Bir programlayabilme Fare Modeli iPS Hücre araürünler Hücre Yüzey Etiket Aracılı Arıtma

Bu prosedürün genel amacı, fare embriyonik fibroblastlarının yeniden programlanması kültürlerinden nadir yeniden programlama ara ürünlerini izole etmektir. Bu, ilk olarak yeniden programlanabilir bir fare suşunun E 13.5 embriyolarından fare embriyonik fibroblastlarının türetilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, düşük geçişli fare embriyonik fibroblastları, yeniden programlama sürecini başlatmak için doksisiklin ile takviye edilmiş indüklenmiş pluripotent kök veya IPS hücre ortamına ekilir.

Daha sonra, hücreler yeniden programlama sırasında seçilen zaman noktalarında toplanır ve belirli hücre yüzeyi belirteçlerine karşı antikorlarla etiketlenir. Sonuç olarak, nadir yeniden programlama ara ürünleri, daha fazla deneysel analiz için gerçeklerle izole edilebilir. Mevcut yöntemlerin bu tekniğinin temel avantajı, popülasyonun büyük kısmını oluşturan yeniden programlama işlemine dirençli hücrelerin yokluğunda nadir yeniden programlama ara ürünleri üzerinde mekanik çalışmaların yapılabilmesidir Fare embriyonik, fibroblastları veya mes oluşturmak için embriyonik bir gün 13.5 uterus boynuzunu 10 mililitre steril PBS içeren 10 santimetrelik bir doku kültürü kabına transfer ederek başlayın.

Ardından, boynuzu her biri bir embriyo içeren ayrı parçalara ayırmak için sterilize edilmiş cerrahi sınıf makas kullanın. Daha sonra, bir doku kültürü başlığında bir diseksiyon mikroskobu altında, uterus zarfını ve her embriyoyu çevreleyen ekstra embriyonik zarı dikkatlice çıkarmak için sterilize edilmiş forseps kullanın ve her bir soyulmuş embriyoyu 10 mililitre taze PBS içeren 10 santimetrelik ayrı ayrı tabaklara aktarın. Daha sonra her embriyonun başını, uzuvlarını, kuyruğunu ve iç organlarını forseps ile çıkararak devam edin.

Gerektiği gibi genotipleme için kafaları ayrı ayrı 1,5 mililitrelik tüplerde dondurun. Her gövdeyi yeni 10 santimetrelik plakalara aktarın ve her embriyoyu iki dakika boyunca kıymak için iki cerrahi bıçak kullanın. Doku parçalarını 200 mikrolitre tripsin EDTA'da oda sıcaklığında üç ila beş dakika sindirin, ardından iki dakika daha kıyın.

Daha sonra tryin'i iki mililitre metamfetamin ortamı ile etkisiz hale getirin ve hücre bulamacını 1000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Dokuyu nazik pipetleme ile daha mekanik olarak ayırın ve ardından hücre çözeltisini jelatin kaplı 10 santimetrelik bir tabağa aktarın. Kültüre 10 mililitre daha meth ortamı ekleyin.

24 ila 48 saat sonra, MEF'leri yeniden programlamak için plaka yoğun bir şekilde MEF'lerle kaplanmalıdır, önce 37 santigrat derece su banyosunda düşük geçişli donmuş bir metamfetamin kültürünü çözdürün ve ardından içeriği 10 mililitre ön ısıtma metamfetamin ortamı içeren bir tüpe aktarın. Hücreleri döndürdükten sonra, peleti 12 mililitre taze metamfetamin ortamında yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu jelatin kaplı bir T 75 kültür kabına aktarın. 24 ila 48 saatlik bir iyileşme süresinden sonra, MEF'leri PBS ile yıkayın ve ardından hücreleri 37 santigrat derecede üç ila beş dakika boyunca üç mililitre tripsin EDTA ile ayırın.

Daha sonra enzimatik sindirimi beş mililitre metamfetamin ortamı ile durdurun ve 10 mililitrelik bir pipetle nazikçe karıştırarak hücreleri daha da ayırın. Daha sonra, hücreleri yeni jelatin üzerine ekleyerek, ilk altı gün boyunca mililitre doksisiklin başına iki mikrogram içeren 12 mililitre IPSC ortamında santimetre kare başına 10 ila üçüncü hücrelere 6.7 kez kaplanmış T 75 şişelerine yerleştirerek metleri yeniden programlayın. Ortamı her gün taze doksisiklin takviyeli IPSE ortamı ile değiştirin, yeniden programlama ara ürünlerini, hasat edilen her bir ara süspansiyon için gösterildiği gibi tripsin EDTA dekolmanı ile gerekli zaman noktalarında hasat edin.

Hücreleri PBS'de yıkayın. Sonra diriltmek. Tamamen yeniden programlanmış IPSC kültürleri oluşturmak için antikor etiketlemesi için peletleri faks ortamında askıya alın.

Yeniden programlanmış hücreleri etiketlemek için hücreleri doksisiklin içermeyen IPSC ortamında dört ila yedi gün daha büyütün. Hasat edilen ara ürünleri uygun ilgilenilen antikorlarla etiketleyin. 10 dakika sonra, hücreleri yeniden askıya almak için tüplere hafifçe vurun ve ardından tüpleri 10 dakika daha buzun üzerine yerleştirin.

İkinci inkübasyondan sonra, hücreleri tüp başına 10 mililitre soğuk PBS'de yıkayın. Daha sonra süpernatanı dikkatlice aspire edin ve peletleri, buz üzerinde yedi numara strippin P ile desteklenmiş uygun bir hacimde etiketleme ortamında yeniden süspanse edin. 20 dakika sonra, hücreleri 10 tane daha soğuk PBS'de yıkayın ve hücre peletlerini propidyum iyodür ile desteklenmiş etiketleme ortamında yeniden süspanse edin.

Süspansiyonu 70 mikrometrelik bir süzgeçten geçirerek hücre kümelerini filtreleyin ve ardından hücreleri buz üzerindeki uygun karşılık gelen faks tüplerine aktarın. Kompanzasyon kontrolleri için. Resus, 800 mikrolitre etiketleme tamponunda ışınlanmış mes üzerinde tutulan IPS hücrelerinin bir kriyo şişesini askıya alır.

Etiketlenmemiş kontrol kontrolü için 200 mikrolitre hücre ayırmak. Daha sonra kalan hücre süspansiyonunu tek renk kontrolleri için üç adet 15 mililitrelik tüp arasında bölün ve ara ürünleri akış sitometrisi ile analiz etmek için numuneleri gösterildiği gibi etiketleyin. Enkazı dışlamak için ileri yan saçılma grafiğinde bir kapı ayarlayarak başlayın.

Ardından, toplamaları dışlamak için ileri saçılma alanına karşı ileri saçılma yüksekliğini ve ileri saçılmaya karşı PI kanalını kullanın. PI negatif canlı hücrelerin kapısını açmak için. Pasifik mavisi FITC ve PSI yedi kanalının voltajlarını ayarlamak için etiketlenmemiş hücreleri kullanın.

Hücre popülasyonunu ideal olarak ilgili kanalın alt ucunda konumlandırmak. Daha sonra, yeniden programlama kültürlerini üçüncü, altıncı ve dokuzuncu günlere bölmek için etiketlenmemiş kontrol hücrelerinin bulunduğu kapıları ayarlayın. SSEA popülasyonları: bir negatif TH 1.2 pozitif hücre, SSEA bir negatif TH 1.2 negatif hücre ve yeniden programlama ara ürünleri SSEA bir pozitif TH 1.2 negatif hücre.

Ardından, dokuzuncu gün SSEA'yi bir pozitif TH 1.2 negatif kesrini SSEA birine karşı EPAM grafiği ile daha da alt bölümlere ayırın. Etiketlenmemiş kontrolü kullanarak, burada gösterildiği gibi EPAM pozitif hücrelerin ve EPAM negatif hücrelerin etrafına kapılar çizin. Son olarak, hücreleri bir ila iki mililitre IPS hücre ortamında toplayın.

Doksisiklin indüksiyonu üzerine, yeniden programlama mitleri altıncı gün civarında belirgin morfolojik değişikliklere uğrar. Erken koloni benzeri yamalar ortaya çıkmaya başlar ve bu yamalar daha fazla kültürle birlikte büyümeye devam eder. İyi bir yeniden programlama deneyi, başlangıçta beş çarpı 10 ila beşinci hücre ile tohumlanan T 75 başına 500'den fazla koloni ile sonuçlanacak ve kurulan IPS kültürleri, karakteristik kubbe şeklinde kolonilere sahip olacak ve çoğunlukla farklılaşmış hücrelerden yoksun olacaktır.

Yeniden programlama sırasındaki morfolojik ve moleküler değişiklikler, uyluk 1.2 SSEA bir ve nihayetinde epca'nın hücre yüzeyi ekspresyonundaki değişikliklere yansır. MES ağırlıklı olarak uyluk 1.2 için pozitif ve diğer belirteçler için negatif olsa da, üçüncü günde, hücrelerin büyük bir kısmı uyluk 1.2'nin ekspresyonunu aşağı düzenlemeye başladı ve çok küçük bir alt küme SSEA bir pozitif hale geldi. Altıncı ve dokuzuncu günlerde bu zaman noktası için gerçek yeniden programlama ara maddesi, SSEA bir pozitif hücrelerin artan yüzdesi, genellikle% 10'un oldukça üzerinde, yaklaşık 12. günde tespit edilebilir.

SSEA bir pozitif hücrenin bir alt kümesi de pozitif olan tespit edilebilir. epca için. Yerleşik iyi niyetli IPS hücre kültürleri güçlü bir şekilde pozitif olacaktır.

SSEA one ve EPCA için Bu prosedürü denerken, yalnızca önceden uygun şekilde genotiplendirilmiş düşük geçişli haritaları kullanmayı unutmamak önemlidir.