Name: Lipidik Mesophases kullanarak Yapı Tayini için Membran Proteinleri Kristalize (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-21T17:00:00.000+00:00
Duration: 22 min
Description: Öğrenin, lipidik mezofazlar kullanarak membran proteinlerini kristalize etme yöntemini. Bu protokol, yapısal biyoloji ve ilaç tasarımı için yüksek kaliteli kristaller üretmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmaya katkıda bulunan pek çok ve en Yapısal ve Fonksiyonel Biyoloji Grubu Caffrey Membran, geçmişteki ve şimdiki üyeleri hem. Tüm bizim en içten teşekkürlerimizi ve takdir uzanır. Bu çalışma Bilim Vakfı İrlanda (07/IN.1/B1836), Sağlık (GM75915) Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Limerick Üniversitesi hibe kısmen desteklenmiştir.

Yapısal ve işlevsel biyoloji alanında önemli bir odak, biyolojik membran (Şekil 1). Hücre ve alt hücresel organelleri çevreleyen zar, sadece iki lipit molekülleri arasında moleküler ince bir yapıya ve protein ile çivili. Lipid ve proteinlerin yapısı ve fonksiyonu ilgi çekicidir. Ancak, bu makalenin odak zarı proteinleri ile sınırlıdır. Membran proteinlerinin moleküler düzeyde nasıl işlediğini daha iyi bir anlayış, iki nedenden dolayı aranır. Öncelikle, bunların nasıl çalıştığını bilmek, entelektüel tatmin vardır. İkincisi, bir proteinin nasıl çalıştığını bilerek, özel uygulamalar için onu değiştirmeye bile arıza olması gerektiği veya iyileştirilmesi veya düzeltmek mümkün olma ihtimali her zaman vardır. İlaç tasarımı, iş bu tip bariz bir sonucudur. Bir yaklaşım, bir membran proteini moleküler düzeyde nasıl çalıştığını endam yapısını belirlemek için. Bu protein oluşturan bütün atomların 3-boyutlu uzayda yer, ya da en azından olmayan tüm hidrojen atomları, kuran içerir. Bu amaç için kullanılan yöntem makromoleküler X-ışını kristalografisi (MX). Şekil 2 yapısı tam kullanarak belirlenen bir membran proteini bir örnek gösterir. Protein bir kırınım kaliteli kristal MX yapmak gereklidir. Açıkçası, makromoleküler kristalografisi kullanarak yapı belirlenmesi dahil pek çok adım vardır. Bu Şekil 3'te gösterilmiştir. Tipik olarak, bu bir membran proteini hedef belirleme ve daha sonra, üreten, arındırıcı ve kristalize. Bir ev veya bir sinkrotron X-ray kaynağını kullanarak kristal Kırınım ölçümleri yapılmaktadır. Kırınım verileri sonra moleküler bir modeli ile donatılmış bir elektron yoğunluk haritası verimli işlenir. Bu model, rafine edilmiş, proteinin etki mekanizması keşfetmek için kullanılan ve yapı-bazlı ilaç tasarımı için olabilir Bu makalenin odak noktası, mezo yöntem denilen zarı proteinleri lipidik mesophases kullanarak kırınımı kaliteli kristal üretmeye nasıl göstermektir. Referans 1 (Caffrey 2009) yeni bir değerlendirme yöntemi ve kapsamı kullanılabilir. Referans 2 (Caffrey ve Cherezov, 2009) biz burada takip edecek adım-adım protokolü açıklanmıştır. Bir mezo membran protein kristalizasyon deneme kurmak için gerekli olan ve zaman alan adımları özetleyen bir akış şeması Şekil 4'te gösterilmiştir . Bu makale, kesik kırmızı çizgiler ile kapalı bu adımları kapsar. Bölüm 1: Kristalizasyon Tabaklar hazırlanması <ol><li> Çalışma tezgahı üzerinde Silanlanmış mikroskop lamı yerleştirin. </li><li> Delikli çift sopa ayırıcı bant şerit (piyasada Belirli Reaktifler ve aşağıda Ekipman Tablo) bir yüzey koruyucu kağıt kapağını çıkarın. </li><li> Slayt yüzeyi ile temas halinde, bant, yapışkan tarafı aşağı yerleştirin. </li><li> Basınç mühür brayer veya rulo kullanarak slayt bant. Alüminyum folyo bant ve kuyuların tabanını korumak için silindir arasına yerleştirilir. </li><li> , Üst yapışkan yüzey için bant ikinci kağıt kapağını çıkarın. </li><li> En kısa sürede yükleme gibi hızlı ve etkin bir sızdırmazlık için kuyu plaka yakın yerleştirin bireysel Silanlanmış lamelleri tamamlandı. </li></ol> Bölüm 2: hazırlanması Lipid Şırınga <ol><li> , 45 ° C, 3 dakika boyunca erimiş hale sıcaklık kontrollü bir blok lipid (genellikle monoolein) yerleştirin. </li><li> Lipid erime olsa da, lipid-protein karıştırma adım kullanım için iki adet 100 mcL gaz sızdırmaz Hamilton şırınga hazırlar. Teflon halkalı protein solüsyonu içeren şırınga çıkarın. (Yerine halkalı bırakarak) yanında lipid yapacak şırınga yerleştirin. </li><li> Coupler lipid şırınga (bkz: Belirli Reaktifler ve Ekipman aşağıda ve Referans 3 (Cheng ve ark Tablo, 1998)) bağlayın . Şırıngaya coupler parmağınızla sıkıştırın ama aşırı sıkmayın. Namlu lipid şırınga pistonu çıkarın. </li><li> Lipid devam etmeden önce erimiş olması gerektiğini unutmayın. 30 mcL pipet ve yavaş yavaş erimiş lipid yaklaşık 30 mcL kadar sürebilir. Yavaş yavaş hava boşlukları tanıtmak için özen şırınga gibi açık ucunu erimiş lipid kadar teslim. </li><li> Erimiş lipid ile temas pistonu namlu içine yerleştirin ve yavaş yavaş şırınga ile dikey olarak video gösterilmiştir düzenlenen varil kadar piston önceden. Yanlışlıkla kıstırılmış olabilir hava kabarcıkları süreç içinde yükselişi ve mahkemece serbest bırakıldı. </li><li> Dikkatlice okuyarak şırınga varil üzerinde işaretler şırınga lipid hacmi belirlemek. </li><li> Slayt demirliKuplörün uzanan iğne üzerine Áizelgesine. Varil kadar yavaş ve nazikçe Kuplörün çekirdek iğne içine erimiş lipid zorlamak için piston kullanın. </li></ol> Bölüm 3: Protein Şırınga hazırlanması <ol><li> , 4, 5 ila 10 dakika boyunca 14.000 g protein çözümü eğrilecektir ° C kristalizasyon çalışmalarda kurmadan önce büyük agrega kaldırmak için. Buz protein çözüm çıkarın ve oda sıcaklığına gelmesini sağlayınız. </li><li> Kübik fazda ya da tam hidrasyon yakın kullanmak için protein solüsyonu hacmi hesaplayın. Monoolein 20 ° C, su dolu hidrasyon faz diyagramı 5 (Şekil 5) olarak% 40'ının su (kütle) oluşur. </li><li> 25 veya 50 mcL Hamilton şırınga ile protein çözüm gerekli olan hacim kadar sürebilir. Teflon piston hava kabarcıklarını önlemek için özen protein şırınga namlu ucuna çözüm aktarın. </li><li> Dikkatlice, iğne çekilme ve şırınga protein çözüm hacmini ölçmek. Önceki adımda teslim değeri ile eşleşmesi gerekir. </li><li> Yavaş yavaş, açık ucu ile aynı hizada sonuna kadar varil kadar protein çözüm inç. </li><li> Lipid şırıngaya bağlı kuplör açık ucunu protein şırınga vidalayın. Bu cihaz çok fazla sıkmayın bu kritik önem taşımaktadır. Over-bu aşamada monte karıştırma cihazı sıkma ferülü zarar ve sızıntı neden olacak. Under-sıkma da sızıntı için yol açacaktır. </li></ol> Bölüm 4: Karıştırma Protein Çözüm ve Lipid: Mesophase <ol><li> Karıştırma etkisi coupler üzerinden ve lipid şırıngaya, protein şırınga protein çözüm sürüş başparmak ve işaret parmağı ile, protein tarafında monte karıştırma ünitesi sınırına piston önceden. </li><li> Lipid tarafında piston Kuplörün ve protein şırıngaya geri lipid şırınga içeriğini sürücü kullanılır. </li><li> Işlem birçok kez tekrarlanır; bazen, bir yüz geçişleri ya da daha homojen bir mesophase üretmek için gerekli. Karıştırma, Kuplörün malzeme üzerinden ileri ve geri hareketi zaman zaman düzensiz olması ve başında, ekstra güç karıştırma etkisi ihtiyaç vardır. İlk karıştırma genellikle örnek tekdüze olmayan bir bulanıklık gelişimi eşlik eder. Homojenizasyon ilerledikçe yükselen kübik mesophase görünümünü olduğu gibi, doku, daha düzgün ve viskoz kübik fazda karakteristik hale gelir. </li><li> Eğer koşullar uygun ve kübik aşamasını oluşturan, dispersiyon optik şeffaf şırınga varil görünmelidir. Böylece, şırınga varil üzerinde işaretler namlu mesophase ile okunaklı olmalıdır. </li><li> Karıştırma sırasında numune, kısa bir süre için buz üzerinde şırınga mikseri koyarak soğutma homojenizasyon Çok hafif ve şeffaflık başarı hızlandırabilir. Ancak, örnek overcool için önemlidir. </li><li> Bu örnek sıcaklığı, sürtünme ile ısınma 3 nedeniyle yükselmeye neden olabilir Bakım, karıştırma son derece dinç önlemek için önlem alınmalıdır . </li></ol> Bölüm 5: Dispenser Yükleniyor <ol><li> 10 mcL Hamilton şırınga, iğne ve şırınga çıkarın. Teflon halkalı bir yerde bırakın. </li><li> Küçük bir madeni para yardımı ile dağıtıcı tespit somunu çıkarın. </li><li> Cırcır kolu tamamen çekilmiş, şırınga takın, piston ve iğne olmadan dağıtıcı holding halka yoluyla. </li><li> Istinat somun, conta yan bakan şırınga değiştirin ve şırınga açık ucunu sıkıca vidalayın. Bakım şırınga düzgün tutan halka ve namlu cırcır kolu paralel hizalanmış merkezli sağlamak için alınmalıdır. Her iki göz tarafından değerlendirilecek. Bu iki gereksinimleri kaçağı önlemek için kritik öneme sahiptir. </li><li> Tutucu somun, bir kaç döner vida ile sürükleyici bir halka ile piston Pass ve açık ucunu şırınga pistonu kılavuzu. Cırcır kolu tamamen basınız. Namlu içine pistonu hareket ettirin ve namlu özgürce ve doğru yolculuk olduğunu kontrol edin. Serbestçe hareket piston kolaylaştırmak için klavuz vidayı gevşetmek için yardımcı olabilir. Emin olun. Pistonu, teflon ucu varil sıfır mcL mezuniyet işareti ile hizalar kadar basınız. Klavuz vida gevşetti olsaydı, sıkın ve piston serbestçe hareket ettiğini gözden geçirmenizde yarar. </li><li> Diğer şırınga ve Kuplörün mesophase aktarmak için sıfır mcL mezuniyet işareti monte karıştırma ünitesinde bir tarafta pistonu hareket ettirin. </li><li> Karıştırma ünitesi boş bir şırınga (onun yerine halkalı) çıkarın ve hemen yüklenen şırınga bağlamak bir couplerttached - 10 mcL dağıtım şırınga dişli feshine. Kaplin yapıldığı gerginlik derecesi Daha önce de belirtildiği gibi, kritik öneme sahiptir. </li><li> Böylece 100 mcL şırınga Medyumu dağıtım şırınga Yük Kuplörün ile mesophase aktarır. </li><li> Dağıtım şırınga çelik sona ermesinden kısa, düz uçlu bir iğne Güvenli ve dikkatle yerine sıkın. </li><li> Kelepçe sürükleyici halka somunu sıkarak cırcır kolu piston. Bakım kullanılmaz hale getirmekteydi piston puan ve deforme olarak, fındık üzerinden sıkmak için değil alınmalıdır. Kenetli durumda cırcır kolu sağlanan videoda gösterildiği gibi bir inç daha fazla hareket alanı ile sınırlı olması önemlidir. Bunun ötesinde, piston, toka ve teslimi başarısız olabilir bir eğilim var. </li><li> Böylece, iğne boşluğu hacmi doldurma ve namlu, iğne yükleme piston ilerlemek için cırcır davul birkaç kez basınız. Bu adım mesophase sürekli bir dize iğne ucundan çıkıncaya kadar (on kata kadar) tekrar edilmelidir. </li><li> Kristalizasyon çalışmalarda bazı proteinler olmadan kübik eklendi Yağışlı aşamasında kararsız olduğu gibi, hemen başlamalıdır. </li></ol> Bölüm 6: Kristalizasyon Tabaklar ayarlama <ol><li> Bir yüzey üzerine çok iyi kristalizasyon plakası ve kapak yükleme kolaylığı için çalışma tezgahı üzerinde birkaç santim kaldırdı yerleştirin. Yüzey biraz daha karanlık, en iyi kontrast ve geliştirilmiş görünürlük elde edilir. </li><li> Yağışlı çözümler homojenize ve şişeleri şapkasını çıkarmak. 1 mcL Yağışlı dağıtım pipetlemeyin ayarlayın. </li><li> Bir yandan dikey düzenlenen dağıtım şırınga ile, merkezi ve doğrudan kuyusu sayısı 1 baz üzerinde iğne ucu pozisyon için ücretsiz bir elinizi kullanın. Cam yüzeye mesophase bolus sınırdışı yinelenen dağıtıcı düğmesine basın. Bolus hacmi standart yinelenen dağıtıcı 10 mcL şırınga ile kullanıldığında 200 nL. Iğne ucu uygun teslim edilmesini sağlamak için kuyu tabanı üzerinde birkaç yüz mikrometre daha fazla olmalıdır. </li><li> 4 komşu kuyuların mesophase, yeri, 2-mcL pipetlemeyin ve standart tek kullanımlık uçları kullanarak her mesophase bolus üst Yağışlı çözüm 1 mcL yüklendikten sonra. </li><li> Mümkün olduğunca çabuk, düzenli bir şekilde karşılamak için dolu kuyular üzerinde kare lamel yerleştirin. Su geçirmez bir mühür etkisi, ayırıcı bant maruz kalan yapışkan yüzeyi ile temas edinceye lamel baskı uygulamak için bir spatula kullanın. </li><li> Mesophase ve yağışlı dağıtım süreci plaka tüm kuyuları yüklenir ve mühürlü kadar tekrar edilebilir. </li><li> Izleme amacıyla açıkça plaka etiketleyin. Işığa duyarlı protein genellikle kuluçka odasında koymadan önce alüminyum folyo tabak sarma tarafından işlenir. </li><li> 20, genellikle, sıcaklık kontrollü bir odasında tabak koyun ° C </li><li> Polarize Işık Mikroskobu kullanılarak kristal büyüme hedefi ile 20 kat 10 veya kuyulardan düzenli olarak kontrol edin. Yazarın laboratuarda kullanılan takvimi aşağıdaki gibi: gün 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30 ve 60 kurulum sonrası. 0.14 mm kalınlığındaki numune içinde odak derinliği ayarlayarak mesophase bolus dikkatlice inceleyin. Sınav, normal ışık ve çapraz-polarize arasında yapılmalıdır. </li></ol> Bölüm 7: Temsilci Sonuçlar Kristallerin görünüm membran proteini doğal rengi değişecektir, ışığın polarizasyon denetim (veya bunların yokluğu) ve aydınlatma yöntem ve kalite için kullanılır. Şekil 6, birkaç olası kristal görünümleri gösterir. Şekil 6 (b) ve (d Paneller) 'de gösterildiği gibi, normal ışık ile bakıldığında mezo büyüyen Doğal renkli membran proteinlerinin bakabilirsiniz. Renksiz membran protein kristalleri küp faz normal ışık ile bakıldığında büyüyen Şekil 6 (Panel e) 'de gösterildiği gibi bakabilirsiniz. Son olarak, polarize ışık ile bakıldığında mezo büyüyen renksiz membran protein kristalleri Şekil 6 (a ve c Paneller) gibi görünebilir. Genel yapısının belirlenmesi sürecinde sonraki adımları hasat ve cryo-cool kristallerinin X-ışını kırınımı ve onlardan kaydetme ve analiz etme. Bu konular ayrı vallahi makaleler ele alınacak. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 ve çift katlı lipid gösteren bir biyolojik membran şematik proteinlerin çeşitli bulunmaktadır. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 yapısıvitamin B 12 taşıma protein, BtuB MX ve bu vallahi makalede resimli mezo yöntemi 6 büyüdü kristalleri kullanılarak çözülmüştür. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 yapı-işlev döngüsü hakkında tam bir protein yapısal bilgiler kullanılarak elde edilmesi ve ilgili adımları birçok göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 akış şeması mezo yöntemi membran protein kristallerinin üretiminde yer alan adımları özetlemektedir. Kesikli kırmızı çizgi ile çevrili bu adımları, bu jove makalede kaplıdır. Referans 2. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5 lipid (monoolein) / su sistemi için basitleştirilmiş bir sıcaklık-bileşim faz diyagramı. Kristalizasyon çalışmalarda 20 ° C lipid,% 40 hidrasyon su ile doyurur. Referans 5 ayrıntılı faz diyagramı kullanılabilir. <img src="/files/ftp_upload/1712/1712fig6.jpg" alt="Şekil 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 6"> Şekil 6 lipidik mesophase büyüyen membran proteinlerinin Kristaller. (A), vitamin B 12 taşıma protein, BtuB 6, (b) Pseudomonas ışık hasat, II 7 karmaşık (c) adhesin / invasin OPCA 8, (d) bacteriorhodopsin 9, (e) karbonhidrat taşıyıcı. Görüntüler normal ışık (b, d, e) ve (a, c) arasındaki çapraz polarize kaydetti.

<ol><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+for+structure+determination.+Use+of+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins for structure determination. Use of lipidic mesophases.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).</li>
<li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallising+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Crystallising membrane proteins in lipidic mesophases.</a> Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).</li>
<li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lipids%22%5BJournal%5D)">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast%2C+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li>
<li>Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phase+diagram+of+the+monoolein%2Fwater+system%3A+metastability+and+equilibrium+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects.</a> Biomaterials. 21, 223-234 (2000).</li>
<li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+meso+structure+of+the+cobalamin+transporter%2C+BtuB%2C+at+1.95+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In meso structure of the cobalamin transporter, BtuB, at 1.95 A resolution.</a> J. Mol. Biol. 364, 716-734 (2006).</li>
<li>Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M. Z., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room+to+move%3A+crystallizing+membrane+proteins+in+swollen+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases.</a> J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).</li>
<li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+meso+crystal+structure+and+docking+simulations+suggest+an+alternative+proteoglycan+binding+site+in+the+OpcA+outer+membrane+adhesin%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">In meso crystal structure and docking simulations suggest an alternative proteoglycan binding site in the OpcA outer membrane adhesin.</a> Proteins. 71, 24-34 (2008).</li>
<li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 1795-1807 (2004).</li>
</ol>

Kübik faz hassas ve dinamik bir ortamda bir dizi değişkenin değişmesi ile birlikte önemli ölçüde değiştirebilir. Mezo kristalizasyon çalışmalarda tüm potansiyel tuzaklar açıklayan manuel modda kurulum bir tanımını vermek mümkün değildir. Ancak, pek çok zorlukla pahalı protein çözümlere başvurmadan önce tekniği uygulayarak ve ılımlılık, karıştırma sırasında şırınga uygulanan basınç kullanarak önlenebilir. Doğru yapıldığında, mezo yöntemi proteinlerin geniş bir yelpazede kristalleri verebilmesidir sayısı sürekli artmaktadır. Mezo kristalizasyon çalışmalarda kurulumu Burada verilen açıklama, manuel mod üzerinde odaklanmıştır . Bir süreç olabilir, ve genellikle, kristalizasyon koşullarını geniş çaplı tarama gerektiren durumlarda kristalleşme plakaları otomatik kurulum kolaylaştırmak için değiştirilmiş.

* Tam işleme kendi Dar Delik çoğaltıcı detayları Referans 3 sağlanmaktadır.

lipidik mesophases kullanarak yapı tayini için membran proteinleri kristalize

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

Lipidik mesophases kullanarak zarı proteinleri kristalize için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır. Bu yöntem çeşitli lipidik kübik faz olarak veya mezo yöntem anılır olmuştur. Yöntemi prokaryotik ve ökaryotik proteinlerin X-ışını kristal yapıları, monomerik, homo ve hetero-multimer kromofor içeren ve kromofor proteinlerin çözmek için kullanılan edildiğini oldukça çok yönlü ve alfa oldu sarmal ve beta-barrel proteinler. Mezo kristalizasyon kullanarak son başarıları insan mühendisliği beta2-adrenerjik ve adenozin A2A G-protein reseptörler. Protokoller monoolein tabanlı mesophase içine membran proteini yeniden ve manuel modda crystallizations kurmak için sunulmaktadır. Genel süreci, kristal hasat gibi ek adımlar, gelecek video makalelerde ele alınacak. Protein yüklü mesophase hazırlamak ve bir kristalizasyon plaka kurmak için gerekli süre yaklaşık bir saat manuel.

Burada lipidik mesophases membran proteinlerinin kristalizasyon denemeleri elle kurmak için Caffrey Membran Yapısal ve Fonksiyonel Biyoloji Grubu uygulanan prosedür açıklanmıştır.

Lipidik Mesophases kullanarak Yapı Tayini için Membran Proteinleri Kristalize

Lipidik mezofazlar kullanılarak membran proteinlerinin kristalleştirilmesine yönelik ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır. Bu yöntem, çeşitli şekillerde ... olarak adlandırılmıştır.

Merhaba, Membran Yapısal ve Fonksiyonel Biyoloji Grubu'na hoş geldiniz. Benim adım Martin Caffery. Araştırmamızın odak noktası, şeması ilk slaytta gösterilen biyolojik membrandır; hücreyi ve varsa hücre altı organelleri çevreleyen membran, yalnızca iki lipid molekülü kalınlığında olan ve proteinlerle bezenmiş moleküler düzeyde ince bir yapıdır.Hem lipidler hem de proteinler için uygulanan yapı ve fonksiyonlarla ilgileniyoruz. Ancak, bu JO serisinin amaçları doğrultusunda, odağımı membran proteinleri ile sınırlandıracağım. Bu membran proteinlerinin moleküler düzeyde nasıl çalıştığını iki nedenden dolayı anlamaya çalışıyoruz.Birincisi, bir şeyin nasıl çalıştığını bilmenin verdiği entelektüel tatmin vardır. İkincisi, tıpkı bisikletiniz veya arabanızda olduğu gibi, nasıl çalıştığını bilmek, arızalandığında onu onarma olasılığını beraberinde getirir. İlaç tasarımı, bu tür çalışmaların açık bir sonucudur.Bir membran proteininin moleküler düzeyde nasıl çalıştığını anlamak için izlediğimiz yaklaşım, proteinin kristalografik yapısını belirlemektir. Bu işlem, proteini oluşturan tüm atomların veya en azından hidrojen dışındaki tüm atomların üç boyutlu uzaydaki konumlarının saptanmasını içerir. Bu amaçla kullandığımız yönteme makromoleküler X-ışını kristalografisi veya kısaca MX denir.Burada, yapısı MX kullanılarak belirlenmiş bir membran proteini örneği görüyoruz; MX yapabilmek için proteinin fraksiyon kalitesinde bir kristali gereklidir. Tahmin edebileceğiniz gibi, burada gösterildiği üzere makromoleküler kristalografi kullanılarak yapı belirlemede birçok adım yer almaktadır. Bunlar tipik olarak, bir membran proteini hedefinin belirlenmesini ve ardından bu proteinin üretilmesini, saflaştırılmasını ve kristalleştirilmesini içerir.Difraksiyon ölçümleri, kristal üzerinde ev tipi veya senkrotron bir x-ışını kaynağı kullanılarak gerçekleştirilir. Difraksiyon verileri işlenerek bir elektron yoğunluk haritası elde edilir ve ardından bu haritaya bir moleküler model uydurulur. Rafine edilen model, proteinin etki mekanizmasının araştırılmasında ve yapı tabanlı ilaç tasarımında kullanılabilir.Bu JoVE makalesinin amacı, lipid mezo fazlar kullanılarak sözde "in meso" yöntemi ile membran proteinlerinin nasıl yüksek kaliteli kristallerini ürettiğimizi göstermektir. Yönteme ve kapsamına ilişkin güncel bir derleme referans birde mevcuttur. Burada takip edeceğimiz adım adım protokol referans ikide açıklanmıştır; bir in meso membran proteini kristalleştirme denemesinin kurulması için gereken adımları ve süreyi özetleyen akış şeması ise burada gösterilmektedir.Bu video, kırmızı kesikli çizgilerle çevrelenmiş olan adımları kapsamaktadır. Manuel modda mezo kristalizasyon yapmak için ihtiyacınız olacak ögeler burada gösterilmiştir. Bunlar arasında, konak mezyi oluşturmak için saflaştırılmış membran proteini lipidinin konsantre bir çözeltisi bulunur; lipidi daha belirgin hale getirmek için genellikle mono ole kullanılır.Bu videoda; kırmızı boya çöktürücü çözeltiler, saflaştırılmış su boru petting cihazları ve tek kullanımlık uçlar, bazıları çıkarılabilir iğneli olan çeşitli sızdırmaz Hamilton şırıngaları, protein çözeltisini lipid ile karıştırarak mease üretmek için kullanılan dar lümenli bir kuplör, Hamilton marka tekrarlayıcı dispenser, cam mikroskop lamları ve lamel cover slip'ler, kuyu oluşturmak için ideal olarak silanize edilmiş delikli çift taraflı yapışkan ara bant, cımbız, kırık buz, dokular, bir hesap makinesi ve hepsinden önemlisi laboratuvar defteriniz kullanılmıştır.Aşağıdaki prosedür, cam sandviç kristalizasyon plakası hazırlamak için kullanılır. Yükleme için, silanlanmış bir mikroskop lamını tezgaha yerleştirin. Delikli çift taraflı ara bant şeridinin bir yüzeyindeki koruyucu kağıt kapağı çıkarın.Bandın yapışkan yüzeyi lam yüzeyine gelecek şekilde yerleştirin ve üzerine baskı uygulayın. Bandı lama sabitleyin. Kuyucukların tabanını korumak için bant ile rulo arasına alüminyum folyo yerleştirilerek bir brayer veya rulo kullanılabilir.Üstteki yapışkan yüzeyi açığa çıkarmak için ikinci kağıt kapağı banttan ayırın. Bu işlem, yüklemeye hazır bir cam plaka oluşturur ve yükleme tamamlanır tamamlanmaz mühürleme yapılabilir. Kuyucukların hızlı ve verimli bir şekilde mühürlenmesi için, tekli silolanmış lamelleri plakanın yakınına yerleştirin.Lipidi eritmek için sıcaklık kontrollü bir blokta 45 °C'de üç dakika bekletin. Kullanılan lipidin tipik olarak mono land olduğunu unutmayın. Bu videoda, lipid erirken görünürlüğü artırmak için lipide kırmızı bir boya eklenmiştir.Lipid protein karıştırma adımında kullanılmak üzere iki adet 100 µL gaz sızdırmaz Hamilton şırıngası hazırlayın; protein solüsyonunu içerecek olan şırıngadaki Teflon yağını temizleyin. Lipid içeren şırıngayı bunun yanına yerleştirin. Bu durumda, yağ olduğu gibi bırakılır.Dar lümenli kuplörü iki şırınganın arasına yerleştirin ve ardından kuplörü lipid şırıngasının ucuna bağlayın. Kuplörü şırıngaya sıkıca sabitleyin ancak aşırı sıkmaktan kaçının. Pistonu lipid şırıngasının gövdesinden çıkarın.Lipidin erimiş olduğundan emin olun. Pipeti 30 µL değerine ayarlayın ve erimiş lipid kapağından yavaşça 30 µL alın. Lipid flakonu.Lipid, azot veya argon altında -80 °C'de saklanmalıdır. Erimiş lipidin mümkün olan en fazla miktarı, şırınganın açık ucundan yavaşça aktarılmalıdır. Bu sırada hava boşluğu oluşmamasına dikkat edilmelidir.Şırıngayı dikey tutarak pistonu, erimiş lipid ile temas edecek şekilde gövdeye yerleştirin ve pistonu gövde boyunca yavaşça ilerletin. Gösterildiği gibi, işlem sırasında yanlışlıkla hapsolmuş hava kabarcığı yukarı çıkar ve tahliye edilir. Artık gövdede, hacmini kesin olarak belirlemeniz gereken bir erimiş lipid tıkaç bulunmaktadır.Bu işlem, şırınga gövdesi üzerindeki işaretler okunarak yapılabilir. Bu durumda hacim 23 microliters'tır ve bu değer laboratuvar defterine kaydedilir. Kılıfı, konnektörden uzanan iğnenin üzerine kaydırın.Erimiş lipidi namlu boyunca yukarı itmek ve ardından yavaşça ve nazikçe konnektörün merkezindeki iğneye aktarmak için pistonu kullanın. İğne hafifçe fazla doldurulursa, lipidin açık uçtan dışarı çıktığı görülecektir. Pistonu hafifçe geri çekerek, fazla lipid konnektör iğnesinin ucuyla tam olarak aynı hizaya gelene kadar konnektöre geri çekilebilir.Bu durumda, şırınga bağlayıcı ünitesi tamamen doldurulmuş ve protein şırıngası ile birleştirilmeye hazır hale getirilmiştir. Büyük agregatları uzaklaştırmak için çözelti, 14, 000 G'de 10 dakika boyunca, dört santigrat derecede beş ila 10 dakika santrifüjlenmelidir. Kristalizasyon deneylerini kurmadan önce, protein çözeltisini buz kovasından çıkarın ve oda sıcaklığında dengeye gelmesini sağlayın.20 °C sıcaklıkta, olean için tam hidratasyona veya buna yakın bir seviyeye sahip kübik fazı oluşturmak amacıyla kullanılacak protein çözeltisinin hacmini hesaplayın. Faz diyagramında olduğu gibi, su ile tam hidratasyon ağırlıkça yaklaşık %40 su oranında gerçekleşir. Lipid şırıngasının, 0,94 mg/µL yoğunlukta 23 µL mono ile doldurulduğunu hatırlayın.Bu, 21,6 miligram lipide karşılık gelmektedir; dolayısıyla 21,6 çarpı dört bölü altı, yani 14,4 miligram veya 14,4 mikrolitre protein çözeltisi gereklidir. 25 veya 50 mikrolitrelik bir Hamilton şırıngası ile gerekli protein çözeltisi hacmini çekin, çözeltiyi şırınga gövdesindeki pistonun Teflon ucuna aktarın. Hava kabarcıkları oluşmamasına dikkat ederek iğneyi dikkatlice geri çekin ve şırıngadaki protein çözeltisi hacmini ölçün. Bu değer, önceki adımda belirlenen değerle eşleşmelidir.Lipid yüklü şırınga ile birleştirme hazırlığı için, protein solüsyonunu şırınga gövdesi boyunca dikkatlice yukarı doğru ilerleterek açık uçla aynı hizaya getirin. Bu işlem, şırınganın çıkış ucundan içeriye bakılarak gözlemlenebilir.Lipin protein çözeltisi yüklü şırıngalar artık birleştirilmeye hazırdır; bunu yapmak için protein şırıngasını, lipid şırıngasına bağlı olan ara parçanın açık ucuna vidalayın. İki şırınga ara parça vasıtasıyla birleştirildiğinde, bir şırıngadaki lipidden ara parça üzerinden diğer şırıngadaki protein çözeltisine kadar kesintisiz bir sıvı hacmi oluşmalıdır.Karıştırma hazırlığı aşamasında, birleştirilmiş ünite, bir şırınga sağ elde ve diğeri sol elde olacak şekilde tutulur. Bağlayıcıdaki olukların sızdırmazlığının sıkma işlemi sırasında bozulmamasını sağlamak için, her iki elin parmakları ve başparmakları kullanılarak her iki gövde üzerinden bağlayıcıya tork uygulanır. Bu aşamada hatalı birleştirilmiş karıştırma cihazı, ALS'ye zarar verecek ve sıkma işlemi sırasında sızıntıya yol açacaktır.Bu durum, kaçınılmaz deneme yanılmalar ve zaman zaman numune kayıpları ile ilgili bir deneyim meselesidir. Bu nedenle, değerli protein çözeltilerini kullanmaya başlamadan önce sistemi tanımak adına lipid ve su veya tampon çözelti ile pratik yapmak faydalıdır; karıştırmayı gerçekleştirmek için montajlanmış karıştırma ünitesinin protein tarafındaki pistonu, başparmak veya işaret parmağıyla sonuna kadar ilerleterek protein çözeltisini protein şırıngasından dışarı, bağlayıcı üzerinden lipid şırıngasına doğru itin. Ünite etkili bir şekilde sızdırmaz hale getirildiyse, bu işlem lipid tarafındaki pistonun eşit ve zıt yönde hareket etmesini sağlayacaktır.Lipid tarafındaki piston, lipid şırıngasının içeriğini tekrar kolon üzerinden protein şırıngasına itmek için kullanılır. Bu işlem birçok kez tekrarlanır. Homojen bir karışım fazı oluşturmak için bazen yüz veya daha fazla geçiş gerekebilir.Karıştırma işleminin başlangıcında, materyalin bağlantı parçası (coupler) üzerinden ileri geri hareketi düzensiz olabilir ve karıştırmayı gerçekleştirmek için zaman zaman ekstra kuvvet gerekebilir. Bu durum beklenen bir durumdur. İlk karıştırma işlemine genellikle örnekte homojen olmayan bir bulanıklığın oluşması eşlik eder ve bu da yine beklenen bir durumdur.Homojenizasyon ilerledikçe, pistonları ileri geri hareket ettirmek için gereken kuvvetle hissedilen doku ve ortaya çıkan kübik fazın görsel görünümü, viskoz kübik faza özgü olacak şekilde daha tekdüze hale gelir. Koşullar uygunsa ve kübik faz oluşursa, dispersiyon şırınga gövdesinde optik olarak şeffaf görünmelidir.Bu nedenle, şırınga gövdesi üzerindeki işaretler, gövdedeki mezo faz üzerinden net bir şekilde okunabilmelidir. Renkli proteinlerin durumunda, mezo faz proteinin rengini alacaktır ancak optik olarak şeffaf kalacaktır. Şırınga karıştırıcının kısa bir süre buz üzerinde bekletilmesiyle karıştırma sırasında numunenin çok hafifçe soğutulması, homojenleşmeyi ve şeffaflığın sağlanmasını hızlandırabilir.Ancak, örneği aşırı karıştırmamak önemlidir; sürtünme kaynaklı ısınma nedeniyle örnek sıcaklığının yükselmesine yol açabileceğinden, aşırı şiddetli karıştırmadan kaçınmaya özen gösterilmelidir. Bu aşamada, kübik mesa fazı oluşmuş ve protein lipid tabakasına yeniden yerleştirilmiştir. Mesa fazı artık kristalizasyon plakalarının münferit kuyucuklarına dağıtılmaya hazırdır.Ancak öncelikle, mezo faz, tekrarlayıcı bir dağıtıcıya monte edilmiş 10 µL'lik bir Hamilton şırıngasına aktarılmalıdır. Bu işleme şırıngayı dağıtıcıya bağlayarak başlayın. Şırıngayı kübik mezo faz ile doldurun.İğneyi ve pistonu şırıngadan çıkarın. Teflon vana yerinde kalsın. Sabitleme somununu küçük bir madeni para yardımıyla dağıtıcıdan çıkarın.Sıralı kol tamamen geri çekilmiş durumdayken, pistonu ve iğnesi çıkarılmış olan şırıngayı dispenserin tutma halkasından geçirin. Tutucu somunu, conta tarafı şırınga boyunca bakacak şekilde yerleştirin ve şırınganın açık ucuna sıkıca vidalayın.Şırınganın tutucu halkada düzgün şekilde ortalandığından ve gövdenin cırcır koluna paralel olarak hizalandığından emin olunmalıdır. Her iki durum da gözle kontrol edilebilir. Bu iki gereksinim önemlidir çünkü piston serbestçe hareket etmezse, yükleme sırasında kaynak şırıngasında basınç birikebilir ve sızıntı meydana gelebilir. Pistonu, birkaç tur gevşetilmiş tutucu somunla birlikte kavrayıcı halkadan geçirin ve pistonu şırınganın açık ucuna doğru yönlendirin.Sıçratma koluna tamamen basarak pistonu gövdenin içine itin ve pistonun gövde içinde serbestçe ve tamamen hareket ettiğini kontrol edin. Eğer vida ve kılavuz çubuk gevşetilmişse, bunları yeniden sıkın ve pistonun serbestçe hareket ettiğini tekrar kontrol edin. Dağıtım şırıngası artık doldurmaya hazırdır.Montajı tamamlanmış karıştırma ünitesinin bir tarafındaki pistonu sıfır mikrolitre mezuniyet çizgisine getirin. Mezo fazı diğer şırıngaya ve ara parçaya aktarmak için, boş şırıngayı UL'si yerindeyken karıştırma ünitesinden ayırın ve yüklü şırıngayı, ara parçasıyla birlikte derhal 10 mikrolitrelik dağıtıcı şırınganın dişli ucuna bağlayın.Bağlantının ne kadar sıkı yapıldığı kritik bir öneme sahiptir. Daha önce belirtildiği gibi, mezo fazın kuplör üzerinden aktarılması için 100 mikrolitrelik şırınganın pistonu bastırılarak dağıtım şırıngası doldurulur. Eğer bağlantı sıkıysa ve dağıtım şırıngasındaki piston serbestçe hareket ediyorsa, dağıtım şırıngası dolarken pistonun, doldurma pistonunun hareket yönünde hareket etmeye başlaması gerekir.Koppüler takılı olan doldurma şırıngasını, dağıtma şırıngasından ayırın. Dağıtma şırıngasının çelik ucuna kısa, düz uçlu bir iğne sabitleyin ve dikkatlice sıkıştırın. Kavrama halkasındaki düğümü sıkarak pistonu cırcır koluna sabitleyin.Düğümün aşırı sıkılmamasına dikkat edilmelidir. Çünkü bu durum, pistonun çizilmesine ve deforme olmasına yol açarak onu kullanılamaz hale getirebilir. Sıkıştırılmış durumda cırcır koluna sağlanan hareket aralığının bir inçten fazla olmaması önemlidir.Burada gösterildiği gibi, pistonun bükülme eğilimi olacaktır ve iletim başarısız olabilir. Pistonu namlu içinde ilerletmek, böylece iğnenin boş hacmini doldurmak ve iğneyi yüklemek için cırcırlı tambura birkaç kez basın. Bu adım, iğne ucundan sürekli bir mesa fazı şeridi çıkana kadar 10 kez tekrarlanmalıdır.İğne artık, derhal başlatılması gereken kristalizasyon denemelerinin kurulmasında kullanılmaya hazırdır. Kristalizasyon denemeleri kurulmadan önce, protein yüklü kübik fazın çok uzun süre bekletilmesi önerilmez. Bazı proteinler, ek çöktürücü içermeyen kübik fazda kararsız olduğundan, yüklemeyi kolaylaştırmak için çok kuyucuklu bir kristalizasyon plakası ve lamelini tezgahın birkaç inç üzerinde yükseltilmiş bir yüzeye yerleştirin.Yüzey hafif karanlık olduğunda optimal kontrast ve artırılmış görünürlük elde edilir. Çöktürücü çözeltileri homojenize edin ve şişelerin kapaklarını açın. Dispans şırıngasını bir elle dikey tutarken, çöktürücü dağıtım probunu bir mikrolitreye ayarlayın; boşta kalan elinizle iğne ucunu kuyucuğun tabanının merkezine ve doğrudan üzerine konumlandırın.Bir numara. Cam yüzeye bir bolus mease püskürtmek için tekrarlayan dispenser üzerindeki düğmeye basın. Bolus hacmi 200 nanolitredir.Standart tekrarlayıcı dispenser 10 µL'lik bir şırınga ile kullanıldığında, iğne ucu kuyucuk tabanının birkaç yüz µm üzerinden fazla olmamalıdır. Doğru dağıtımın sağlanması için tekrarlanabilir dağıtım kolaylıkla elde edilir; bunun için sadece biraz pratik yapmak yeterlidir. Ardışık dört kuyucuğa mease yüklendikten sonra, her bir mease bolusunun üzerine 1 µL çöktürücü çözelti yerleştirin.Hasta başına iki mikrolitre kullanarak ve standart tek kullanımlık uçlarla mümkün olduğunca hızlı bir şekilde, dolu kuyucukların üzerine bir lamel yerleştirin; su sızdırmaz bir mühür oluşturmak için lamelin kuyucukları düzgün ve tekdüze bir şekilde kapattığından emin olun. Spacer bandın açıkta kalan yapışkan yüzeyiyle temas ettiği noktalarda lamele basınç uygulamak için bir spatula kullanın. Ölçüm ve çöktürücü dağıtma işlemi, plaktaki tüm kuyucuklar doldurulup mühürlenene kadar tekrarlanabilir.Plaka artık inceleme ve inkübasyon için hazırdır. Takip amacıyla plakayı net bir şekilde etiketleyin. Işığa duyarlı proteinler, genellikle plakaların inkübasyon odasına yerleştirilmeden önce alüminyum folyo ile sarılmasıyla işleme alınır.Bunlar çıkarılabilir ve düşük yoğunluklu veya uygun renkte ışık altında mikroskopla incelenebilir. Plakaları genellikle 20 °C civarındaki sıcaklık kontrollü bir hazneye düzenli bir program dahilinde yerleştirin. 10 veya 20 kat büyütmeli polarize ışık mikroskobu kullanarak duvarlardaki kristal büyümesini inceleyin.Amaç, yazarın laboratuvarında kullanılan takvim şu şekildedir: kurulum sonrası 0, 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21, 30. gün. Mease bolusunu dikkatlice inceleyin. 140 mikron kalınlığındaki örnek içinde odak derinliğini ayarlayın.İnceleme hem normal ışık altında hem de çapraz polarizörler arasında yapılmalıdır; kübik fazda büyüyen renksiz membran proteini kristalleri normal ışıkla bakıldığında şu şekilde görünür. Polarize ışıkla bakıldığında meso fazda büyüyen renksiz membran proteini kristalleri şu şekilde veya şöyle görünür; normal ışıkla bakıldığında meso fazda büyüyen doğal renkli membran proteinleri ise şu şekilde veya şöyle görünür.Yapı belirleme genel sürecindeki sonraki adımlar, kristallerin hasat edilmesi ve kriyosoğutulması ile bunlardan elde edilen x-ışını kırınımının kaydedilmesi ve işlenmesidir. Bu konular, bu serideki ayrı JoVE makalelerinde ele alınmaktadır.

crystallizing-membrane-proteins-for-structure-determination-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Elektron kristalografisi sipariş membran protein dizileri oluşumu için iki boyutlu (2D) kristalizasyon çalışmalarda değerlendirilmesi son derece kritik ve zor bir iştir. 90kDa - Burada tarama ve 15 aralığında ağırlıklı olarak küçük membran proteinlerinin 2D kristalleri tespit yaklaşım tarif.

Elektron Kristalografi Yapısal Biyoloji Araştırmaları Küçük Membran Proteinleri İki boyutlu Kristalizasyon Denemeler değerlendirilmesi

Protokolleri LCP kristalizasyon denemeler ve hasat kristalleri kurma, LCP-sıkı bağlamak kristalleşme öncesi testlerin başlangıç ​​koşulları bulma lipidik kübik bir fazlı (LCP) protein, sulandırıldıktan itibaren bir membran proteini kırınım kaliteli kristaller elde etmek için gerekli adımları açıklar .

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Kristallendirilmesi

Bicelles, bir çift katlı lipid içinde membran proteinleri (MP) korumak değil, kristalizasyon, robotlar tarafından yüksek verimlilik tarama kolaylaştıran benzersiz faz davranışları lipid / amphiphile karışımları. Bu teknik hem prokaryotik ve ökaryotik kaynaklardan başarıyla yüksek çözünürlüklü yapıların bir dizi üretti. Bu video lipidik bicelle karışımı üretmek için orta crystallizations çalışmalar (manuel olarak robot gibi) ve hasat kristalleri kurma, bicelle karışımı içine milletvekilleri...

Yüksek verim Kristalizasyon lipidik Bicelle Yöntemiyle Membran Proteinleri

Burada makromoleküler X-ışını kristalografisi yapı belirleme kullanım için lipidik mesophases içinde zar proteinlerinin yüksek verimli kristalleşme için bir robot bir yaklaşım tarif edilmektedir. Yöntemine ayrılmaz viskoz ve yapışkan protein yüklü Mezofaz taşıma kapasitesine sahip üç robotlar tanıtıldı.

Lipidik Mesophases Membran Proteinleri Yüksek throughput Kristalizasyon için bir robot kullanımı

Burada makromoleküler X-ışını kristalografisi yapı belirleme kullanım için lipidik kübik ve sünger aşamalarında büyüdü hasat ve kriyo-serin membran proteini kristaller Yapısal ve İşlevsel Biyoloji Grup Caffrey Membran uygulanan prosedürler açıklanmıştır.

Makromoleküler Kristalografi tarafından Yapı Tayini için lipidik Mesophases Yetiştirilen Membran Proteinlerinin Hasat ve Cryo-soğutma Kristaller

Lipid membranlar bir prototip voltaj kapılı potasyum kanalı tam sulandırılması için prosedürler açıklanmıştır. Sulandırılmış kanallar biyokimyasal testler, elektrik kayıtları, ligand ve tarama elektron kristalografik çalışmalar için uygundur. Bu yöntemler, başka zar proteinlerinin yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için genel uygulamalar olabilir.

Yapısal ve İşlevsel Araştırmalar için Lipid Membranlar bir Kv Kanal Sulandırma

β namlulu dış zar proteinleri (OMP'ler), Gram-negatif bakterilerin, mitokondrilerin ve kloroplastların dış zarları içinde birçok işleve hizmet eder. Burada, X-ışını kristalografisi veya NMR spektroskopisi ile yapı belirleme için yeterli miktarlarda β namlulu OMP'lerin üretimi için protokoller sunarak yapısal çalışmalarda bilinen bir darboğazı hafifletmeyi umuyoruz.

β-varil Dış Membran Proteinleri Yapı Tayini Doğru - Yapıların itibaren Crystals

X-ışını serbest elektron lazerlerinde ve senkrotron kaynaklarında seri kristalografi için lipidik kübik fazda membran protein mikro kristallerinin hazırlanması ve verilmesi için prosedürleri açıklıyoruz. Bu protokoller aynı zamanda çözünür protein mikro kristallerinin dahil edilmesi ve verilmesi için de uygulanabilir, bu da sıvı enjeksiyona kıyasla numune tüketiminin önemli ölçüde azalmasına yol açar.

Hazırlık ve Seri Femtosecond Kristalografi için lipidik Cubic Faz Protein mikro kristallerinin teslimi

Lipid monolayerler, on yıllardır yapısal çalışmalar için iki boyutlu (2D) protein kristalleri oluşturmak için bir temel olarak kullanılmaktadır. Hava-su arayüzünde stabildirler ve elektron görüntüleme için ince bir destekleyici malzeme olarak hizmet verebilirler. Burada lipid monolayerlerinin biyolojik çalışmalara hazırlanması konusunda kanıtlanmış adımları sunuyoruz.

Elektron Kristalografik Çalışmaları için Lipid Monolayer Yöntemi Kullanılarak Numune Hazırlama

Bu protokol, sterol taşıyıcı ABCG5/G8'in kristalizasyonu için bir kurulumu açıklar. ABCG5/G8, asılı damla kristalizasyonu için iki seliler halinde yeniden oluşturulur. Protokol, özel malzemeler veya substratlar gerektirmez, bu da X-ışını kristalografisi yoluyla protein yapısını belirlemek için herhangi bir laboratuvarda erişilebilir ve uyarlanmasını kolaylaştırır.

ABCG5/G8 X-ışını kristalografisi için lipidik bicelle ortamında kristalleşme

Öğrenin, lipidik mezofazlar kullanarak membran proteinlerini kristalize etme yöntemini. Bu protokol, yapısal biyoloji ve ilaç tasarımı için yüksek kaliteli kristaller üretmeyi sağlar.

Lipidik Mesophases kullanarak Yapı Tayini için Membran Proteinleri Kristalize

Daha fazla video keşfet