Lipidik Mesophases kullanarak Yapı Tayini için Membran Proteinleri Kristalize

Merhaba ve Membran Yapısal ve Fonksiyonel Biyoloji Grubuna hoş geldiniz. Benim adım Martin Caffery. Araştırmamızın odak noktası, şeması ilk slaytta gösterilen biyolojik zardır, hücreyi ve hücre altı organelleri çevreleyen zar, moleküler olarak ince bir yapıdır, sadece iki lipid molekülü boyunca ve proteinlerle çivilidir.

Hem lipitlere hem de proteinlere uygulanan yapı ve işlevlerle ilgileniyoruz. Bununla birlikte, bu JO serisinin amaçları doğrultusunda, odağımı zar proteinleriyle sınırlayacağım. Bu zar proteinlerinin iki nedenden dolayı moleküler düzeyde nasıl işlev gördüğünü anlamaya çalışıyoruz.

İlk olarak, bir şeyin nasıl çalıştığını bilmenin entelektüel tatmini vardır. İkincisi, nasıl çalıştığını bilerek, tıpkı bisikletiniz veya arabanız gibi, arızalanırsa tamir etme olasılığı vardır. İlaç tasarımı, bu tür bir çalışmanın bariz bir sonucudur.

Bir zar proteininin moleküler düzeyde nasıl çalıştığını anlamak için benimsediğimiz yaklaşım, kristalografik yapısını belirlemektir. Bu, tüm atomların veya en azından proteini oluşturan tüm hidrojen olmayan atomların üç boyutlu uzaydaki konumunun belirlenmesini içerir. Bu amaçla kullandığımız yöntem kısaca makromoleküler X-ışını kristalografisi MX olarak adlandırılmaktadır.

Burada, MX kullanılarak yapısı belirlenen bir zar proteini örneğini görüyoruz, mx yapmak için proteinin kristal kristalinin fraksiyonda olması gerekmektedir. Tahmin edebileceğiniz gibi, gösterildiği gibi makromoleküler kristalografi kullanılarak yapılandırılmış belirlemede yer alan birçok adım vardır. Burada. Tipik olarak bunlar, bir zar proteini hedefinin tanımlanmasını ve ardından üretilmesini, saflaştırılmasını ve kristalleştirilmesini içerir.

Kırınım ölçümleri, bir ev veya bir senkrotron x-ışını kaynağı kullanılarak kristal üzerinde gerçekleştirilir. Kırınım verileri işlenir ve daha sonra bir moleküler model ile donatılan bir elektron yoğunluğu haritası elde edilir. Model rafine edildiğinde, proteinin etki mekanizmasını keşfetmek ve yapı bazlı ilaç tasarımı için kullanılabilir.

Bu JO makalesinin odak noktası, size mezo yönteminde adı verilen yöntemle lipid mezo fazlarını kullanarak zar proteinlerinin çok küçük bir kalite kristalini nasıl ürettiğimizi göstermektir. Yöntemin ve kapsamının yakın tarihli bir incelemesi referans birde mevcuttur. Burada izleyeceğimiz adım adım protokol, bir uç mezo membran protein kristalizasyon denemesinin kurulması için gereken adımları ve gereken süreyi özetleyen bir akış şemasına atıfta bulunularak açıklanmıştır.

Bu video, kesikli kırmızı çizgilerle çevrelenmiş adımları kapsar. Manuel modda mezo kristalizasyonda yapmanız gereken öğeler burada gösterilmiştir. Lipidi daha belirgin hale getirmek için genellikle mono ole olan barındırma mantarını oluşturmak için saflaştırılmış membran protein lipidinin konsantre bir çözeltisini içerirler.

Bu videoda, kırmızı boya çökeltici çözeltiler, saflaştırılmış su borusu sevişme cihazları ve tek kullanımlık uçlar ve bazıları çıkarılabilir iğneler, protein çözeltisini lipid ile karıştırmak için kullanılan dar delikli bir kuplör olan gaz geçirmez Hamilton şırınga çeşitleri ile katkılanmıştır. Hamilton cam mikroskobu slaytlarından ve kapak fişlerinden tekrar eden bir dağıtıcı. Kuyu oluşturma cımbızları, yontulmuş buz mendilleri, bir hesap makinesi ve hepsinden önemlisi laboratuvar defteriniz için ideal silolanmış delikli çift çubuklu ara bant.

Bir cam sandviç kristalizasyon plakası hazırlamak için aşağıdaki prosedür kullanılır. Yükleme için, tezgahın üzerine silolanmış bir mikroskop lamı yerleştirin. Koruyucu kağıt kapağını, delikli çift yapışkanlı ara bant şeridinin bir yüzeyinden çıkarın.

Bandı yapışkan tarafı aşağı bakacak şekilde kaydırma basıncının yüzeyi ile temas edecek şekilde yerleştirin. Bandı slayda kapatın. Kuyuların tabanını korumak için bant ile rulo arasına bir brayer veya rulo alüminyum folyo yerleştirilebilir.

Üst yapışkan yüzeyini ortaya çıkarmak için ikinci kağıt kapağını banttan çıkarın. Bu prosedür, yükleme tamamlanır tamamlanmaz yükleme ve ardından tavan için hazır olan bir cam plaka oluşturur. Kuyuların hızlı ve verimli bir şekilde tavanlanması için plakaya yakın ayrı silolanmış kapak kayar.

Lipidi, erimiş hale getirmek için üç dakika boyunca 45 santigrat derecede sıcaklık kontrollü bir bloğa yerleştirin. Kullanılan lipitin tipik olarak mono arazi olduğunu unutmayın. Bu videoda, lipit erirken görünürlük için lipit eklenmiş kırmızı bir boya vardır.

Kullanım için iki adet 100 mikrolitrelik gaz geçirmez Hamilton şırınga hazırlayın Lipid protein karıştırma adımında, protein çözeltisini içerecek şırıngadan Teflon kürk yağını çıkarın. Lipidi tutacak şırıngayı yanına yerleştirin. Bu durumda, fal yerinde bırakılır.

Dar delikli kuplörü iki şırınga arasına yerleştirin ve ardından kuplörü lipit şırınga parmağına bağlayın. Kuplörü şırıngaya sıkın, ancak aşırı sıkmayın. Pistonu lipit şırınganın namlusundan çıkarın.

Lipidin erimiş olduğundan emin olun. Pipeti 30 mikrolitreye ayarlayın ve yavaşça 30 mikrolitre erimiş lipit kapağını alın. Lipid şişesi.

Lipit, eksi 80 santigrat derecede nitrojen veya argon altında saklanmalıdır. Erimiş lipidin mümkün olduğu kadar çoğunu şırınganın açık ucuna yavaşça verin. Hava boşlukları oluşturmamaya dikkat edin.

Pistonu erimiş leopar ile temas edecek şekilde namluya yerleştirin ve şırınga dikey olarak tutularak pistonu namluda yavaşça yukarı doğru ilerletin. Gösterildiği gibi, sıkışan hava kabarcığı işlem sırasında yanlışlıkla yükselir ve serbest bırakılır. Artık namluda hacmini doğru bir şekilde belirlemeniz gereken bir erimiş lipit tıkacımız var.

Bu, şırınga namlusundaki işaretleri okuyarak yapılabilir. Bu durumda, hacim laboratuar not defterine kaydedilen 23 mikrolitredir. Kürkü, kuplörden uzanan iğnenin üzerine kaydırın.

Erimiş lipidi namludan yukarı ve yavaşça ve nazikçe kuplörün çekirdeğindeki iğneye zorlamak için pistonu kullanın. İğne hafifçe aşırı doldurulursa, lipitin açık ucunda attığı görülecektir. Pistonu hafifçe yedekleyerek, fazla lipid, kuplör iğnesinin ucuyla aynı hizaya gelene kadar kuplöre çekilebilir.

Bu durumda, şırınga kuplör ünitesi tamamen yüklenir ve protein şırıngası ile birleştirilmeye hazırdır. Çözelti, büyük agregaları çıkarmak için 10 dakika boyunca 14.000 G'de, dört santigrat derecede beş ila 10 dakika döndürülmelidir. Kristalizasyon denemelerine başlamadan önce, protein çözeltisini buz kovasından alın ve oda sıcaklığında dengeleyin.

Protein hacmini hesaplayın, bu nedenle olean a 20 santigrat derece için tam hidrasyonda veya buna yakın kübik fazı oluşturmak için kullanılacak çözelti. Su ile tam hidrasyon, faz diyagramında olduğu gibi ağırlıkça %40'a yakın su ile gerçekleşir. Lipid şırıngasını mikrolitre başına 0.94 miligram yoğunlukta 23 mono ile yüklediğimizi hatırlayın.

Bu, 21.6 miligram lipide karşılık gelir, bu nedenle 21.6 çarpı dörde bölünür altı veya 14.4 miligram veya 14.4 mikrolitre protein çözeltisi gerekir, 25 veya 50 mikrolitrelik bir Hamilton şırıngası ile gerekli miktarda protein çözeltisi alır, çözeltiyi protein çözeltisinin namlusundaki pistonun Teflon ucuna aktarın. Hava kabarcıklarını önlemeye dikkat edin, iğneyi dikkatlice çekin ve şırıngadaki protein çözeltisinin hacmini ölçün. Önceki adımda sunulan değerle eşleşmelidir.

Lipid yüklü şırınga ile birleştirmeye hazırlanırken. Protein solüsyonunu, açık ucuyla aynı hizada olacak şekilde namluya dikkatlice yerleştirin. Bu, namlu sonlandırma ucundan aşağıya bakılarak gözlemlenebilir.

Lipin protein çözeltisi, yüklü şırıngalar artık Mex'in bunu yapması için hazırlık olarak birleştirilmeye hazırdır, protein şırıngasını lipit şırıngaya bağlı kuplörün açık ucuna vidalayın. Kuplör vasıtasıyla iki şırıngayı birleştirdikten sonra. Bir şırıngadaki lipitten kuplörden diğer şırıngadaki protein çözeltisine kadar sürekli bir sıvı hacmi bulunmalıdır.

Karıştırmaya hazırlanırken, monte edilen ünite, bir şırınga sağ elinde ve diğeri solda olacak şekilde tutulur. Kuplördeki oluklara karşı contanın sıkma sırasında sağlam kalmasını sağlamak için her iki elin parmakları ve başparmağı kullanılarak her iki namluya da kuplöre tork uygulanır. Bu aşamada monte edilen karıştırma cihazı ALS'ye zarar verecek ve sıkma altında sızıntıya neden olacak ve ayrıca sızıntıya yol açacaktır.

Kaçınılmaz deneme yanılma ve ara sıra numune kaybı ile ilgili bir deneyim meselesidir. Bu nedenle, karıştırmayı etkilemek için değerli protein çözeltisi kullanmaya başlamadan önce sistem hakkında bir fikir edinmek için lipit ve su veya tampon çözelti ile pratik yapmak, monte edilmiş karıştırma ünitesinin protein tarafındaki pistonu, başparmak veya işaret parmağı ile protein şırıngasından kuplörden geçirip lipit şırıngaya sürerek sınırına kadar ilerletmek faydalı olacaktır. Ünite etkili bir şekilde kapatılmışsa, bu hareket pistonun lipit tarafında eşit ve zıt bir hareketine neden olacaktır.

Lipid tarafındaki piston şimdi lipid şırıngasının içeriğini koliden geri döndürmek ve protein şırıngasına sürmek için kullanılmaktadır. Bu işlem birçok kez tekrarlanır. Bazen homojen bir misa fazı üretmek için yüz veya daha fazla geçiş gerekir.

Karıştırmanın başlangıcında, malzemenin kuplör boyunca ileri geri hareketi eşit olmayabilir ve bazen karıştırmayı gerçekleştirmek için ekstra kuvvet gerekir. Bu beklenen bir durumdur. İlk karıştırmaya genellikle numunede homojen olmayan bir bulanıklığın gelişmesi eşlik eder ve yine beklenir.

Homojenizasyon ilerledikçe. Pistonları ileri geri hareket ettirmek için gereken kuvvet tarafından algılanan doku, ortaya çıkan kübik fazın görsel görünümü gibi daha homojen ve viskoz kübik fazın karakteristik hale gelir. Koşullar uygunsa ve kübik faz oluşursa, dispersiyon şırınga namlusunda optik olarak şeffaf görünmelidir.

Bu nedenle, şırınga namlusu üzerindeki işaretler, namludaki mezo faz boyunca net bir şekilde okunabilir olmalıdır. Renkli proteinler söz konusu olduğunda, mezo faz proteinin rengine sahip olacak, ancak optik olarak şeffaf olacaktır. Şırınga karıştırıcısını kısa bir süre için buz üzerine yerleştirerek karıştırma sırasında numunenin çok hafif soğutulması, homojenizasyonu ve şeffaflığın elde edilmesini hızlandırabilir.

Bununla birlikte, sürtünmeli ısınma nedeniyle numune sıcaklığının yükselmesine neden olabileceğinden, aşırı kuvvetli karıştırmayı önlemek için numuneyi aşırıya kaçmamak önemlidir. Bu noktada, kübik misa fazı oluşmuştur ve protein, lipit kil içine yeniden oluşturulur. Misa fazı artık kristalizasyon plakalarının ayrı kuyucuklarına dağıtılmaya hazırdır.

Bununla birlikte, ilk olarak, mezo faz, tekrarlayan bir dağıtıcıya monte edilmiş 10 mikrolitrelik bir Hamilton şırıngasına aktarılmalıdır. Şırıngayı dağıtıcıya ince bir şekilde bağlayarak bu işleme başlayın. Şırıngayı kübik mease ile yükleyin.

İğneyi ve pistonu şırıngadan çıkarın. Teflon fal'ı yerinde bırakın. Tespit somununu küçük bir madeni para yardımıyla dağıtıcıdan çıkarın.

Cırcır kolu tamamen geri çekilmiş durumda. Şırıngayı pistonu ve iğnesi olmadan dağıtıcının tutma halkasından geçirin. Tutma düğümü contasını şırıngaya bakan tarafını değiştirin ve şırınganın açık ucuna sıkıca vidalayın.

Şırınganın tutma halkasında düzgün bir şekilde ortalandığından ve namlunun cırcır koluna paralel olarak hizalandığından emin olmak için özen gösterilmelidir. Bu iki gereklilik önemlidir, çünkü piston serbest çalışmazsa ve yükleme sırasında kaynak şırıngada basınç oluşursa ve sızıntı meydana gelebilir. Pistonu tutucu somun ile kavrama halkasından geçirin, birkaç tur gevşetin ve pistonu şırınganın açık ucuna yönlendirin.

Cırcır koluna tam olarak basın, pistonu namluya doğru hareket ettirin ve namlu içinde serbestçe ve içinden geçip geçmediğini kontrol edin. Vida ve kılavuz çubuk gevşetilmişse, yeniden sıkın ve pistonun serbestçe hareket ettiğini tekrar kontrol edin. Dağıtım şırıngası artık yüklemeye hazırdır.

Monte edilmiş karıştırma ünitesinin bir tarafındaki pistonu sıfır mikrolitre derecelendirme işaretine getirin. Mezo fazı diğer şırıngaya ve kuplöre aktarmak için. Boş şırıngayı UL'si yerindeyken karıştırma ünitesinden ayırın ve yüklü şırıngayı hemen 10 mikrolitrelik dağıtım şırıngasının dişli ucuna bağlı kuplör ile bağlayın.

Kaplinin yapıldığı sızdırmazlık derecesi kritiktir. Daha önce belirtildiği gibi, 100 mikrolitrelik şırınganın pistonuna bastırarak dağıtım şırıngasını yükleyin, böylece mezo faz kuplörden geçer. Kaplin sıkıysa ve dağıtım şırıngasındaki piston serbest çalışıyorsa, dağıtım şırıngası dolarken piston yükleme pistonunun hareket yönünde hareket etmeye başlamalıdır.

Kuplör takılıyken yükleme şırıngasını dağıtım şırıngasından ayırın. Kısa, düz uçlu bir iğneyi dağıtım şırıngasının çelik ucuna sabitleyin ve yerine dikkatlice sıkın. Clamp tutma halkasındaki düğümü sıkarak pistonu cırcır koluna bağlayın.

Düğümün aşırı sıkılmamasına özen gösterilmelidir. Çünkü bu, pistonu çizebilir ve deforme edebilir ve kullanılamaz hale getirebilir. Kelepçeli durumda cırcır koluna sağlanan hareket aralığının bir inçten fazla olmaması önemlidir.

Bunun ötesinde gösterildiği gibi, piston bükülme eğilimi gösterecektir ve teslimat başarısız olabilir. L Pistonu namluda ilerletmek için cırcır tamburuna birkaç kez basın, böylece iğnenin boş hacmini doldurun ve iğneyi yükleyin. Bu adım, iğnenin ucundan mesa fazının sürekli bir dizisi çıkana kadar 10 defaya kadar tekrarlanmalıdır.

İğne artık hemen başlaması gereken kristalizasyon denemelerinin kurulmasında kullanıma hazırdır. Kristalizasyon denemelerini kurmadan önce protein yüklü kübik fazın çok uzun süre tutulması tavsiye edilmez. Bazı proteinler kübik fazda ilave çökeltici olmadan kararsız olduğundan, çok kuyulu bir kristalizasyon plakası yerleştirin ve yükleme kolaylığı için tezgahın birkaç inç üzerine yükseltilmiş bir yüzeye kızağı örtün.

Yüzey biraz karanlık olduğunda optimum kontrast ve gelişmiş görünürlük elde edilir. Çökeltici çözeltileri homojenize edin ve şişeleri açın. Dağıtım şırıngası bir elinizde dikey olarak tutulurken çökeltici dağıtım propusunu bir mikrolitreye ayarlayın, iğne ucunu merkeze ve doğrudan kuyu tabanının üzerine yerleştirmek için serbest elinizi kullanın.

Bir numara. Cam yüzeye bir bolus yumuşatmak için tekrarlayan dağıtıcı üzerindeki dağıtıcı üzerindeki düğmeye basın. Bolus hacmi 200 nanolitredir.

Standart tekrarlayan dağıtıcı 10 mikrolitrelik bir şırınga ile kullanıldığında, iğnenin ucu kuyu tabanının birkaç yüz mikrometreden fazla üzerinde olmamalıdır Uygun teslimatı sağlamak için, tekrarlanabilir teslimat kolayca elde edilir. Sadece biraz pratik gerektirir. Dört bitişik kuyucuk mease ile yüklendikten sonra, her bir mease bolusunun üzerine bir mikrolitre çökeltici çözelti yerleştirin.

Patent başına iki mikrolitre ve standart tek kullanımlık uçları mümkün olan en kısa sürede kullanarak, su geçirmez bir sızdırmazlık sağlamak için doldurulmuş kuyucukların üzerine düzgün bir şekilde örtmek için bir kapak fişi yerleştirin. Ara bandın açıkta kalan yapışkan yüzeyi ile temas ettiği yerde kapak kızağına baskı uygulamak için bir spatula kullanın. Kırıcı ve çökeltici dağıtma işlemi, plaka üzerindeki tüm kuyucuklar yüklenene ve mühürlenene kadar tekrarlanabilir.

Plaka artık inceleme ve inkübasyon için hazırdır. İzleme amacıyla plakayı net bir şekilde etiketleyin. Işığa duyarlı proteinler genellikle plakaların inkübasyon odasına yerleştirilmeden önce alüminyum folyoya sarılmasıyla işlenir.

Bunlar, hafif veya uygun şekilde renklendirilmiş ışıkta mikroskop altında çıkarılabilir ve incelenebilir. Plakaları sıcaklık kontrollü bir odaya, genellikle 20 santigrat derecede veya yaklaşık olarak yerleştirin Düzenli bir programda. 10 veya 20 kat met ile polarize bir ışık mikroskobu kullanarak duvarları kristal büyümesi açısından inceleyin.

Amaç, yazarın laboratuvarında kullanılan program aşağıdaki gibidir, gün 0 1 2 3 5 7 14 21 30 sonrası ayarlanmıştır. Kıstırma bolusunu dikkatlice inceleyin. 140 mikron kalınlığındaki numune içindeki odak derinliğinin ayarlanması.

İnceleme hem normal ışıkta hem de çapraz çapraz polarizörler arasında, normal ışıkla bakıldığında kübik fazda büyüyen renksiz zar protein kristalleri arasında yapılmalıdır. Şuna benze. Polarize ışıkla bakıldığında mezo içinde büyüyen renksiz zar protein kristalleri şu veya bu şekilde görünür, normal ışıkla bakıldığında mezo içinde büyüyen doğal renkli zar proteinleri şu veya bu şekilde görünür.

Genel yapılandırılmış belirleme sürecindeki bir sonraki adımlar, kristalleri hasat etmek ve kriyo soğutmak ve bunlardan x-ışını kırınımını kaydetmek ve işlemektir. Bu konular, bu serideki ayrı JoVE makalelerinde ele alınmıştır.