Elektron Kristalografi Yapısal Biyoloji Araştırmaları Küçük Membran Proteinleri İki boyutlu Kristalizasyon Denemeler değerlendirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, elektron kristalografisi ile zar proteinlerinin yapılandırılmış tayini için en uygun 2D kristalleşme koşullarını belirlemektir. Bu, proteini doğal lipid çift tabakasından çözündürmek için saflaştırma sırasında önce uyumlu bir deterjan kullanılarak gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, ekzojen lipid eklemek ve protein lipid deterjan karışımının diyalizi yoluyla deterjanı uzaklaştırmaktır, bu da dikkatli bir şekilde kontrol edilen koşullar altında 2D kristallerle sonuçlanır.

Prosedürün üçüncü adımı, numuneleri yanıp sönmek, camsı bir duruma dondurmaktır. Prosedürün son adımı, cryo em ile veri toplamaktır. Nihayetinde, verilerin hesaplamalı görüntü işlemesi yoluyla proteinin nihai yapısını veren sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, ben laboratuvardanım. Georgia Institute of Technology'deki Biyoloji Okulu'nu gömüyorum. Merhaba, ben Tina korkunç.

Georgia Teknoloji Enstitüsü Biyoloji Fakültesi Kimya ve Biyokimya Okulu'ndaki Berry Laboratuvarı'ndan ve Schmidt Kray Laboratuvarı'ndan geliyorum. Ve ben Matt Johnson, Georgia Institute of Technology'deki Biyoloji Okulu'ndaki Ingleborg Schmidt Cry laboratuvarından. Bugün size em ile 2D koral asyon denemelerini değerlendirmek için bir prosedür göstereceğiz.

Laboratuvarımızda 2D kristalleşme koşullarını belirlemek ve optimize etmek için bu protokolü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım Bu işleme başlamak için, karbon kaplı 400 gözenekli bakır iletim elektron mikroskobu veya TEM ızgaraları üzerinde negatif lekeli numuneler hazırlanır. Protea lipozom örneğinin iki mikrolitresini karbon kaplı bir TEM ızgarası altına pipetleyin ve 60 saniye inkübe edin.

Numune eşit şekilde dağılmazsa, pipet ucunun yan tarafıyla hafifçe kaydırın. Yırtık bir watman Dört numaralı filtre kağıdı ile kenardan bir sonraki blok. Bu, protea lipozomların aşırı çıkarılması olmadan sıvının optimum şekilde uzaklaştırılmasını sağlar ve hassas karbon filminin korunmasına yardımcı olur.

Lekelemenin hemen ardından. 30 saniye sonra% 1'lik pisuar asetat lekesinden iki mikrolitre uygulayın, ızgaranın kenarından kurulayın. Yine, numune yüksek konsantrasyonlarda viskoz gliserol veya sükroz içeriyorsa, tipik olarak %10 ila %20 aralığında, negatif boyamadan önce ızgaranın bir gliserol veya sükroz içermeyen tamponla birkaç döngü yıkanması, pisuar tat çözeltisi ile uygun boyamaya izin vermek için yardımcı olabilir.

Izgaralar hazırlandıktan sonra, zar oluşum dağılımı ve morfolojisi ve genel ızgara kalitesini değerlendirmek için numuneyi düşük büyütmede görselleştirmek için elektron mikroskobu kullanılır. Daha sonra, görüntüleri elde etmek ve 2D kristalleri tanımlamak için görüntülerin RIA dönüşümlerini gerçekleştirmek için yüksek büyütme kullanılır. Elektron mikroskobu numune tutucusunda düşük ızgaraya başlamak için, ortalama membran dağılımının ilk izlenimini elde etmek için 2000 ila 10.000 x'lik bir ara büyütme kullanın.

Membranların dağılımının kapsamını, morfolojilerini ve boyutlarını bir laboratuvar defterine not edin. Bir CCD kamera ile temsili görünümleri kaydedin. Daha sonra, gerekirse, ızgaralara genel bir bakış elde etmek için kabaca 400 ila 800 x aralığında düşük büyütmeli numuneleri gözlemleyin.

Bu, numune konsantrasyonu, eşit olmayan protea, lipozom dağılımı ve karbon filminin kısmi kırılması ile ilgili sorunları ortaya çıkararak ızgara hazırlığını değerlendirmek için değerli bilgiler sağlayabilir. Düşük veya orta büyütmede bir ızgara ilgi alanı belirleyin. Ardından, farklı zarlardaki olası sırayı değerlendirmek için yüksek büyütme kullanın.

Bu, 2D kristalizasyon denemelerinin erken aşamalarında kritik öneme sahiptir. İyi düzenlenmiş alanlara sahip umut verici protea lipozomlarını tanımlamak ve daha sonraki deneyler sırasında tekrarlanabilirliği doğrulamak için, 2D kristalleri taramak için en uygun yüksek büyütme ayarını belirlemek için 50.000 ila 60.000 x arasında bir büyütme ile başlayın. 2D kristal boyutlarına ve birim hücre boyutuna bağlı olarak, yüksek büyütme ayarı 30.000'e kadar düşürülebilir veya 80.000'e kadar yükseltilebilir.

Burada bitişik bir konumda İlgilenilen görüntü alanına, ilgilenilen alanın gerçekten bir zar olup olmadığı konusunda belirsizlik varsa, yaklaşık eksi 400 nanometre veya daha yüksek bir oranda bulanıklaştırırız. Numuneyi karbon filmi, MICA parçaları veya protea lipozomları ile karıştırılabilecek diğer artefaktlar açısından inceleyin. Ayrıca tipik membran katlanmasını ve morfolojisini ayırt etmek için kenarları gözlemleyin.

Ardından, ilgilenilen alanı bir CCD kamera ile inceleyin. Optimum yüksek büyütme ayarında bir CCD görüntüsü toplayarak, daha küçük ve/veya çoğunlukla hidrofobik bir zar proteininin kafesi, CCD görüntüsünün kendisinin görsel olarak değerlendirilmesiyle gözlemlenemeyebilir. Bu durumda, görüntünün tamamı çevrimiçi bir foer dönüşümü veya ft için kullanılır.

Bununla birlikte, sıralı dizi küçükse, bu FT, sinyal-gürültü oranını iyileştirmek, kutulu görüntü boyutunu küçültmek, küçültülmüş kutuyu görüntünün üzerine taşımak ve canlı bir ft gerçekleştirmek için önemli miktarda gürültü içerecektir, sıralı dizilerin en iyi şekilde tanımlanması için canlı FT'nin gama işlevini ayarlayın. Aşırı yüksek bir gama değeri, gürültü katkıları nedeniyle noktaları gizleyebilirken, aşırı düşük bir değer, daha zayıf noktaların tanımlanmasını önleyecektir. Negatif lekeli 2D kristallerin çözünürlüğünün eksi 400 nanometrelik bir DFO'da kabaca 15 angstrom olduğunu tahmin edin.

Bir ila üç nokta sırası belirlemeyi bekleyin. Noktaların ve herhangi bir mozaiğin keskinliğine dikkat edin. 18 kilodaltonluk küçük bir zar proteininin 2D kristalleri birkaç mikron boyutundadır.

FTS üzerindeki noktalar, canlı FT kutusunun keskin ve kolayca tanımlanabilir hareketi, kafesin mozaiksiz sürekli olduğunu gösterir. Daha geniş bir çözünür alana sahip daha büyük bir proteinin kafesi, T-E-M-C-C-D görüntü koleksiyonunun küçük ekranında tanımlanabilir ve FT, kafes kalitesinin daha iyi bir değerlendirmesini elde etmek için gereklidir, FT'deki mozaik gürültüsü gibi özellikler de dahil olmak üzere, sıralanmamış bir protea. Lipozom, lekelerin küçük protein 2D kristallerinden mi yoksa gürültüden mi kaynaklandığını belirlemek için zayıf noktalarla karıştırılabilir.

Canlı ft için kutuyu hareket ettirin. Lekeler hemen kaybolursa gürültüdürler, ancak küçük bir alanda bile değişmeden bırakılırsa, lipit kristalleri belirgin bir morfoloji ve ft gösterdiğinden kristaller muhtemelen mevcuttur. Bu lipid kristalleri, bir görüntünün görsel olarak incelenmesi ve tutarlı birim hücre boyutları ile de tanınabilir.

İlk denemelerde yağış meydana gelebilir. Yüksek büyütmede inceleme, protein çökelmesi ve lipit agregatları arasında ayrım yapmak için kullanılır. Lipid agregatları söz konusu olduğunda, sulandırma gerçekten gerçekleşmiş olabilir ve sonraki deneyler, 30.000 ila 50.000 x'te sulandırmayı indüklemek yerine, yalnızca zar boyutunu artırmak ve düzen üretmek için gerekli parametrelerin ayarlanmasını gerektirecektir.

Bu karanlık yapıların kenarları, onların protein içermeyen zarlardan oluştuğunu ortaya koymaktadır. Optimum koşullar altında yağış numuneleri, büyük oranda 2D kristal içerecektir. Veri toplama için en büyük ve en iyi düzenlenmiş 2D kristaller görsel olarak seçildiğinden, zarların homojen bir görünümünü hedeflemek gerekli değildir.

Bu tür numuneler, kristalizasyon bu tür numuneler, maksimum sayıda yüksek çözünürlüklü görüntü elde etmek için kriyo EM veri toplama için kullanıldığında kolayca tanınacaktır. Bu prosedürü yaparken size TEM ile küçük hafızalı proteinlerin 2D kristalini nasıl tarayacağınızı göstereceğiz. Bu noktaya kadar zaten önemli miktarda zaman ve çaba harcadığınız için, umut verici bir kristalleşme durumunu gözden kaçırmamak için titiz olmayı unutmamak önemlidir.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.