Dört Transkripsiyon Faktör Fare Embriyonik Fibroblastlar yeniden programlanması Bağlı Pluripotent Kök Hücre Üretimi, Doksisiklin lentiviral İletim Sistemi Đndüklenebilir

Merhaba, benim adım Brad Hamilton. Bugün size fare embriyonik fibroblastlarından indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin nasıl üretileceğine dair bir prosedür göstereceğiz.

Bu prosedür hem indüklenmiş pluripotent kök hücreler üretmek hem de yeniden programlama sürecini incelemek için kullanılabilir. Öyleyse başlayalım. Fare embriyonik fibroblastlarını veya metamfetamin hücrelerini, tabak başına beşinci hücrelerin dört katı 10 yoğunlukta 15 santimetre jelatin kaplı bir tabağa tohumlayarak başlayın.

Şimdi 30 mililitre metamfetamin büyüme ortamı ekleyin ve hücreleri iki gün boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte yaklaşık% 80 birleşene kadar inkübe edin. Bittiğinde, inkübe ortamı aspire edin ve 30 mililitre büyüme ekleyin. Konsantre lentivirüs ile desteklenmiş ortam.

Ortamın eşit dağılımını sağlamak için tabağı hafifçe sallayın. Hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte viral transdüksiyon tamamlandığında inkübe edin. Doksisiklin kaynaklı yeniden programlamaya geçelim.

Transdüksiyondan 20 ila 24 saat sonra yeniden programlamaya başlamak için, tripsin transdüksiyon hücreleridir ve bunları beş dakika boyunca 200 Gs'de santrifüjleyin. Daha sonra, ortamı hücre peletinden dikkatlice aspire edin ve hücreleri büyüme ortamında yeniden süspanse edin. Tohum askıya alındıktan sonra, kullandığınız hücre kültürü kabı boyutu için uygun bir konsantrasyonda dönüştürülür.

Burada, verimlilik deneylerini ve IPS koloni izolasyonunu yeniden programlamak için 10 santimetrelik çanak başına 2,5 kez 10 ila beşinci hücre ve immünokimya deneyleri için dört oyuklu plakada kuyu başına iki kez 10 ila dördüncü hücre kullanıyoruz. Transdüksiyon verimliliğini izlemek için, hücreleri gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Bu aşamada, gerekirse hücreler gelecekteki analizler için sıvı nitrojen içinde dondurulabilir.

Ertesi gün, ortamı aspire edin ve mililitre başına iki mikrogramlık bir nihai konsantrasyona kadar doksisiklin ile takviye edilmiş taze büyüme ortamı ile değiştirin. Doksisiklin içermeyen ortam içeren bir negatif kontrol ekliyoruz. Son olarak, hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.

Yeniden programlama sürecini başlattık. Genelde. Pluripotent kök hücre kolonileri 16 ila 22 gün sonra izolasyon için yeterince büyük olacaktır.

Bu prosedürü göstermeden önce, iletim verimliliğini belirlemek için kimya kullanarak iletim verimliliğini doğrulamamız gerekir. İmmünokimya testi, doksisiklin indüksiyonundan 48 saat sonra dört oyuklu plakalarda yeniden kaplanan hücreler üzerinde gerçekleştirilir. Bu protokolde listelenen tüm hacimler, hücreleri nazikçe yıkayarak başlayarak hücre kültürü plakası boyutuna göre ayarlanmalıdır.

Magnezyum veya kalsiyum iyonları içermeyen PBS ile bir kez, hücreleri 15 dakika boyunca PBS'de 500 mikrolitre% 4 paraform aldehit ile sabitleyin. Oda sıcaklığında, hücreleri PBS ile iki kez nazikçe yıkayın. Daha sonra, PBS'de 500 mikrolitre buz gibi soğuk %0.2 ekleyerek hücrelere nüfuz edin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Hücreleri iki kez daha yıkadıktan sonra. Spesifik olmayan antikor bağlanmasını engellemek için oda sıcaklığında bir saat boyunca 200 mikrolitre bloke edici tampon ekleyin. Şimdi istenen primer antikorun 200 mikrolitresini ekleyin.

Burada T 4K LF dört, SOX iki ve cmic pluripotens belirteçlerini kullanıyoruz. Hücreleri ertesi gün gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Hücreleri PBS ile iki kez nazikçe yıkadıktan sonra, plakaları ışıktan koruyarak oda sıcaklığında bir saat boyunca 200 mikrolitre ikincil antikor ile inkübe edin.

Burada, inkübasyonu takiben ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu kullanarak, görselleştirme için floro dörtlü ile konjuge edilmiş uygun ikincil antikorları kullanıyoruz. Hücreleri iki kez daha yıkayın ve ardından DPI ekleyin ve çekirdekleri görselleştirmek için tekrar 10 dakika inkübe edin. Son olarak, son bir yıkamadan sonra, transdüksiyon verimliliğini belirlemek için hücreleri ters çevrilmiş floresan mikroskobu ile görüntülemeden önce antifa aqua mount ekleyin.

Pluripotent kök hücrelerin izolasyonuna ve genişlemesine başlayın. Yeniden programlama sürecini başlattıktan sonra, kültürleri her gün izleyin ve uygun ortamı her 48 saatte bir değiştirin. İlk 12 gün boyunca hücreleri kültürlemek için doksisiklin takviyeli ortam kullanıyoruz ve daha sonra doksisiklini ortamdan buna kadar çıkarıyoruz.

Genişleme için manuel olarak seçilen indüklenmiş pluripotent kök hücre veya IPS kolonileri doksisiklin'dir. Bağımsız hücreler, yeniden programlama sürecinin göstergesi olan morfolojik değişiklikler için günlük olarak izlenmelidir. Her deney farklı olacaktır, ancak koloniler genellikle DS indüksiyonundan 16 ila 22 gün sonra, kolonileri izole etme ve tripsin ile yeniden programlanmış kolonileri başlatma işlemine başlamadan bir gün önce izolasyon için yeterince büyüktür.

Kuyucuk başına beş çarpı 10 ila dördüncü hücre yoğunluğunda gama ışınlanmış besleyici bir mets tabakası ile tohumlayarak 24 oyuklu bir plaka hazırlayın. Hücreleri gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Ertesi gün, her bir IPS kolonisini manuel olarak seçin ve hücre agregatlarını ayırmak için tripps, anize edin, IPS hücrelerini fare embriyonik kök hücre ortamında, önceki 24 oyuklu plakanın ayrı oyuklarında repl, hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.

Medyayı her 24 saatte bir değiştirmek. Büyüme ve GFP floresansı için IPS kolonilerini günlük olarak izleyin. Pluripotent analizi için dört kuyucuklu plakaya paketlemeden önce kültürlerimizi altı gün boyunca inkübe ettik.

24 tekerlek plakasının hangi kuyularının düzgün bir şekilde ifade edildiğini belirleyin İyi GFP ekspresyonuna sahip kuyular, tripps olabilir, inize edilebilir ve öncesinde gama ışınlanmış besleyici tabakaları bulunan dört kuyu plakasına bir ila sekiz arasında geçirilebilir. Bu plakalar daha sonra pluripotentlik analizine başlamak için pluripotentlik için ICC analizi için kullanılabilir. Hücreleri magnezyum veya kalsiyum iyonları içermeyen PBS ile iki kez nazikçe yıkayın.

PBS'de 20 arasında% 0.2 buz gibi soğuk kuyu başına 0.5 mililitre ekleyin ve hücreleri 10 dakika inkübe edin. PBS bloğunda üç yıkamadan sonra, oda sıcaklığında bir saat boyunca 200 mikrolitre bloke edici tampon ile spesifik olmayan bağlanma. Şimdi istenen primer antikorun 200 mikrolitresini ekleyin.

Burada SSEA bir nanog ve OCT dört kullandık, hücreleri gece boyunca dört santigrat derecede inkübe ettik. Hücreleri iki kez nazikçe yıkadıktan sonra, 200 mikrolitre ikincil antikor ile oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin ve ışıktan uzak tutun. Burada, görselleştirme için floro kuvveti ile konjuge edilmiş uygun ikincil antikorları kullanıyoruz, iki yıkamadan sonra ters çevrilmiş bir floresan mikroskop kullanıyoruz, DPI ekliyoruz ve hücreleri 10 dakika inkübe ediyoruz.

Şimdi son bir yıkamadan sonra, hücreleri ters çevrilmiş floresan mikroskobu ile görüntülemeden önce antifa aqua mount ekleyin. IPS kolonileri, ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak alkalin fosfataz aktivitesi açısından da analiz edilebilir. Kök gent docs ile indüklenebilir fare TF lentivirüs seti, transkripsiyon faktörlerinin MES ekspresyonunun transdüksiyonundan sonra mes'i IPS hücrelerine yeniden programlamak için kullanılabilir.

Doksisiklin ile tedavi edilen hücrelerde T dört, SOX iki, KLF dört ve seic tespit edilebilir, ancak tedavi edilmeyen hücrelerde çok az ekspresyon tespit edilebilir veya hiç ekspresyon tespit edilemez. Morfolojik değişiklikler, tanımlanmış koloni kenarları ve üç boyutlu büyüme ile daha büyük, daha fazla ES hücresi benzeri koloniler oluşturmak için zamanla ilerleyecektir. Dokümanlar çıkarıldığında, bazı ES hücresi benzeri koloniler için hücresel morfolojide gözle görülür bir geri dönüş olur.

Bununla birlikte, kolonilerin çoğu IPS morfolojisini korudu. Bu IPS kolonileri seçildiğinde ve geçildiğinde görüntülenir. Alkalen fosfatazın tipik pluripotent belirteç ekspresyonu, nano T dört ve SSEA bir.

Bu deneyde kullanılan metamfetamin hücrelerinin tipi, endojen nag lokusundan GFP'yi eksprese etti. Pluripotens durumuna yeniden programlandığında, GFP ifadesi bu nedenle başarılı bir yeniden programlama için bir ön gösterge olarak kullanılabilir. Dört transkripsiyon faktörlü doksisiklin ile indüklenebilir bir antiviral sistem kullanarak pluripotent kök hücreleri indüklemek için fare embriyonik fibroblastlarının yeniden programlanmasını nasıl indükleyeceğinizi gösterdik.

Bu prosedürü yaparken, yeniden programlama deneyleri tasarlarken, yeniden programlamanın verimliliğini optimize etmek için birkaç değişkenin dikkate alınması gerektiğini hatırlamak önemlidir. İlk olarak, transdüksiyon verimliliğini artırmak veya azaltmak için birincil enfeksiyon adımı sırasında aktif virüsün hedef hücre oranını değiştirmek ve böylece hedef hücre popülasyonundaki entegre virüslerin sayısını etkilemek mümkündür. İkincisi, hücrelerin belgelere maruz kalma süresinin ayarlanması, üretilen IPS kolonilerinin sayısını etkileyebilir.

Üçüncüsü, hedef hücrelerin proliferatif kapasitesi, aktif olarak büyüyen ve bölünen hücreler yeniden programlamaya daha uygun olduğu için yeniden programlamayı etkileyebilir. Son olarak, farklı hücre sayıları veya farklı büyüklükteki doku kültürü kapları için protokolü değiştirirken, hedef hücre sayılarının kültür kabının yüzey alanıyla orantılı olarak ayarlanması önerilir. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.