Yüksek verim Kristalizasyon lipidik Bicelle Yöntemiyle Membran Proteinleri

Bu video, Lipic B hücreleri kullanılarak saflaştırılmış membran proteinlerinin yüksek verimli kristalizasyon denemelerini kurmak için bir yöntem gösterecektir. İlk olarak, bir lipit ve bir deterjan karıştırılarak B hücreleri hazırlanır, saflaştırılmış zar proteini B hücresi karışımına dahil edilir ve kristalizasyon denemeleri bir nanolitre robot görsel incelemesi kullanılarak gerçekleştirilir. Standart bir ışık mikroskobu kullanmak, kristallerin varlığını ortaya çıkarır.

Bir kez oluşturulduktan sonra, protein kristalleri veri toplama ve yapılandırılmış belirleme için ekstrakte edilebilir ve dondurulabilir. Bu tekniğin ana avantajı, B hücrelerinin benzersiz faz davranışı nedeniyle, laboratuvarda bulunan standart ekipman ve robotların kristalizasyon için kullanılabilmesidir. B hücrelerinin kurulumu çok basit bir tekniktir ve hedef zar proteininizi deterjan hücremden çıkarmanıza ve onu lipik bir ortama yerleştirmenize olanak tanır.

Bu size taramak için tamamen yeni bir dizi koşul sunar. Birçok zar proteini üzerinde başarıyla kullanılan o kadar basit bir yöntemdir ki, denememek için hiçbir neden yoktur. B hücresi bazlı kristalizasyonun ilk adımı, bir B hücresi oluşturan lipid amfi karışımının hazırlanmasıdır.

Bu işlem büyük çaba gerektirir ve en çok zaman alan işlemdir. Tamamlanmasının birkaç saat sürebileceğini unutmayın. B hücreleri, çeşitli lipid amfi kombinasyonlarında ve geniş bir konsantrasyon aralığında oluşabilir.

Önerilen başlangıç noktaları için, ekteki yazılı protokoldeki tablo bir'e bakın, 2.8 ila bir molar oranında bir mililitre% 35 DMPC capso karışımı hazırlayarak başlayın. Bunu yapmak için, bir tüpte 0.26 gram DMPC ve 0.09 gram Chapo tartın. Karışımı deiyonize su girdabı kullanarak hacmi 1.0 mililitreye çıkarın.

Daha sonra, karışımı bir su banyosunda yaklaşık 40 santigrat dereceye kadar ısıtın, daha sonra jel kıvamına gelene kadar. Tüpü buzun üzerine yerleştirin. Numune tekrar olduğu gibi akışkan hale gelmelidir.

Daha sonra birkaç dakika tekrar girdap yapın, lipit tamamen eriyene kadar ısıtma, soğutma ve girdap adımlarında döngüye devam edin. Daha fazla döngü gerçekleştirildikçe, karışımın tamamlandıktan sonra soğuduktan sonra bulanıklaşabileceğini unutmayın. Karışım, oda sıcaklığında veya üzerinde berrak bir jel olacaktır ve hücreler tarafından buz üzerinde viskoz bir sıvı, uzun süreli saklama için eksi 20 santigrat dereceye yerleştirilebilir.

Daha sonra saflaştırılmış proteinler B hücresi ortamına dahil edilir. Bu basit bir işlemdir ve videonun bir sonraki bölümünde gösterilen kristalleşme ile aynı gün yapılmalıdır. DMPC capso B hücre karışımını, faz berrak bir jele dönüşene kadar oda sıcaklığında çözdürün.

Karışımı sıvılaştırmak için buzun üzerine koyun ve ardından homojen bir B hücresi fazını yeniden oluşturmak için kısa bir süre girdap haline getirin. Bu noktadan sonra, B hücresi karışımını ve saflaştırılmış proteini buz üzerinde tutun. Bu, B hücresini sıvı fazda tutacak ve pipetlemeye uygun hale getirecektir.

Daha sonra, B hücresi karışımını saflaştırılmış deterjan çözündürülmüş proteine hacimce bir ila dört oranında ekleyin. Ardından, çözelti berrak ve homojen hale gelene kadar nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Kabarcıklar ortaya çıkarsa, kısaca, onları bir masa üstü santrifüjde döndürün.

Proteinin hücrelere tam olarak dahil edilmesini sağlamak için karışımı buz üzerinde en az 30 dakika inkübe edin. Protein hücre karışımı artık kristalizasyon denemeleri için hazırdır. Kristalizasyon denemeleri, bir sivrisinek kristalizasyon robotu kullanılarak gösterilecektir.

96 kuyulu V alt plakayı buzun üzerine yerleştirerek soğutun. Çözeltinin viskozitesinin minimum olduğundan emin olmak için proteini hücre karışımı ile plakaya pipetleyin. Proteini hücre karışımı ile son adıma kadar buz üzerinde tutun.

Burada kullanılan robotun beş platformu var. Rezervuarı içeren mikroplakayı üçüncü platforma ve damlaların dağıtılacağı kristalizasyon kapağını beşinci platforma yerleştirin. Daha sonra proteini, dağıtım konumuna en yakın dört platforma hücre plakası ile yerleştirin.

Bu, hücre karışımı ile proteinin robot tarafından en son alınan protein olmasını ve hemen serbest bırakılmasını sağlar. Robot, çalışmayı başlatan yazılımı kullanarak, rezervuar çözeltisini ve ardından proteini hücre karışımı ile alacak ve dağıtım sırasında ısınmayı ve artan viskoziteyi önlemek için bunları damlalar halinde kapağa dağıtacaktır. Sivrisinekleri, çalışma tamamlanır tamamlanmaz rezervuarı protein ile hücre karışımı ile karıştırmak için programlamayın.

Hücre protein satın alma plakasını cihazdan çıkarın ve buzun üzerine yerleştirin. Kapağı cihazdan çıkarın ve damlalar ters çevrilecek şekilde rezervuar solüsyonunu içeren plakanın üzerine yerleştirin. Plakayı 20 santigrat derecede inkübe edin.

Kristal oluşumu ve optimizasyonu için diğer sıcaklıkların da test edilebileceğini unutmayın. Daha yüksek sıcaklıklar, proteini katmanlar halinde önceden düzenleme avantajına sahip olan katmanlı fazı indükler. Dört santigrat derece ile 20 santigrat derece arasındaki sıcaklıklar taranabilir.

Dört santigrat derecenin altındaki sıcaklıklar, lipitlerin birinci, üçüncü gün ve daha sonra haftalık olarak uzun süreler boyunca çökelmesine neden olabilir, standart bir ışık mikroskobu kullanarak kristal görünümünü ve büyümesini değerlendirin. Burada, parlak bir alan görüntüsü ve yalnızca saldırı durumunda gözlemlenen iğne şeklindeki kristallerin bir UV görüntüsü gösterilmektedir. Kristallerden floresan tespit edilmedi, bu da bu görüntüde yanlış bir pozitife işaret ediyor.

Çökeltici olarak metil propan diol kullanıldığında oluşan çubuk şeklinde bir kristal. Kristal haftalık olarak floresan floresan olduğunu gösterir, bu da bir protein kristali olabileceğini gösterir, ancak x-ışını kırınımı kullanılarak inatçı olmadığı bulunmuştur. Burada, denemelerin kurulmasından yaklaşık dört hafta sonra gözlemlenen bir kristal gösterilmektedir.

UV ışığı altındaki güçlü floresan, bunun bir protein kristali olduğunu doğrular. Bu videoda izlediğiniz gibi. B hücreleri mevcut olduğunda, doğrudan saflaştırılmış protein ile karıştırılabilirler ve bu noktadan itibaren kristalleşme neredeyse tam olarak standart deterjan bazlı protokoller gibi devam eder.

Diğer bir belirgin avantaj, optimizasyon amacıyla B hücrelerine spesifik lipitler ekleme yeteneğidir. Teknikte gerçekten çok yönlülük var ve kullanımı o kadar basit ki, tüm membran protein kristalizasyon projeleri için denenmelidir.