Dört Transkripsiyon Faktör Fare Embriyonik Fibroblastlar yeniden programlanması Bağlı Pluripotent Kök Hücre Üretimi, Doksisiklin lentiviral İletim Sistemi Đndüklenebilir

Merhaba, benim adım Brad Hamilton. STEM Gen bünyesindeki araştırma ve geliştirme departmanındayım. Bugün size fare embriyonik fibroblastlarından indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin nasıl üretileceğine dair bir prosedür göstereceğiz.

Bu prosedür, hemle indüklenmiş pluripotent kök hücreler üretmek hem de yeniden programlama sürecini incelemek için kullanılabilir. Öyleyse başlayalım. Mouse embriyonik fibroblastları veya MEF hücrelerini, kap başına 4 × 10⁵ hücre yoğunluğunda, 15 cm'lik jelatin kaplı bir kaba ekerek başlayın.

Şimdi 30 mililitre meth büyüme besiyeri ekleyin ve hücreleri, yaklaşık %80 konfluens düzeyine ulaşana kadar 37 °C ve %5 karbondioksit altında iki gün inkübe edin. İnkübasyon tamamlandığında besiyerini aspire edin ve konsantre lentivirüs ile desteklenmiş 30 mililitre büyüme besiyeri ekleyin.

Besiyerinin eşit şekilde dağıldığından emin olmak için kabı hafifçe sallayın. Viral transdüksiyon işlemini tamamlamak için hücreleri gece boyunca 37 °C'de ve %5 karbondioksit ortamında inkübe edin. Şimdi doksisiklin ile indüklenen yeniden programlamaya geçelim.

Yeniden programlamayı başlatmak için, transdüksiyondan 20 ila 24 saat sonra transdükte edilen hücreleri tripsinleyin ve 200 Gs'de beş dakika santrifüjleyin. Ardından, hücre peletinin üzerindeki medyumu dikkatlice aspire edin ve hücreleri büyüme medyumunda yeniden süspanse edin. Süspansiyon hazır olduğunda, transdükte edilen hücreleri kullandığınız hücre kültürü kabı boyutuna uygun konsantrasyonda ekimleyin.

Burada, yeniden programlama verimliliği deneyleri ve iPS koloni izolasyonu için 10 cm'lik kap başına 2,5 × 10⁵ hücre ve immünokimya deneyleri için dört kuyucuklu plaklarda kuyucuk başına 2 × 10⁴ hücre kullanıyoruz. Transdüksiyon verimliliğini izlemek için hücreleri 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında gece boyunca inkübe edin. Bu aşamada hücreler, gerekirse gelecekteki analizler için sıvı azot içerisinde dondurulabilir.

Ertesi gün, besiyerini aspire edin ve bunu, final konsantrasyonu 2 µg/mL olacak şekilde doksisiklin ile takviye edilmiş taze büyüme besiyeri ile değiştirin. Kontrol grubu olarak doksisiklin içermeyen besiyeri içeren bir negatif kontrol ekliyoruz. Son olarak, hücreleri 37 °C ve %5 CO2 ortamında inkübe edin.

Yeniden programlama sürecini başlattık. Genel olarak, pluripotent kök hücre kolonileri 16 ila 22 gün sonra izolasyon için yeterli büyüklüğe ulaşacaktır.

Bu prosedürü göstermeden önce, önce transdüksiyon verimliliğini belirlemek için kimyasal yöntemlerle transdüksiyon verimliliğini doğrulamamız gerekir. İmmünokimyasal testler, doksisiklin indüksiyonundan 48 saat sonra dört kuyucuklu plakalara yeniden ekilen hücreler üzerinde gerçekleştirilir. Bu protokolde belirtilen tüm hacimler, hücre kültürü plak boyutuna göre ayarlanmalıdır; işlemle hücrelerin nazikçe yıkanmasıyla başlayın.

Magnezyum veya kalsiyum iyonu içermeyen PBS ile yıkadıktan sonra, hücreleri PBS içindeki %4 paraformaldehit'in 500 microliters ile 15 dakika boyunca sabitleyin. Oda sıcaklığında, hücreleri tekrar nazikçe iki kez PBS ile yıkayın. Ardından, 500 microliters buz gibi soğuk PBS içindeki %0,2 Tween 20 ekleyerek hücreleri permeabilize edin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Hücreler iki kez daha yıkandıktan sonra, spesifik olmayan antikor bağlanmasını engellemek için oda sıcaklığında bir saat boyunca 200 µL bloklama tamponu ekleyin. Ardından 200 µL istenen primer antikoru ekleyin.

Burada pluripotensite belirteçleri T 4K LF four, SOX two ve cmic kullanıyoruz. Hücreleri gece boyunca 4 °C'de inkübe edin. Ertesi gün, hücreleri PBS ile nazikçe iki kez yıkadıktan sonra, plakları ışıktan koruyarak oda sıcaklığında bir saat boyunca 200 µL sekonder antikor ile inkübe edin.

Burada, inkübasyon sonrası evirt floresan mikroskop ile görüntüleme yapmak için floroforlarla konjuge edilmiş uygun sekonder antikorlar kullanıyoruz. Hücreleri iki kez daha yıkayın ve ardından çekirdekleri görüntülemek için DPI ekleyip tekrar 10 dakika inkübe edin. Son olarak, son bir yıkamanın ardından, transdüksiyon verimliliğini belirlemek için hücreleri evirt floresan mikroskop ile görüntülemeden önce antifa aqua mount ekleyin.

Pluripotens kök hücrelerin izolasyonuna ve genişletilmesine başlayın. Reprogramlama sürecini başlattıktan sonra, kültürleri her gün takip edin ve uygun besiyerini her 48 saatte bir değiştirin. Hücreleri ilk 12 gün boyunca kültüre etmek için doksisiklin takviyeli besiyeri kullanıyoruz ve ardından doksisiklini besiyerinden uzaklaştırıyoruz.

Ekspansiyon için manuel olarak seçilen indüklenmiş pluripotent kök hücre veya iPS kolonileri doksisiklinle indüklenmiştir. Bağımsız hücreler, yeniden programlama sürecini gösteren morfolojik değişiklikler açısından günlük olarak izlenmelidir. Her deney farklılık gösterecektir, ancak koloniler genellikle DS indüksiyonundan sonraki 16 ila 22 gün arasında, yeniden programlanmış kolonilerin izole edilmesi ve tripsinizasyonu işlemine başladığınız günden bir gün önce izolasyon için yeterince büyük hale gelir.

Kuyucuk başına 5 × 10⁴ hücre yoğunluğunda, gama ışınlanmış met feeder tabakası ekerek 24 kuyucuklu bir plak hazırlayın. Hücreleri 37 °C ve %5 karbon dioksit ortamında gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, her bir iPS kolonisini manuel olarak seçin ve hücre agregatlarını ayrıştırmak için tripsinize edin; iPS hücrelerini, daha önce hazırlanan 24 kuyucuklu plağın münferit kuyucuklarına fare embriyonik kök hücre besiyerinde yeniden ekleyin ve hücreleri 37 °C ve %5 karbon dioksit ortamında inkübe edin.

Besiyerini her 24 saatte bir değiştirin. iPS kolonilerini büyüme ve GFP floresansı açısından günlük olarak izleyin. Pluripotens analizi için dört kuyucuklu plakalara aktarmadan önce kültürlerimizi altı gün boyunca inkübe ettik.

24'lü tekerlek plakanın hangi kuyucuklarının homojen şekilde GFP ekspresyonu gösterdiğini belirleyin; iyi GFP ekspresyonu olan kuyucuklar tripsinize edilebilir ve gama ışınlı mes feeder tabakaları önceden hazırlanmış dörtlü kuyucuk plakalarına bire sekiz oranında pasajlanabilir. Bu plakalar, pluripotens analizi başlangıcı için pluripotens ICC analizlerinde kullanılabilir. Hücreleri, magnezyum veya kalsiyum iyonu içermeyen PBS ile nazikçe iki kez yıkayın.

Her kuyucuğa 0.5 mililitre buz soğukluğunda %0,2 PBS içinde 20 ekleyin ve hücreleri 10 dakika boyunca inkübe edin. PBS ile üç yıkama daha yaptıktan sonra, spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için 200 mikrolitre bloklama tamponu ile oda sıcaklığında bir saat boyunca bloklayın. Şimdi 200 mikrolitre istenen primer antikoru ekleyin.

Burada SSEA-1, nanog ve OCT4 kullandık; hücreleri 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Hücreleri nazikçe iki kez yıkadıktan sonra, ışıktan koruyarak oda sıcaklığında bir saat boyunca 200 µL sekonder antikor ile inkübe edin. Görselleştirme için fluoro force ile konjuge edilmiş uygun sekonder antikorlar kullanıyoruz; evirt edilmiş floresan mikroskop kullanarak, iki yıkama daha yaptıktan sonra DPI ekleyin ve hücreleri 10 dakika boyunca inkübe edin.

Son yıkamanın ardından, hücreleri ters floresan mikroskobu ile görüntülemeden önce antifa aqua mount ekleyin. IPS kolonları, ticari olarak mevcut kitler kullanılarak alkali fosfataz aktivitesi açısından da analiz edilebilir. Stem gent docs indüklenebilir fare TF lentivirüs seti, MES'lerin transduksiyonundan sonra transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonu ile MES'leri IPS hücrelerine yeniden programlamak için kullanılabilir.

Doksiklisin ile işlem görmüş hücrelerde T four, SOX two, KLF four ve seic tespit edilebilirken, işlem görmemiş hücrelerde çok az ifade tespit edilebilir veya hiç tespit edilemeyebilir. Morfolojik değişiklikler, zamanla belirgin koloni kenarlarına ve üç boyutlu büyümeye sahip, daha büyük ve daha fazla ES hücresi benzeri kolonilerin oluşmasıyla ilerleyecektir. Doksiklisin kaldırıldığında, bazı ES hücresi benzeri kolonilerde hücresel morfolojide belirgin bir geri dönüş gerçekleşir.

Ancak, kolonilerin çoğu iPS morfolojisini korumuştur. Bu iPS kolonileri seçilip pasajlandığında; alkali fosfataz, Nanog, Oct4 ve SSEA1 gibi tipik pluripotentlik belirteçlerinin ekspresyonunu göstermektedir.

Bu deneyde kullanılan meth hücreleri, endojen nag lokusundan GFP eksprese etmiştir. Bu nedenle, pluripotens durumuna yeniden programlandıklarında, GFP ekspresyonu başarılı yeniden programlama için öncül bir gösterge olarak kullanılabilir. Dört transkripsiyon faktörlü doksisiklin indüklenebilir antiviral sistem kullanarak, fare embriyonik fibroblastlarının indüklenmiş pluripotent kök hücrelere yeniden programlanmasını nasıl gerçekleştireceğinizi göstermiş olduk.

Bu prosedür uygulanırken, yeniden programlama deneyleri tasarlanırken yeniden programlama verimliliğini optimize etmek için birkaç değişkenin göz önünde bulundurulması gerektiğinin hatırlanması önemlidir. İlk olarak, primer enfeksiyon aşamasında aktif virüs ile hedef hücre oranı, transdüksiyon verimliliğini artırmak veya azaltmak için değiştirilebilir; böylece hedef hücre popülasyonundaki entegre virüs sayısı etkilenebilir. İkinci olarak, hücrelerin dokümanlara maruz kaldığı sürenin ayarlanması, oluşturulan iPS kolonilerinin sayısını etkileyebilir.

Üçüncü olarak, hedef hücrelerin proliferasyon kapasitesi yeniden programlamayı etkileyebilir; çünkü aktif olarak büyüyen ve bölünen hücreler yeniden programlamaya daha yatkındır. Son olarak, protokol farklı hücre sayıları veya farklı boyutlardaki doku kültürü kapları için modifiye edilirken, hedef hücre sayılarının kültür kabının yüzey alanıyla orantılı olarak ayarlanması önerilir. İşte hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.