GFP Retroviral Vector kullanarak İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin (iPSCs) içine İnsan somatik hücreleri yeniden programlama

Bu prosedürün genel amacı, bir GFP raportör sistemi ile OCT dört, SOX 2K LF dört ve M'nin retrovirüs aracılı aşırı ekspresyonu yoluyla insan IPS hücreleri üretmektir. Bu, önce retrovirüsü ifade eden uygun miktarda bireysel GFP eklenerek gerçekleştirilir. Daha sonra, GFP eksprese eden virüs ile enfekte olmuş hücreler, fare embriyonik fibroblastları ile% 0.1 jelatin kaplı plakalara aktarılır.

Prosedürün üçüncü adımı, besiyerini insan embriyonik kök hücre kültürü besiyeri ile değiştirmektir. Son olarak, insan embriyonik kök hücrelerine benzer bir morfoloji gösteren GFP susturuculu IPS kolonileri izole edilir. Sonuç olarak, sonuçlar, immünofloresan boyama ve R-T-Q-P-C-R yoluyla endojen pluripotent belirteçlerin ekspresyonunu göstermektedir.

Pluripotent yüzey markörü ile yaşam tarzı boyama ve morfolojik bir değişikliğin gözlemlenmesi gibi mevcut yöntemin bu tekniğinin en büyük avantajı, arzu edilen iPad'dir. Hücre kolonileri, kültüre başlamak için pluripotent hücreler için bir belirteç olarak GFP ekspresyonu kaybı kullanılarak kolayca izole edilebilir. Enfeksiyondan bir gün önce fibroblast ortamındaki insan fibroblastları, bir kez 10 ila beşinci insan fibroblastlarını altı oyuklu bir plakanın bir oyuğuna yerleştirir, ertesi gün ölü hücreleri çıkarmak için ortamı aspire eder ve mililitre başına beş mikrogram protamin sülfat ile iki mililitre taze fibroblast ortamı ekler.

Daha sonra, beş enfeksiyon çokluğuna karşılık gelen her bir GFP eksprese eden virüsün uygun miktarını dikkatlice ekleyin. Hücreleri enfeksiyondan bir gün sonra gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Viral süpernatan yıkamayı iki mililitre PBS ile üç kez çıkarın.

Daha sonra enfeksiyondan üç gün sonra iki mililitre, fibroblast ortamı ekleyin. GFP floresansını kontrol edin ve kuyuyu iki mililitre ile doldurun. Ertesi gün fibroblast ortamı, %0.1 Jelatin ile kaplanmış 10 santimetrelik bir Petri kabına ışınlanmış fare, embriyonik fibroblast veya metamfetamin besleyici hücrelerinin santimetre karesine 10 ila dördüncü kez plakalanır.

Hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, enfekte olmuş insan fibroblastlarını 37 santigrat derecede beş dakika boyunca bir mililitre% 0.05 tripsin EDTA ile ayırın ve 200 G'de beş dakika santrifüjleyin. 24 saat sonra.

Ortamı HESC kültür ortamıyla değiştirin ve ortamı günlük olarak değiştirin. ESC benzeri koloniler, floresan mikroskobu altında ESC benzeri kolonilerin ortaya çıkmasından sonra enfeksiyondan 20 ila 27 gün sonra ortaya çıkmaya başlayacaktır. HSC'lere benzer morfoloji gösteren bir kolonide GFP floresansının olup olmadığını kontrol edin.

10 mikrolitrelik bir pipet kullanarak. Tek tek IPSC kolonilerini seçin ve bunları jelatin ve metamfetamin kaplı 12 oyuklu bir plakanın bir kuyusuna yerleştirin ve HESC ortamı ile destekleyin. Plakayı bir mililitre DMM F 12 ile yıkayarak hücrelerin günlük geçişini değiştirin.

Daha sonra 0,5 mililitre kollajenaz ekleyin ve 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Hücreleri DM A MF 12 ile iki kez yıkayın. Ardından, iki mililitre taze HESC ortamı ekleyin.

Daha sonra kolonileri küçük parçalara ayırmak ve kalan hücreleri plakadan ayırmak için bir hücre kaldırıcı kullanın. Yeniden süspanse edilmiş koloni parçalarını, bir jelatin ve MEF kaplı altıdan oluşan bir kuyuya aktarın. Kuyu plakası ve iki gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Hücreleri immünofloresan ile kontrol etmek için. PBS ile üç kez yıkayın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 4 paraldehit ile sabitleyin. Hücreleri PBS ile üç kez nazikçe yıkayın ve 30 dakika boyunca PBS'de% 0.2 tritton X 100 ile geçirin.

Hücreleri PBS'de% 3 BSA ile iki saat inkübe ederek spesifik olmayan bağlanmayı bloke edin. Daha sonra, hücreleri gece boyunca dört santigrat derecede birincil antikor ile inkübe edin. Daha sonra hücreleri PBS ile üç kez yıkayın ve karanlıkta oda sıcaklığında bir saat boyunca ikincil antikor ile inkübe edin.

Son yıkama sırasında hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Dappy ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Kantitatif gerçek zamanlı için bir floresan mikroskobu kullanarak hücreleri görüntüleyin.

PCR, insan fibroblastlarından türetilen insan IPC'lerinden toplam RNA'yı izole eder. Bir RNA izolasyon kiti kullanarak. Ters transkriptaz kullanarak ilk iplikli cDNA'yı sentezleyin.

Ardından, pluripotent genleri tespit etmek için QPCR için şablon olarak kullanın. İnsan fibroblastları, OCT dört, SOX iki, KLF dört ve burada gösterilen Mick taşıyan bir retrovirüs kokteyli ile enfekte olmuş BJ, beşinci günden itibaren yeniden programlama sırasında gözlenen morfolojik değişikliklerdir. Bugünkü 10, 14 ve 21 numaralı hücreler, 21 gün sonra HESC benzeri morfoloji göstermeye başlar ve IPC'ler GFP floresansı ile tanınır.

ESC'ler ve IPC'ler gibi pluripotent kök hücreler, proviral gen ekspresyonunu baskılamak için moleküler mekanizmayı eksprese eder. Bununla birlikte, burada kullanılan retroviral vektörler, retroviral LTR ile genlerin yeniden programlanmasıyla birlikte GFP'yi eksprese eder. Bu nedenle, sürekli olarak GFP eksprese eden hücrelerin, burada görüldüğü gibi proviral gen susturma olmadan transgenleri eksprese ettiği düşünülür, aslında, Pluripotents Moleküler Ağını elde eden yeniden programlanmış IPSC kolonileri, GFP ekspresyonunun olmadığını gösterir.

Bu şekil, Detroit 5 51'den türetilen kolonilerin immünohistokimya analizini göstermektedir: TRA 180 1, TRA one 60, SSEA dört, T four ve nano antikorları ile başarılı bir şekilde görülebilir. Yeniden programlanmış IPC'ler tüm bu belirteçleri ifade eder. Ek olarak, gen ekspresyonunu analiz etmek için kantitatif R-T-P-C-R gerçekleştirildi ve T dört, SOX iki, KLF dört, M ve nano'nun ebeveyn fibroblast hücrelerine kıyasla önemli ölçüde arttığını, ancak H dokuz HSC'ninkiyle orantılı olduğunu ortaya koydu.

Bu videoyu izledikten sonra, virüsü nasıl enfekte edeceğinizi, floresan mikroskobu kullanarak tamamen dudak programlanmış IPA hücrelerini nasıl tanımlayacağınızı ve alacağınızı iyi anlamalısınız.