Hoechst İzolasyonu ve Karakterizasyonu ^Düşük CD45 ^Negatif Fare Akciğer Mezenkimal Kök Hücre

Bu video, konak düşük CD 45 negatif akciğer mezenkimal kök hücrelerinin izolasyonu için bir protokolü göstermektedir. Doku rezonans mezenkimal kök hücreleri veya MSC'ler, doku onarımı veya rejenerasyonu, fibroz, inflamasyon ve anjiyogenezin önemli düzenleyicileridir. İlk olarak, akciğerler kurban edilen bir fareden çıkarılır.

Akciğer dokusu, tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için sindirilir. Hücreler sahte kalıp ve CD 45 ile boyanır ve konak düşük CD 45 negatif akciğer MSC'leri elde etmek için akış sitometrisi ile sıralanır. Akciğer MSC'leri daha sonra kültürde genişletilir ve MSC farklılaşma yeteneklerini değerlendirmek için bir koloni oluşturma testi yapılır.

Daha sonra doku homeostazı ve hastalığı sırasında MSC'lerin rolünü incelemek için daha ileri çalışmalar yapılabilir. Burada gösterdiğimiz yöntem, fare veya insan akciğer mezenkimal kök hücrelerini izole etmek için kullanılabilir ve pulmoner fibroz, pulmoner hipertansiyon ve KOAH gibi akciğer hastalıklarının bu çalışmasına uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, doku hazırlığı için mevcut yöntemlerin çeşitliliğinin yanı sıra akış sitometresi kurulumu, uygun kontroller ve analizler nedeniyle mücadele edeceklerdir.

Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir, çünkü hücrelerin optimal canlılığı için akciğer dokusunun kıyılması ve sindirilmesi için uygun tekniği yalnızca kelimelerle tanımlamak zordur. Ayrıca, akış sitometrisi cihazının kurulumu ve analizleri en iyi şekilde gösteri yoluyla iletilir. Bu protokole, kurban edilmiş bir yetişkin fareden mezenkimal kök hücre elde etmek için kullanılacak akciğerleri çıkararak başlayın.

Göğüs kafesini farenin her iki tarafında yanlamasına kesmek için küçük bir çift keskin makas kullanın. Göğüs boşluğunu açın, ardından diyaframı çıkarın. Sağ kalp ventrikülüne 20 buçuk gauge iğne ile 10 mililitrelik bir şırınga yerleştirin ve pistonu üç ila beş mililitre PBS ile perfüze etmek için hafifçe bastırın ve kanı akciğerlerden yıkayın.

Daha sonra, makas kullanarak trakea ve büyük broncu kesin ve atın. Sonra forseps kullanarak. Küçük beyaz akciğer loblarını alın ve bunları hank'in tamponlu tuzlu su veya HBSS ile doldurulmuş bir Petri kabına yerleştirin.

Sonra kalbi çıkarın ve akciğer loblarını ayırın. Çalışmadaki tüm fareler için bu işlemi tekrarlayın. Akciğer loblarını yemeğin kapağına aktarın.

Dokuyu kurumasını önlemek için yeterli HBSS ile nemlendirin. Daha sonra tek kullanımlık bir neşter kullanarak, akış sitometrisi için sürdürme kontrolünü kullanmak üzere kemik iliği elde etmek için akciğer loblarını kıyın. Ayak bileğini ve uyluk kemiğinin üst kısmını kesmek için keskin bir makas kullanın.

Uzvu yeni bir Petri kabına yerleştirin. Daha sonra dizini kesin, doğrusal bir uyluk kemiği parçası ve tibia ve fibulayı içeren ikinci bir parça bırakın. Forseps kullanarak tibia, fibula ve uyluk kemiğini ortaya çıkarmak için kası çekin.

Şimdi 26 buçuk gauge iğne ile beş mililitrelik bir şırınga alın ve iğneyi kemik iliği açıklığına yerleştirin. Tibianın bir ucunda, kemiği diğer ucu 15 mililitre HBSS ile doldurulmuş 50 mililitrelik konik bir tüpe yönlendirilmiş olarak tutun ve HBSS'yi dağıtmak ve kemik iliğini tüpe akıtmak için pistona bastırın. Bu işlemi bir fibula ve uyluk kemiği ile tekrarlayın.

Kemik iliğini, takviye edilmiş yüksek glikoz DMEM'de mililitre başına beş mikrogramlık bir son konsantrasyonda konakçı 3 3 3 4 2 kalıbı ile boyayın. Daha sonra, izole edilen dokudan tek hücreli bir akciğer dokusu süspansiyonu oluşturulacaktır. Her akciğeri ön ısıtma% 0.2 Worthington içeren bir tüpe yerleştirin.

Steril HBSS'de hazırlanan iki kollajenaz yazın, daha sonra tüpü 37 derece santigrat su banyosuna daldırın ve 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, sindirim pipetten kolayca akana kadar numuneyi tritrate etmek için 10 mililitrelik pipeti kullanın. Yaklaşık 10 tekrar, doku sindirimini tamamlamak için 37 santigrat derece olan 15 dakika daha inkübe edilir.

Sindirim tamamlandıktan sonra, hücre süspansiyonunu HBSS ile seyreltin ve kalan doku parçalarını dağıtmak için tekrar denemek için beş mililitrelik bir pipet kullanın. Daha sonra, sindirilmemiş doku parçalarını çıkarmak için, süspansiyonu 70 mikromolar hücre süzgecinden 50 mililitrelik konik bir tüpe dökün. Numunenin hücre süzgecinden akmasına izin vermek için her seferinde azar azar süspansiyon ekleyin.

Sindirilmemiş doku parçaları ise hücre süspansiyonunun akışını tamamen engeller. Yeni bir hücre süzgecinden yeni bir tüpe dökün. Hücre süspansiyonunu 450 RCF'de 10 dakika boyunca peletleyin.

Döndürmeyi takiben, süpernatanı boşaltın ve hücre peletini oda sıcaklığında nazikçe yeniden süspanse edin. Kırmızı kan hücresi lizis tamponu, oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Daha sonra lizis tamponunu etkisiz hale getirmek için eşit miktarda HBSS ekleyin.

Kalıntıları ve hücre agregalarını çıkarmak için hücre süspansiyonunu 40 mikromolar hücre süzgecine dökün ve akışı yeni bir 50 mililitrelik konik tüpte toplayın. Daha sonra, bir hemo sitometre kullanarak, hem akciğer hem de kemik iliği örnekleri için hücre sayılarını belirleyin. Hücre süspansiyonunun konsantrasyonunu ve toplam hacmini kaydedin.

Daha sonra, tek akciğer hücresi süspansiyonunu 10 dakika boyunca 450 RCF'de santrifüjleme ile peletleyin. Hücreleri sürdürmek için hem akciğer hem de kemik iliği hücrelerini aynı anda yeniden askıya alın. Ön ısıtma takviyeli yüksek glikoz DMEM'de mililitre başına 10 ila altı hücre.

DNA'yı boyamak için, litre başına beş mikrogramlık bir nihai konsantrasyona kadar HOAXED 3, 3, 3, 4, 2 boyası ekleyin. Daha sonra, hücreleri hafifçe ters çevirerek karıştırın ve 37 santigrat derece su banyosunda tam olarak 90 dakika inkübe edin. Daha sonra sıkmadan sonra dört santigrat derecede 450 Gs'de 10 dakika santrifüjleyin.

Akış sitometrisi ile analize hazırlanırken akciğer ve kemik iliği dokusunun anti CD 45 ve propidyum iyodür ile boyanmasına devam edin. Hücreler boyandıktan sonra, akış sitometrisi analizi yapılana kadar tüpleri ışıktan korunan buz üzerinde saklayın. Alet lazerlerinin hizalandığından ve hücre sıralaması için ayarlandığından emin olarak akış sitometrisine hazırlanın.

Kullanılan cihaz, mavi 488 nanometre, kırmızı 635 nanometre ve UV 350 ila 355 nanometre lazerlerle, UV lazer yolu üzerinde iki dedektörle, mavi 45 üzeri 65 ve kırmızı 6 75 üzeri 50 filtreli olmalıdır. Ek olarak, UV kırmızı dedektörü kırmızı sinyal için yüksek hassasiyete sahip olmalı ve numuneyi 10 santigrat derecede tutmak için cihaz bir soğutucu ünitesi ile donatılmalıdır. Cihaz yazılımında, enstrüman için uygun bir ikili ayrım grafiği olan doğrusal ileri ve yan saçılmayı görüntülemek için histogram grafiklerini ayarlayın.

Bir log sinyali kullanarak PI'nin histogram grafiği, doğrusal sinyaller kullanarak kırmızıya karşı mavi sahil ve bir log sinyali kullanan CD 45 A PC'nin histogram grafiği. Cihaz hazır olduğunda, lekeli kemik iliği örneğini aletin yükleme portuna yerleştirin. Bu örnek, boyama ve alet kurulum kontrolü olarak kullanılır.

Olayları toplamaya başlayın ve ileri iç saçılma doğrusal sinyallerini ayarlayın. Hücre popülasyonunu net bir şekilde görselleştirmek için, hücreler yaklaşık olarak x ekseni olarak grafiğin ileri saçılımının alt merkezinde bulunmalıdır. Nükleer leke PI, membran IMP geçirgen olduğundan, canlı hücrelerden çıkarılacaktır.

PI histogramındaki PI pozitif ölü hücreler üzerine bir yürüyüş bölgesi çizin. Cihaz yazılımına ölü hücreleri renklendirmesi talimatını verin. Bu kapıda kırmızı.

Renkli havalandırmalı ölü hücreleri, konakçı G sıfır G bir popülasyonu tanımlamak için bir gezgin olarak kullanmak yararlıdır. PI lekesi de UV lazer tarafından uyarılır ve ölü hücrelerin çoğu ölçek dışı olmalıdır. Kırmızıya karşı maviye karşı sahte floresan grafiğinin sağ tarafında, kemik iliğinin G sıfır G bir popülasyonu, kırmızıya karşı mavi aldatmaca grafiğinde sıkı bir olay kümesi olarak görülmelidir.

G sıfır G bir kümesini grafiğin merkezinin sağ üst köşesine yerleştirmek için dedektör voltajlarını ayarlayın. S fazının bir kısmı ve hücre döngüsünün tüm G ikisi ölçek dışı olabilir. Kırmızıya karşı maviye karşı sahte grafiğin sağ üst köşesinde, düşük ev sahibi yan popülasyon, G sıfır G bir kümenin sol tarafından grafiğin sol alt köşesine kadar takip ederken görülecektir.

Şimdi FSC'ye karşı SSC'deki hücre kümesinin etrafına bir kapı çizin. İkili çizimde tanımlanan singlet popülasyonunu ve PI histogramındaki canlı hücreleri çizin. Ardından, yalnızca bu geçitli popülasyonları görüntülemek için sahte grafiği atayın.

Ana bilgisayar grafiğini geçitledikten sonra, yan popülasyonun etrafına bir bölge çizin. Bu bölgeyi, ışık saçılma singlet ve canlı hücre kapıları ile birlikte CD 45 A PC histogramına bir geçit olarak atayın. Artık sistem kurulduğuna göre, numuneyi yükleme portundan çıkarın ve akciğer numunesini yükleme portuna yerleştirin.

Bu numune için cihaz ayarlarının tekrar yapılmasına gerek yoktur. Kırmızıya karşı mavi aldatmaca planındaki olayları toplamaya başlayın. Akciğer örneği için G sıfır G bir küme genellikle x ekseni yönünde daha uzun görünür ve klavyedeki tilda sembolüne benzer.

Yan popülasyon yürüyüş aldatmacası düşük, kemik iliği örneği için ayarlanana benzer bir konumda olmalıdır. Yan popülasyonun sıkı bir şekilde çözülmesini sağlamak için yukarı veya aşağı bu küçük ayarlamalar gerekli olabilir. Numune akış valfinin çok fazla açılmadığından emin olarak sıralama sırasında düşük basınç farkını koruyun.

MSC'yi izole etmek için yanında, sıralama odasına 96 kuyulu bir toplama plakası yerleştirin ve pozitif ve negatif popülasyonu ayırmak için CD 45 A PC histogramındaki sıralama kapılarını ayarlayın. Son olarak, hücre sıralaması ile akciğer MSC'nin toplanmasını takiben klonları 96 oyuklu bir plakaya izole etmek için hücreleri karışık bir popülasyon olarak bir tüpe veya tek hücrelere toplayın, hücreler% 20 FBS ile desteklenmiş bir MEM kullanılarak 30 milimetrelik tabaklarda kaplanır. İlk olarak, sıralanmış hücreler yaklaşık iki ila üç hafta sonra küçük, yuvarlak ve parlak görünür.

Mezenkimal fenotipe sahip koloniler belirginleşir ve her hücre hazırlığı için proliferasyon daha belirgindir. Akciğer MSC'nin osteoblast, adiposit ve kondrositin geleneksel mezenkimal soylarına ve kabul edilen mezenkimal belirteçlerin hücre yüzeyi ekspresyonuna farklılaşma yeteneğini değerlendirin. Brüt kromozomal anormalliklerin olmadığını doğrulamak için sitogenetik yasaklama analizi yapın.

Akış sitometrisi ile izolasyonu ve tek hücre klonlarının oluşturulmasını takiben, MSC hücrelerini ve farklılaşma yeteneklerini karakterize etmek için bir koloni oluşturma testi gerçekleştirilir. Mililitrede dört hücrenin 10'unun üç katına seyreltilmiş hücrelerle başlayın. 100 milimetrelik tabaklarda eksik kültür ortamı, üç mililitre ortamda tabak başına iki, altı kez dördün 10'u, üç kez dördün 10'u, 1.5 çarpı 10'un dörde ve 0.75 kez 10'a dört hücreye üç kopya halinde tahıl seyreltme yapın.

Daha sonra 10 günlük kültürden sonra plakaları inkübatöre yerleştirin, ortamı dökün ve hücreleri PBS ile durulayın. Daha sonra oda sıcaklığında beş dakika boyunca% 100 metanol ekleyerek sabitleyin. Beş dakika sonra metanolü boşaltın.

Daha sonra koloni oluşumunu tespit etmek için, iyonize su ile 10 ila 15 dakika inkübe edilmiş bir ila 20 oranında seyreltilmiş hacimce ağırlıkça %0.4 gza ekleyin. Sonra lekeyi dökün ve iyonize su ile durulayın. Numunelerin havada kurumasına izin verin ve ters çevrilmiş bir mikroskop veya görselleştirme kullanarak koloni başına 25'ten fazla hücre içeren koloni sayısını ölçün.

Koloniler büyüktür ve burada gösterildiği gibi birkaç yüz hücreden oluşur ve mezenkimal bir fenotip gösterir. MSC, bu videoda gösterildiği gibi izole edildi ve büyümeyi simüle eden 96 oyuklu plakada kaplandı. Tutuklanan CFSE işaretli antijen sunan hücreler daha sonra akciğer MSC'lerine eklendi.

İzole MSC'lerin proliferasyonu daha sonra, bu şekilde gösterildiği gibi tek başına CFSE etiketli T hücreleri olan arka plana kıyasla CFSE'nin ortalama floresan yoğunluğundaki azalma olarak ölçüldü, akciğer SC'nin yokluğunda ve antijen sunan hücrelerin varlığında, A PC artı eksi O albümin CD 40 pozitif etkili T hücresi CFSE yoğunluğunda bir azalma gösterir, bu da kırmızı daire içine alınmış çoğalmayı gösterir. T hücre zarının CFSE floresan yoğunluğu her hücre bölünmesi ile ekonometrik olarak azalır, yani akciğer varlığında her bölünmede bir yarı, M-S-C-A-P-C artı eksi OVA, CD 40 pozitif etkilenen T hücreleri, CFSE yoğunluğunda önemli bir değişiklik göstermez, bu da proliferasyon eksikliğini gösterir. Bu teknik, akciğer kök hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların, pulmoner arteriyel hipertansiyon ve pulmoner fibroz gibi akciğer hastalıklarında mezenkimal kök hücrelerin rolünü keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik yaklaşık beş saat içinde yapılabilir. Farklılaşma testleri gibi diğer yöntemler, varsayılan akciğer mezenkimal kök hücrelerinin uygun çoklu soy farklılaşması gösterip göstermediği, kemik yağı ve kıkırdak potansiyeli olup olmadığı gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.