Name: GFP Retroviral Vector kullanarak İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin (iPSCs) içine İnsan somatik hücreleri yeniden programlama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Öğrenin, GFP retroviral vektör kullanarak insan somatik hücrelerini iPSC'lere yeniden programlama yöntemini. Bu teknik, GFP sönümü ile koloni izolasyonu ve plüripotent belirteçlerin doğrulanmasını içerir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser Charles Hood Vakfı Tıp ve Çocuk Sağlığı Araştırma Ödülü, Yale School of tarafından finanse edildi.

1. Yeniden programlanması Faktörler ifade Retrovirus tarafından yeniden programlama <ol><li> İnsan fibroblastlar fibroblast ortamı (10% Pen / Strep ile DMEM içinde FBS) kültürlenmiştir. </li><li> 6-iyi plaka iyi birine enfeksiyonu bir gün önce, plaka 1x10 5 insan fibroblastları. </li><li> Ölü hücreleri çıkarmak ve taze fibroblast orta 2 ml eklemek için orta aspire. 5 ug / ml &#39;lik nihai bir konsantrasyon protamin sülfat ekleyin. </li><li> Dikkatli bir enfeksiyon çokluğu (İçişleri Bakanlığı) 5 5 karşılık gelen her GFP-ifade virüs uygun miktarda ekleyin. </li><li> 2 ml fibroblast orta ekleyin, bir gün sonra enfeksiyon, viral süpernatant kaldırmak 2 ml PBS ile üç kez yıkayın. </li><li> Üç gün enfeksiyondan sonra, GFP flöresanı kontrol etmek ve 2 ml fibroblast ortam ile de takviye. </li><li> Bir üzerine fibroblast ortamda dört gün enfeksiyondan sonra, plaka 1x10 ışınlanmış fare embriyonik fibroblast 4 / cm 2 (MEFS) besleyici hücreler10-santimetrelik bir petri tabağına% 0.1 jelatin ile kaplanır. 37 ° C&#39;da gece boyunca inkübe edilir. </li><li> Beş gün enfeksiyondan sonra, 1 ml% 0.05 typsin / EDTA 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de ve 200 g hızında 5 dakika boyunca santrifüj ile enfekte insan fibroblastlar ayırmak. Ortamı aspire ve fibroblast orta 10ml ile tekrar süspansiyon hücreleri. Bir ön-kaplamalı 10 cm-plakası içine hücreleri transfer edin. </li><li> 24 saat sonra, hESC kültür ortamı (% 20 Knock-Out serum yerine, DMEM/F12, 0.1 ml Esansiyel olmayan amino asitler, 4 ng / ml bFGF, Pen / Strep / Glutamat, beta-merceptoethanol) ile orta yerine. Günlük orta değiştirin. ESC gibi koloniler enfeksiyondan sonra günde 20-27 tarafından görünmeye başlayacaktır. </li></ol> 2. IPSCs izolasyonu ve Genişletme <ol><li> Bir floresan mikroskop altında, hESC benzer bir morfoloji gösteren bir kolonide GFP floresans olmaması için kontrol edin. </li><li> Bir 10 ul pipet kullanarak, bireysel iPSC koloniler almak ve bir jelatin ve MEF-COA iyi birine koyunted 12-iyi plaka ve hESC orta ile desteklenmiş. Günlük orta değiştirin. </li><li> Pasajlanmasını için, DMEM/F12 1 ml yıkama plakası, daha sonra kollajenaz 0.5 mL, 37 ve 10 dakika boyunca kuluçkaya ° C. </li><li> DMEM/F12 ile iki kez yıkanır hücreleri. </li><li> Taze hESC orta 2 ml ekleyin. Bir hücre hırsızı kullanarak, küçük parçalar halinde koloniler parçalamak ve plakadan kalan hücreler ayırmak. </li><li> Jelatin ve MEF kaplı 6-iyi plaka iyi birine kolonilerin süspanse adet aktarın. </li></ol> 3. Pluripotent Markers immünofloresan Analizi <ol><li> PBS ile üç kez yıkanır hücreleri ve oda sıcaklığında 20 dakika için% 4 paraformaldehit ile sabitlemek. </li><li> Yavaşça ile% 0.2 Triton 30 dakika süreyle PBS içinde X-100. PBS ile üç kez hücreleri yıkayıp geçirgenliği </li><li> Iki saat süreyle PBS içinde% 3 BSA ile kuluçkaya hücreleri tarafından spesifik olmayan bağlanma bloke eder. </li><li> 4 &#39;de bir gece primer antikor ile birlikte inkübe hücreleri ° C. </li> &lt;li&gt; PBS ile üç kez yıkanır hücreleri ve ışıktan koruyucu, oda sıcaklığında bir saat boyunca belirli bir sekonder antikor ile hücreleri inkübe edilir. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edildi, son yıkama sırasında PBS ve eklentinin DAPI ile hücreleri, üç kez yıkanır. </li><li> Bir floresan mikroskop ile boyama algılar. </li></ol> 4. Pluripotent Markers için Kantitatif Real-time PCR <ol><li> Qiagen Kullanıcı RNeasy kiti kullanılarak, insan fibroblastlarının türetilmiş insan iPSCs toplam RNA izole edin. </li><li> Üst Simge II Reverse Transcriptase kullanarak ilk iplikli cDNA sentez. </li><li> Daha önce rapor primerler kullanılarak pluripotency genleri tespit etmek qPCR gerçekleştirin. 6 </li></ol> 5.. Temsilcisi Sonuçlar <ol><li> Yeniden programlama sırasında Morfolojik değişim Biz OCT4, SOX2, KLF4 ve MYC taşıyan retrovirüslerin bir kokteyl ile insan fibroblastları BJ1 ve Detroit 551 enfekteve (Şekil 1) yeniden programlama sırasında morfolojik değişiklikler tespit edebildi. Yirmi bir gün enfeksiyondan sonra, onların hESC benzeri morfolojisi ile küçük iPSC koloniler farkındayız. Ayrıca, GFP floresan iPSCs farkındayız. Böyle EKH ve iPSCs olarak pluripotent kök hücreler, proviral gen 7-9 bastırmak için moleküler makineler ifade. Bizim eşsiz retroviral vektörü retroviral LTR genleri yeniden programlama ile birlikte GFP ifade eder. Böylece sürekli GFP salgılayan hücrelerin proviral gen suskunluğu olmadan transgenlerin ifade etmek için kabul edilir. Pluripotency moleküler ağ elde Sadakatle reprogrammed iPSC koloniler GFP (Şekil 2) 10 olmadığını göstermektedir. </li><li> Insan iPSCs ve pluripotency Karakterizasyonu Biz Tra-1-81, Tra-1-60, SSEA-4, SSEA-3, OCT4 ve NANOG antikorlar (imünohistokimya ile Detroit-551 fibroblastlar türetilen koloniler analiz <strong&gt; Tablo 2). Başarıyla yeniden programlanması iPSCs bu belirteçler (Şekil 3A) tüm ifade. Ayrıca, kantitatif RT-PCR analizi ile gen ifadesi analiz edilmiştir. Biz OCT4 ifadesi, SOX2, KLF4, MYC ve NANOG anlamlı ebeveyn fibroblast hücreleri ile karşılaştırıldığında artmış ancak H9 hESC (Şekil 3B) bu ile orantılı olduğu görülmektedir. </li></ol><img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3804/3804fig1.jpg" /> Şekil 1.. Retrovirüs-enfekte insan fibroblastları morfolojik değişiklikler. (AD) yeniden programlama faktörleri ile enfekte Detroit-551 fibroblastlardan koloniler Progressive morfolojik değişim. Gün 5 (A), 10 gün (B), Günlük 14 (C), günde 21 (D). Hücreler 21 gün sonra hESC benzeri morfoloji göstermektedir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3804/3804fig2.jpg" /> Şekil 2. Reprogramming giren hücrelerde Temsilcisi GFP floresan ifade. </strong&gt; BJ ve Detroit 551 fibroblastlar retrovirüs dört yeniden programlama faktörleri 4 ifade ile enfekte ve dört hafta boyunca hESC ortamda inkübe edildi. BJ fibroblast (A, B) ve Detroit 551 (C, D) morfolojik benzer göstermektedir. Günlük 21, GFP negatif koloniler iyi niyetli iPSCs 10 temsil eden oluşturmaya başlar. (E, F) uygun reprogramming uğramamış Detroit 551 hücreler dönüştürdü göstermektedir. Faz kontrast görünümü altında (A, C, E) koloniler. (B, D) düzgün GFP susturulması göstermek hücrelerin yeniden programlanması. Transforme koloni (F) parlak GFP. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3804/3804fig3.jpg" /> Şekil 3. Insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin karakterizasyonu. (A) İnsan 551-iPS-K1 hücre kolonilerinin pluripotent hücreler için ortak işaretleri ifade. DAPI boyama alan başına toplam hücre içeriğini gösterir. Ebeveyn f (B) Kantitatif gerçek OCT4 ifade için zaman-PCR (RT-qPCR), SOX2, KLF4, MYCibroblast, 551-iPS-K1 iPSCs ve H9 insan embriyonik kök hücreleri (hESC). Veri β-aktin housekeeping gen karşı normalize ve ebeveyn fibroblast hücreleri 4 ifadesi seviyesine göre çizildi.

<ol><li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations%3A+lessons+from+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132, 661-680 (2008).</li>
<li>Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J., Vodyanik, M. A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J. L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G. A., Ruotti, V., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
<li>Park, I. H., Lerou, P. H., Zhao, R., Huo, H., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 3, 1180-1186 (2008).</li>
<li>Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li>
<li>Hotta, A., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+vector+silencing+during+iPS+cell+induction%3A+an+epigenetic+beacon+that+signals+distinct+pluripotent+states%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Retroviral vector silencing during iPS cell induction: an epigenetic beacon that signals distinct pluripotent states.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 105, 940-948 (2008).</li>
<li>Matsui, T., Leung, D., Miyashita, H., Maksakova, I. A., Miyachi, H., Kimura, H., Tachibana, M., Lorincz, M. C., Shinkai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proviral+silencing+in+embryonic+stem+cells+requires+the+histone+methyltransferase+ESET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proviral silencing in embryonic stem cells requires the histone methyltransferase ESET.</a> Nature. 464, 927-931 (2010).</li>
<li>Wolf, D., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+use+ZFP809+to+silence+retroviral+DNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells use ZFP809 to silence retroviral DNAs.</a> Nature. 458, 1201-1204 (2009).</li>
<li>Chan, E. M., Ratanasirintrawoot, S., Park, I. H., Manos, P. D., Loh, Y. H., Huo, H., Miller, J. D., Hartung, O., Rho, J., Ince, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+distinguishes+bona+fide+human+iPS+cells+from+partially+reprogrammed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells.</a> Nat. Biotechnol. 27, 1033-1037 (2009).</li>
<li>Yu, J., Hu, K., Smuga-Otto, K., Tian, S., Stewart, R., Slukvin,, Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+free+of+vector+and+transgene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li>
<li>Kim, D., Kim, C. H., Moon, J. I., Chung, Y. G., Chang, M. Y., Han, B. S., Ko, S., Yang, E., Cha, K. Y., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li>
<li>Warren, L., Manos, P. D., Ahfeldt, T., Loh, Y. H., Li, H., Lau, F., Ebina, W., Mandal, P. K., Smith, Z. D., Meissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+with+synthetic+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).</li>
<li>Ban, H., Nishishita, N., Fusaki, N., Tabata, T., Saeki, K., Shikamura, M., Takada, N., Inoue, M., Hasegawa, M., Kawamata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+transgene-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28iPSCs%29+by+temperature-sensitive+Sendai+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14234-14239 (2011).</li>
<li>Wolf, D., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIM28+mediates+primer+binding+site-targeted+silencing+of+murine+leukemia+virus+in+embryonic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TRIM28 mediates primer binding site-targeted silencing of murine leukemia virus in embryonic cells.</a> Cell. 131, 46-57 (2007).</li>
<li>Park, I. H., Arora, N., Huo, H., Maherali, N., Ahfeldt, T., Shimamura, A., Lensch, M. W., Cowan, C., Hochedlinger, K., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134, 877-886 (2008).</li>
<li>Kim, K. Y., Hysolli, E., Park, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+maturation+defect+in+induced+pluripotent+stem+cells+from+patients+with+Rett+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neuronal maturation defect in induced pluripotent stem cells from patients with Rett syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14169-14174 (2011).</li>
</ol>

<p class="jove_content"&gt; Biz ifşa hiçbir şey yok.</p

IPSCs dört transkripsiyon faktörleri reprograms insan fibroblast Anlatım. Pek çok klinik deneme güvenli iPSCs üretmek için non-entegre olan ya da olmayan genetik yaklaşım kullanılarak insan iPSCs üretmek için yapılmıştır. Şimdiye kadar, bu yöntemler son derece düşük verimlilik göstermek ve tekrarlanabilirlik 11-14 geliştirmek için daha fazla optimizasyon gerektirir. Retro-ya lentiviral yöntemlerle kolayca elde ve viral entegrasyon kaynaklanan sorunları emniyet az bağımlı olan vitro hastalığı mode...

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>11330057</td><td>80%</td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacer</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>20%</td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Esansiyel Olmayan Amino Asitler (10 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td>0.1 mM</td></tr><tr><td>&amp;#946;-Merkapt&amp;#8211;etanol (14.3 M) veya MTG</td><td>Invitrogen</td><td>M-6250</td><td>0.1 mM</td></tr><tr><td>bFGF-2 10 &amp;mu;g/ml</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>GF003AF</td><td>4 ng/ml</td></tr><tr><td>Penisilin/Streptomisin</td><td>EMD Millipore</td><td>15140-122</td><td>1%</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965118</td><td>90%</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10407028</td><td>10%</td></tr><tr><td>Penisilin/Streptomisin</td><td>EMD Millipore</td><td>15140-122</td><td>1%</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tablo 1. Kültür Besiyeri&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>OCT4</td><td>Abcam</td><td>Ab19857</td><td>1:500</td></tr><tr><td>SSEA3</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4303</td><td>1:100</td></tr><tr><td>SSEA4</td><td>BD Biosciences</td><td>BD560218</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Tra-1-81</td><td>BD Biosciences</td><td>BD560173</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Tra-1-60</td><td>BD Biosciences</td><td>BD560174</td><td>1:100</td></tr><tr><td>NANOG</td><td>Abcam</td><td>Ab21624</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Alexa-Flur 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Alexa-Flur 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>1:5000</td></tr><tr><td>pMIG-OCT4</td><td>Addgene</td><td>17225</td><td></td></tr><tr><td>pMIG-SOX2</td><td>Addgene</td><td>17226</td><td></td></tr><tr><td>pMIG-KLF4</td><td>Addgene</td><td>17227</td><td></td></tr><tr><td>pMIG-MYC</td><td>Addgene</td><td>18119</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenaz tip IV</td><td>Invitrogen</td><td>17104019</td><td>1mg/ml</td></tr><tr><td>Jelatin, Porcine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G 1890</td><td>0.1%</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td>0.2%</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47608</td><td>4%</td></tr><tr><td>BSA</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01800</td><td>3%</td></tr><tr><td>MEF feeder hücreleri</td><td>EMD Millipore</td><td>PMEF-N</td><td></td></tr><tr><td>Cell Lifter</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskopi: GFP filtreli evirmiş mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tablo 2. Reaktifler ve ekipmanlar&lt;/strong&gt;</td></tr></tbody></table>

gfp retroviral vector kullanarak İsteyerek pluripotent kök hücrelerinin (ipscs) içine İnsan somatik hücreleri yeniden programlama

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC) pluripotent ve in vitro hastalığı modelleme ve rejeneratif tıp 1 de için paha biçilmez bir hücresel kaynaklarıdır. Daha önce insan somatik hücre dört transkripsiyon faktörlerinin ektopik ifade (Oct4, Sox2, Klf4 ve Myc) tarafından pluripotency yeniden yapılandırılabilir ve uyarılan pluripotent kök hücreler (iPSCs) 2-4 olabildiği gösterilmiştir. HESC gibi, insan iPSCs pluripotent ve otolog hücre için potansiyel bir kaynaktır. Burada GFP içeren retroviral omurgası 4 klonlanmış dört yeniden programlama faktörleri ile insan fibroblast hücreleri yeniden programlamayı protokolü tanımlar. Aşağıdaki protokolü kullanarak, insan ESC kültür koşullarında 3-4 hafta içerisinde insan iPSCs oluşturur. İnsan iPSC koloniler yakından morfolojisi hESC benzeyen ve retroviral transgen susturulması bir sonucu olarak GFP flöresanı kaybı gösterir. iPSC koloniler bir floresan microsco altında mekanik olarak izolepe hESC gibi benzer bir şekilde davranırlar. Bu hücreler, biz çok pluripotency genlerin ve yüzey belirteçleri ifadesi algılar.

OCT4 bir retrovirüs-aracılı ektopik ifadesi ile insan kaynaklı hücreler pluripotent kök (iPSCs) üretmek için bir yöntem olup, SOX2, KLF4 ve MYC tarif edilmektedir. GFP dayanarak insan iPSC koloniler tespit etmek pratik bir yolu da tartışılmaktadır.

GFP Retroviral Vector kullanarak İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin (iPSCs) içine İnsan somatik hücreleri yeniden programlama

İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC'ler) pluripotenttir ve in vitro hastalık modelleme ile rejeneratif tıp için paha biçilmez hücresel kaynaklardır1. Şunlara sahiptir...

Bu prosedürün genel amacı, OCT4, SOX2, KLF4 ve MYC'nin retrovirüs aracılı aşırı ekspresyonu ve bir GFP raporlayıcı sistemi kullanılarak insan iPS hücreleri üretmektir. Bu işlem, öncelikle uygun miktarda bireysel GFP eksprese eden retrovirüs eklenerek gerçekleştirilir. Ardından, GFP eksprese eden virüsle enfekte edilmiş hücreler, fare embriyonik fibroblastlarının bulunduğu %0,1 jelatin kaplı plakalara aktarılır.Prosedürün üçüncü adımı, besiyerinin insan embriyonik kök hücre kültür besiyeri ile değiştirilmesidir. Son olarak, insan embriyonik kök hücrelerine benzer bir morfoloji gösteren GFP susturulmuş IPS kolonileri izole edilir. Nihayetinde sonuçlar, immünofloresan boyama ve R-T-Q-P-C-R aracılığıyla endojen pluripotent belirteçlerin ekspresyonunu göstermektedir.Bu tekniğin, pluripotent yüzey belirteçleri ile yaşam boyu boyama ve morfolojik değişimlerin gözlemlenmesi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, istenen iPad'dir. Kültüre başlamak için, pluripotent hücrelerin bir belirteci olarak GFP ekspresyon kaybı kullanılarak hücre kolonileri kolayca izole edilebilir. Enfeksiyondan bir gün önce, fibroblast ortamında bulunan insan fibroblastlarını, altı kuyucuklu bir plakanın bir ku

reprogramming-human-somatic-cells-into-induced-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video indüklenebilir lentivirüs kullanarak bağlı pluripotent kök hücreleri üretmek için prosedürü ifade Oct4, Sox2, c-Myc ve Klf4 gösterir.

Sox-2 Zorla İfade yoluyla MEFS iPS Hücreler oluşturma, Eki 4, c-Myc ve Klf4

Stemgent Dox Đndüklenebilir Fare TF lentivirüs Set bağlı pluripotent kök (IPS) hücreleri fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) yeniden programlamak. Burada fare reprogramming transkripsiyon faktörleri Oct4 DOX indüklenebilir ifade için protokol göstermek, Sox2, Klf4 ve c-Myc ifade ortak MES pluripotency belirteçlerinin iPS koloniler oluşturmak için.

Dört Transkripsiyon Faktör Fare Embriyonik Fibroblastlar yeniden programlanması Bağlı Pluripotent Kök Hücre Üretimi, Doksisiklin lentiviral İletim Sistemi Đndüklenebilir

Biz, insan faktörleri Oct4, Sox2, Nanog ve Lin28 lentivirüs aracılı teslim kullanarak insan somatik hücre alınan uyarılmış pluripotent kök hücreleri üretimi için protokol göstermektedir. Pluripotency morfolojisi ve embriyonik kök (ES) hücre-spesifik belirteçler varlığı teyit edilmiştir.

Stemgent İnsan TF lentivirüs İnsan Fibroblastlar yeniden programlanması Bağlı Pluripotent Kök Hücre Üretimi ayarla

Genetik modifikasyon alanında son gelişmelere rağmen, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) aktarılmasının kaprisli bir süreç olmaya devam etmektedir. Bildiğimiz kadarıyla, insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (iPSCs) transfekte etmek için sistematik ve etkili bir yöntem bildirilmemiştir. Burada, biz verimli transfekte ve insan iPSCs nucleofect sağlam protokoller açıklanmaktadır.

İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücreler transfekte ve Nucleofecting

Biz retroviral Oct3 / 4, Sox2, Klf4 ve c-myc (OSKM) kodlayan vektörler ve canlı boyama ile doğru yeniden programlanması hiPSC belirlenmesi kullanarak insan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC) Tra-içine insan somatik hücre verimli yeniden programlama için bir protokol sunmak 1-81 antikor.

İnsan İsteyerek Pluripotent Kök Hücre seçme ve ayırma Kolonileri Yetişkin Fibroblastlar gelen reprogrammed

Burada, biz tutarlı sonuç ve geliştirilmiş verimlilik gösterir Sendai virüs ile transgen-özgür insan iPSCs içine insan somatik hücreleri yeniden programlamak için kurulan yöntem sunuyoruz.

Sendai-virüs ile İnsan Somatik Verimli Üretimi İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin

Lentiviral temelli, yeniden programlanmış ve karakterize edilmiş, faktörsüz insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin türetilmesi ve varsayılan klinik dereceli koşullara dönüştürülmesi için bir protokol tanımlıyoruz.

Türetilmesi ve Karakterizasyonu bir Transgen ücretsiz İnsan Kaynaklı Pluripotent Tanımlı Klinik dereceli Koşullar içine Hücre Hattı ve Dönüşüm Kök

Güvenli liman AAVS1 lokusunda TALEN aracılı gen düzenleme, insan iPSC'lerinde yüksek verimli transgen ilavesi sağlar. Bu protokol, raportör hatları oluşturmak için bir GFP geninin hedeflenen entegrasyonunu sağlamak için TALEN ve donör vektör iletimi için iPSC'lerin hazırlanması, iPSC'lerin transfekte edilmesi ve iPSC klonlarının seçilmesi ve izole edilmesi prosedürlerini açıklar.

Transfeksiyon, Seçim ve İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin Colony-toplama AAVS1 Safe Harbor içine GFP geninin ile TALEN-hedefli

Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi otolog nakli türetilmesi için ilginç umutları sağlar. Ancak, pluripotent devlet ve zahmetli yeniden farklılaşma yoluyla ilerleme hala klinik çeviri engellemektedir. Burada erişkin insan fibroblast türetme ve uyarılmış nöral progenitör hücrelerin içine doğrudan dönüşüm ve nöral soy içine sonradan farklılaşmayı açıklar.

Yetişkin İnsan Fibroblastları türetilmesi ve Genişletilebilir Sinir Progenitör Hücreler içine Doğrudan Dönüşüm

Uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs), klinik uygulamalar ve temel araştırma için hastaya özgü dokuların bir kaynağı temsil eder. Burada, non-entegre epizomal plasmidleri kullanılarak viral içermeyen iPSCs içine donmuş buffy kat elde edilen insan periferal kan mononükleer hücreleri (PBMNCs) yeniden programlamak için detaylı bir protokol mevcut.

Bütünleşmeyen episomal plasmidler kullanılarak dondurulmuş Buffy tüylerdeki uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Hücre yeniden programlama, pluripotent hücre durumunu düzenleyen ve koruyan anahtar genlerin tanıtılmasını gerektirir. Açıklanan protokol, insan dermal fibroblastlarından viral/entegre yöntemler olmadan ancak modifiye edilmeyen RNA'lar (NM-RNA) kullanarak hücresel savunma mekanizmalarını azaltan immün kaçırma faktörleri ile birlikte indüklenen pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) kolonilerinin oluşmasını sağlar.

Erişkin İnsan Dermal Fibroblastlarının Abdominal Deriden İzolasyon ve İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerin Indüklenen Alacalı Kök Hücrelerin Indükleyici Olmayan Yöntemle Üretilmesi

Öğrenin, GFP retroviral vektör kullanarak insan somatik hücrelerini iPSC'lere yeniden programlama yöntemini. Bu teknik, GFP sönümü ile koloni izolasyonu ve plüripotent belirteçlerin doğrulanmasını içerir.

GFP Retroviral Vector kullanarak İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin (iPSCs) içine İnsan somatik hücreleri yeniden programlama (Video) | JoVE Journal

GFP Retroviral Vector kullanarak İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin (iPSCs) içine İnsan somatik hücreleri yeniden programlama

Daha fazla video keşfet