyonu oluşturulacaktır. Her bir akciğeri, önceden ısıtılmış %0,2 Worthington içeren bir tüpe yerleştirin.Steril HBSS içinde hazırlanmış tip iki kollajenaz ekleyin, ardından tüpü 37 °C'lik bir su banyosuna daldırın ve 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, sindirilmiş örnek pipetten kolayca akana kadar 10 mL'lik pipet ile tritürasyon yapın. Yaklaşık 10 tekrar gerçekleştirin ve doku sindirimini tamamlamak için 37 °C'de 15 dakika daha inkübe edin.Sindirim işlemi tamamlandığında, hücre süspansiyonunu HBSS ile seyreltin ve kalan doku fragmanlarını tekrar dağıtmak için beş mililitrelik bir pipet kullanın. Ardından, sindirilmemiş doku fragmanlarını uzaklaştırmak için süspansiyonu 70 mikromolar bir hücre süzgecinden geçirerek 50 mililitrelik konik bir tüpe boşaltın. Numunenin hücre süzgecinden akışına izin vermek için süspansiyonu azar azar ekleyin.Sindirilmemiş doku parçaları hücre süspansiyonunun akışını tamamen engelliyorsa, süspansiyonu yeni bir hücre süzgecinden geçirerek yeni bir tüpe aktarın. Hücre süspansiyonunu 450 RCF'de 10 dakika boyunca santrifüj ederek peletleyin.Santrifüj işleminden sonra süpernatantı dökün ve hücre peletini oda sıcaklığındaki kırmızı kan hücresi liziz tamponunda nazikçe resüspande ederek beş dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Ardından, liziz tamponunu inaktive etmek için eşit hacimde HBSS ekleyin.Hücre süspansiyonunu, kalıntıları ve hücre agregatlarını uzaklaştırmak için 40 µm'lik bir hücre süzgecine dökün ve süzülen kısmı yeni bir 50 mL'lik konik tüpte toplayın. Ardından, bir hemositometre kullanarak hem akciğer hem de kemik iliği örnekleri için hücre sayılarını belirleyin. Hücre süspansiyonunun konsantrasyonunu ve toplam hacmini kaydedin.Ardından, tekli akciğer hücresi süspansiyonunu 450 RCF'de 10 dakika boyunca santrifüj ederek çöktürün. Hücreleri yaşatmak için, hem akciğer hem de kemik iliği hücrelerini önceden ısıtılmış takviyeli yüksek glukozlu DMEM içerisinde tek seferde 10⁶ hücre/mL konsantrasyonunda yeniden süspanse edin.DNA'yı boyamak için, beş mikrogram per liter final konsantrasyonuna ulaşacak şekilde HOAXED 3 3 3 4 2 boyası ekleyin. Ardından, hücreleri nazikçe ters çevirerek karıştırın ve tam olarak 90 dakika boyunca 37 °C sıcaklığındaki bir su banyosunda inkübe edin. Sonrasında, 4 °C'de 450 ×g hızda 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Akım sitometrisi ile analiz hazırlığı kapsamında, akciğer ve kemik iliği dokularının anti CD 45 ve propidyum iyodür ile boyama işlemine geçiniz. Hücreler boyandıktan sonra, tüpleri akım sitometrisi analizi gerçekleştirilene kadar ışığan korunmuş şekilde buz üzerinde saklayınız. Cihazın lazerlerinin hizalı olduğundan ve hücre ayıklama için yapılandırıldığından emin olarak akım sitometrisi için hazırlık yapınız.Kullanılan cihaz; mavi 488 nanometre, kırmızı 635 nanometre ve UV 350 ila 355 nanometre lazerlerin yanı sıra, UV lazer yolunda mavi 45/65 ve kırmızı 675/50 filtreli iki detektöre sahip olmalıdır. Ek olarak, UV kırmızı detektör kırmızı sinyal için yüksek hassasiyete sahip olmalı ve cihaz, örneği 10 °C'de tutmak için bir soğutucu ünite (chiller) ile donatılmış olmalıdır. Cihaz yazılımında, doğrusal ileri saçılım (forward scatter) ile yan saçılımı (side scatter) görüntüleyecek histogram grafikleri ve cihaza uygun bir dublet ayırt etme (doublet discrimination) grafiği ayarlanmalıdır.Log sinyal kullanan bir PI histogram grafiği, lineer sinyaller kullanan kırmızıya karşı mavi bir çizgi ve log sinyal kullanan bir CD 45 A PC histogram grafiği. Cihaz hazır olduğunda, boyanmış kemik iliği örneğini cihazın yükleme portuna yerleştirin. Bu örnek, boyama ve cihaz kurulum kontrolü olarak kullanılır.Olayları toplamaya başlayın ve ileri yönlü iç saçılım (forward inside scatter) lineer sinyallerini ayarlayın. Hücre popülasyonunu net bir şekilde görselleştirmek için, hücreler, x ekseni olarak ileri saçılımın (forward scatter) bulunduğu grafiğin yaklaşık olarak alt orta kısmında yer almalıdır. Nükleer boya PI membran geçirgen olmadığı için, canlı hücreler tarafından dışlanacaktır.PI histogramında PI pozitif ölü hücreler üzerinde bir kapı (gate) bölgesi çizin. Cihaz yazılımına, bu kapı içindeki ölü hücreleri kırmızıya boyamasını komut edin.Konak G0 G1 popülasyonunu tanımlamak için navigasyon amacıyla renkli havalandırmalı ölü hücreleri kullanmak faydalıdır. PI boyası aynı zamanda UV lazer ile uyarılır ve ölü hücrelerin çoğunluğu ölçek dışında olmalıdır. Kırmızıya karşı mavi floresans grafiğinin sağ tarafında, kemik iliğinin G0 G1 popülasyonu, kırmızıya karşı mavi grafikte olayların sıkı bir kümesi olarak görülmelidir.G sıfır G bir kümesini grafiğin merkezinin sağ üst kısmına yerleştirmek için dedektör voltajlarını ayarlayın. Hücre döngüsünün S-fazının bir kısmı ve G iki fazının tamamı ölçek dışında kalabilir. Kırmızıya karşı mavi hoax grafiğinin sağ üst kısmında, yan popülasyonun düşük değerleri, G sıfır G bir kümesinin sol tarafından grafiğin sol alt köşesine doğru uzanan bir iz şeklinde görülecektir.Şimdi FSC'ye karşı SSC grafiğinde hücre kümesinin etrafına bir kapı (gate) çizin. Dublet grafiğinde belirlenen singlet popülasyonunu ve PI histogramındaki canlı hücreleri grafik üzerinde gösterin. Ardından, yalnızca bu kapılanmış popülasyonları görüntülemek için hoax grafiğini atayın.Ana grafikte kapılama yaptıktan sonra, yan popülasyonun etrafına bir bölge çizin. Bu bölgeyi, hafif saçılım tekli hücre ve canlı hücre kapılarıyla birlikte CD 45 A PC histogramı için bir kapı olarak atayın. Sistem kurulduğuna göre, numuneyi yükleme portundan çıkarın ve akciğer örneğini yükleme portuna yerleştirin.Bu örnek için cihaz ayarlarının tekrar düzenlenmesine gerek olmamalıdır. Kırmızıya karşı mavi hileli grafikte olayları toplamaya başlayın. Akciğer örneği için G zero G one kümesi genellikle x ekseni yönünde daha uzatılmış görünür ve klavyedeki tilda sembolüne benzer.Yan popülasyon kapısı eşiği düşük seviyede olmalı ve kemik iliği örneği için ayarlanan konumla benzer bir konumda bulunmalıdır. Yan popülasyonun kesin çözünürlüğünü sağlamak için yukarı veya aşağı yönlü küçük ayarlamalar gerekebilir. Örnek akış valfinin çok fazla açılmadığından emin olarak sıralama sırasında düşük bir basınç farkını koruyun.MSC'leri izole etmek için, sıralama odasına 96 kuyucuklu bir toplama plakası yerleştirin ve pozitif ve negatif popülasyonları ayırmak için CD 45 A PC histogramı üzerindeki sıralama kapılarını ayarlayın. Son olarak, hücreleri ya bir tüpe karışık popülasyon olarak ya da klonları izole etmek için 96 kuyucuklu bir plakaya tek hücreler halinde toplayın; hücre sıralama yoluyla akciğer MSC'leri toplandıktan sonra, hücreler %20 FBS ile takviye edilmiş A MEM kullanılarak 30 milimetrelik kaplara ekilir. İlk etapta, sıralanmış hücreler yaklaşık iki ila üç hafta sonra küçük, yuvarlak ve parlak görünür.Mezenkimal fenotipe sahip koloniler belirginleşir ve her bir hücre hazırlığı için proliferasyon daha belirgin hale gelir. Akciğer MSC'lerin osteoblast, adiposit ve kondrosit gibi geleneksel mezenkimal hatlara farklılaşma yeteneğini ve kabul görmüş mezenkimal belirteçlerin hücre yüzey ekspresyonlarını değerlendirin. Kaba kromozomal anomalilerin olmadığını doğrulamak için sitogenetik bantlama analizi gerçekleştirin.Akış sitometrisi ile izolasyon ve tek hücreli klonların oluşturulmasının ardından, MSC hücrelerini ve farklılaşma yeteneklerini karakterize etmek için bir koloni oluşturma deneyi gerçekleştirilir. Mililitre başına üç x 10⁴ hücreye seyreltilmiş hücreler ile başlayın. 100 milimetrelik kaplarda, eksiksiz kültür ortamı içerisinde, her kapta 10 mililitre ortam olacak şekilde üç tekrarlı olarak sırasıyla iki x 10⁴, üç x 10⁴, 1,5 x 10⁴ ve 0,75 x 10⁴ hücre olacak şekilde seri dilüsyon yapın.Ardından, 10 günlük kültürden sonra plakları inkübatöre yerleştirin, besiyerini dökün ve hücreleri PBS ile durulayın. Sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca %100 metanol ekleyerek hücreleri sabitleyin. Beş dakika sonra metanolü dökün.Ardından koloni oluşumunu tespit etmek için, iyonize su ile 1/20 oranında seyreltilmiş ağırlıkça %0,4 gza ekleyin ve 10 ila 15 dakika inkübe edin. Sonrasında boyayı dökün ve iyonize su ile durulayın. Örneklerin havada kurumasını bekleyin ve bir ters mikroskop veya görüntüleme yöntemi kullanarak, koloni başına 25 hücreden fazla içeren koloni sayısını belirleyin.Koloniler burada gösterildiği gibi büyüktür, birkaç yüz hücreden oluşur ve mezenkimal bir fenotip sergiler. MSC'ler bu videoda gösterildiği gibi izole edilmiş ve büyüme simülasyonu için 96 kuyucuklu plakalara ekilmiştir. Ardından, durdurulmuş CFSE işaretli antijen sunan hücreler akciğer MSC'lerine eklenmiştir.İzole edilen MSC'lerin proliferasyonu daha sonra, akciğer SC yokluğunda ve antijen sunan hücrelerin varlığında, bu şekilde gösterilen yalnızca CFSE işaretli T hücrelerinden oluşan arka plana kıyasla CFSE'nin ortalama floresan yoğunluğundaki azalma olarak ölçülmüştü; APC artı eksi OVA albümin CD 40 pozitif efektör T hücreleri, kırmızıyla daire içine alınan ve proliferasyonu belirten CFSE yoğunluğunda bir azalma göstermektedir. T hücresi membranındaki CFSE floresan yoğunluğu, her hücre bölünmesiyle ekonometrik olarak azalır, yani her bölünmede yarıya iner; akciğer MSC ve APC varlığında OVA CD 40 pozitif efektör T hücreleri, CFSE yoğunluğunda anlamlı bir değişim göstermez ve bu da proliferasyon eksikliğini belirtir. Bu teknik, akciğer kök hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların, pulmoner arteriyel hipertansiyon ve pulmoner fibrozis gibi akciğer hastalıklarında mezenkimal kök hücrelerin rolünü keşfetmelerine yol açmıştır.Bu teknik uzmanlaşıldıktan sonra, bu prosedür takip edilerek yaklaşık beş saat içinde tamamlanabilir. Putatif akciğer mezenkimal kök hücrelerinin, kemik, yağ ve kıkırdak gibi uygun çoklu hat farklılaşma potansiyeli sergileyip sergilemediği dahil olmak üzere ek soruları yanıtlamak için farklılaşma analizleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

isolation-characterization-hoechstlow-cd45negative-mouse-lung

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Rat MKH, femur ve tibiaları izole edilmiş ve daha sonra manyetik hücre sıralama ile zenginleştirilmiş. Sıralama hücreler flow sitometri ile yüzey belirteçlerinin ifade teyit edildi. Bu hücreler de klonal yoğunluğu tek koloniler oluşturmak için kültüre edildi ve daha sonra bu kolonilerin klonlama silindir ile ayrıldı.

İzolasyon ve Rat Mezenkimal Kök Hücreler zenginleştirilmesi (MKH) ve MKH Türetilmiş Tek koloni Ayırma

İşte biz bütün fare karaciğer doku sindirim, hücre zenginleştirme ve flow sitometri izolasyonu gerektiren bir süreçten CD133 eksprese karaciğer kök hücre ve kanser kök hücrelerin izolasyonu tarif. Biz gelişmiş tek hücre izolasyonu ve klonal genişleme için yöntemler içerir.

Klonal Genişleme CD133 + Karaciğer Kök Hücre İzolasyonu

Fare akciğer dendritik hücreler yüksek oranda saflaştırılmış açıklanmıştır. Özgül ağırlık, geleneksel dendritik hücre alt izolasyon verilir.

Fare Akciğer Dendritik Hücrelerinin İzolasyonu

Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), çözünür faktörler veya spesifik biyomateryaller ile uyarıldıklarında osteoblastik soya doğru farklılaşma potansiyeline sahiptir. Bu çalışma, sığır kemik matrisi Nukbone'u (NKB) bir iskele olarak kullanan insan amniyotik membranından (-hMSC'ler) MSC'lerin verilmesi için yeni bir seçenek sunmaktadır.

İnsan Mezenkimal Kök Hücre İzolasyonu ve Gözenekli Kemik Matrix kendi Yetiştirme

Bu protokol, enzimatik sindirim, yoğunluk gradyanlı ayırma plastik uyumu ve CD146 + manyetik boncuk seçimi aracılığıyla, sıçanlardan primer akciğer yerleşik mezenkimal stromal hücreler elde etmek için bir izolasyon tekniği tarif etmektedir.

CD146 İzolasyonu<sup&gt; +</supSıçan Akcigerlerinden&gt; Resident Akciğer Mezenkimal Stromal hücreler

Bu iletişim kuralı insan diş kökü çıkarılan diş kök hücrelerin geçici genetik mühendisliği açıklar. Uygulanan non-viral değişiklik strateji tedavi kök hücre ürünlerin geliştirilmesi için bir temel olabilir.

Yalıtım, karakterizasyonu ve insan diş kökü kök hücrelerin genetik değişiklik mikroRNA tabanlı

Burada primer fare karaciğeri sinüzoidal endotel hücresi (LSEC) izolasyonu için bir protokol özetlenmekte ve gösterilmektedir. Protokol, karaciğer kollajenaz perfüzyonu, düşük hızlı santrifüjleme ile parankimal olmayan hücre saflaştırılması ve CD146 manyetik boncuk seçimine dayanmaktadır. Ayrıca bu izole LSEC'leri akış sitometrisi ve taramalı elektron mikroskobu kullanarak fenotipler ve karakterize ediyoruz.

Fare primer karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu

Hoxb5 muhabir sistemini kullanarak uzun süreli hematopoetik kök hücrelerin (LT-HSC'ler) ve kısa süreli HSC'lerin (ST-HSC'ler) izolasyonu için adım adım bir protokol sunuyoruz.

Uzun Süreli ve Kısa Süreli Hematopoetik Kök Hücreler için İzolasyon Yöntemi

Heterojen insan UC-MSC'lerini oluşturan üç ana alt gruptan biri olan BAMBIyüksekMFGE8yüksek MSC'lerin izolasyonu, belirli hastalıklarda klinik etkinliği artırmak için gelecekteki uygulaması için bu alt tipin özelliklerinin ve işlevlerinin tam olarak anlaşılmasına yardımcı olur. Burada, BAMBIyüksekMFGE8yüksek UC-MSC'leri sıralamak için bir yöntem sunuyoruz.

İnsan BAMBIyüksekMFGE8yüksek Göbek Kordonu Kaynaklı Mezenkimal Stromal Hücrelerin İzolasyonu

Bu protokol, canlı bağışıklık ve bağışıklık dışı popülasyonların fare akciğerinden kararlı bir durumda ve grip enfeksiyonunu takiben izolasyonunu detaylandırır. Ayrıca epitelyal ve miyeloid hücre alt kümelerini tanımlamak için geçit stratejileri sağlar.

Fare Akciğerinden Canlı Miyeloid ve Epitel Hücre Popülasyonlarının İzolasyonu

Öğrenin fare akciğer mezenkimal kök hücre izolasyonunu ve karakterizasyonunu akış sitometri ile. Bu yöntem, akciğer hastalıklarında doku onarımı ve immünomodülasyon çalışmaları için güvenilir bir protokol sunar.

Hoechst İzolasyonu ve Karakterizasyonu^Düşük CD45^Negatif Fare Akciğer Mezenkimal Kök Hücre

Daha fazla video keşfet