Lazer Diseksiyon hücreleri Altküme Kaynak gösterilmeden Uygulanan Drosophila Kanat Disk

Burada, drosophila kanat diskindeki susturulmuş ve susturulmamış bölgelerin karşılaştırmalı RNA transkript profillemesini gerçekleştirmek için uygulanan lazer mikrodisseksiyonun ayrıntılı bir açıklamasını sunmaktayız. Bu yaklaşım, biyolojik materyal olarak manuel olarak diseke edilmiş drosophila imaj diskleri, ana ekipman olarak ise bir lazer mikrodissektör gerektirmektedir. LI A-L-L-M-D 6, 000 ve bir gerçek zamanlı PCR cihazı kullanmaktayız.

BioRad iq kullandık. Gereken beş küçük araç şunlardır: konkav lam, küçük bir boya fırçası, mikrodiseksiyon penseti, asılı damla lam, şırınga iğnelerine monte edilmiş böcek pensleri, PET membranlı metal çerçeve ve küçük plastik tüpler. Bu yöntem aşağıdaki adımları içerir.

GAL dört UAS sistemini kullanarak progenyda lokalize ve spesifik bir gen susturmayı tetiklemek amacıyla, uygun iki oph transgenik hattını çaprazlamanın birinci adımı. İkinci adım, disseksiyon çerçevelerinin hazırlanması. Üçüncü adım, lazer mikro dissektörün kurulması.

Dördüncü adım, genetik çaprazlama sonucu elde edilen larval soyundan kanat imaginal disklerini manuel olarak toplamaktır. Beşinci adım, GFP ile işaretlenmiş imaginal disklerin belirli alanlarına lazer mikrodissection uygulanmasıdır. Altıncı adımda, diskin susturulmuş ve susturulmamış bölgelerinin eşdeğer alanlarının transkripsiyon profillemesi yapılacak ve böylece ilgilendiğiniz genin susturulmasıyla tetiklenen etkiler belirlenebilecektir.

Gen X olarak adlandırılan in vivo transkripsiyon profillemesi; mikro diseksiyonla ayrıştırılmış alanlardan RNA ekstraksiyonu, manuel diseksiyonun doğruluğunun kontrolü, iki örnekteki GFP ekspresyonunun R-T-P-C-R ile değerlendirilmesi, susturulan genin olası hedeflerinin ekspresyonunun iki örnekte gerçek zamanlı R-T-P-C-R veya mikroarray analizi yapılarak kantifyasyonunu gerektirecektir. Şimdi her bir adımın detaylarına geçelim.

İlk adım, genetik çaprazlamadır. Genetik çaprazlama, GAL4 UAS transjenik suşlarını içerir ve larva döllerinde susturulmuş imajinal diskler elde etmeye odaklanmıştır. Çok yönlü GAL4 sistemi, RNA interferansı yoluyla spesifik ve lokalize gen susturulmasını tetiklemenize olanak tanır.

Bir suş, belirli bir zamansal veya mekansal düzende GAL4 eksprese eden sürücü transgenini ve GAL4 ekspresyon domaininin görselleştirilmesine olanak tanıyan bir UAS-GFP raporlayıcısınıle çaprazlamaya dahil eder. İkinci suş ise, hücrede eksprese edildiğinde spesifik olarak gen X'i hedefleyebilen, saç tokası (hairpin) susturucu RNA eksprese eden bir UAS yanıtlayıcı transgeni getirir.

Bu RNA, bu çaprazlamanın dölünde seçilen X genini spesifik olarak susturabilen küçük interferans RNA üretmek için parçalanır. UAS susturma transgeni yalnızca GAL four proteini eksprese eden hücrelerde transkribe edilir, böylece X geninin mekansal olarak kısıtlanmış bir susturulması indüklenir. Çeşitli uygulamalar arasında, posterior kompartmanda spesifik susturmayı yönlendiren Grailed GAL four sürücüsü ile susturulmuş kanat diskindeki RNA transkript profillemesine odaklandık.

Sessizlik bölgesi, U-A-S-G-F-P transgeninin ekspresyonu ile işaretlenmiştir. Arka kompartıman içerisinde iki olay tetiklenecektir: GGFP ekspresyonu ve x geninin susturulması.

İkinci adım, RNA aktivitesini inhibe etmek için diseksiyon çerçevelerinin işlenmesi. Çerçeve lamlarını ve diseksiyon aletlerini oda sıcaklığında en az bir saat boyunca DEPC'li su ile yıkayın ve steril bir bölmede kurumaya bırakın. RNA aktivitesini inhibe etmek için, önceden RNA'dan arındırılmış yeni bir 50 ml'lik tüp kullanın; tüpü DEPC'li su ile doldurup içine forseps, askılı damla lamı ve bir pet çerçeve yerleştirin.

Her ikisi de mikrodissection için gereklidir. Tüpü kapatın, ters çevirin ve ardından en az bir saat boyunca reaksiyona girmesi için bekleyin. Oda sıcaklığında, bir saat sonra DEPC suyunu pensle başka bir tüpe aktarın.

Slaytların düşmemesi için onları tüpün içinde tutun. Ardından slaytların tüp içerisinde kurumasına izin verin. Üçüncü adım, mikrodiseksiyon düzeneği.

Öncelikle, gerekli tüm cihazları; floresan lambayı, mikroskobu ve mikrodissection yazılımını açın. Bir uyarı penceresi, lazeri de açmanız gerektiğini hatırlatacaktır. Lazerle ilgili bu işlemi yapın ve mikrodissection kurulumunu tamamladığınız sırada lazerin ısınmasını bekleyin.

Şimdi dokuların toplanacağı kuyucukları hazırlama zamanı geldi. Leica LMD 6,000 lazer kesim cihazı, farklı örneklerin toplanması için dört adede kadar tüpün yüklenmesine olanak tanır. Bizim amacımız için sadece iki tüp yeterlidir.

Birincisi, GFP pozitif susturulmuş dokuyu toplamak, diğeri ise mikro diseksiyon ile GFP negatif susturulmamış dokuyu toplamak içindir. RNA'yı korumak için her iki tüp kapağını 20 µL tri-reagent çözeltisi ile doldurun. Artık mikrodiseksiyon işlemi kullanıma hazırdır. Dördüncü adım, joof larvalarından kanat imaj disklerinin manuel diseksiyonu.

Daha önce tarif edildiği şekilde elde edilen larval progenilerden kanat disklerini izole edin ve diğer dokuların diskleri kontamine etmediğinden emin olun. Bu amacı gerçekleştirmek için, diseksiyon yaklaşımı tüm orijinal disklerin toplu olarak toplamak için yaygın olarak kullanılan yaklaşımdan oldukça farklıdır. İlk olarak, yapışmış medyayı uzaklaştırmak için larvayı ringer çözeltisi ile yıkayın. Ardından larvayı asılı damla lamına aktarın ve ağzı aşağı doğru çekerken baş kısmını hemen kesin.

Böcek iğnelerini kullanarak diğer dokuları dikkatlice ayırın. Kırmızı çerçeve, toplanacak olan imaginal kanat disklerini göstermektedir. Disklerin yapışık dokulardan arındırıldığından emin olun; izole edilen her bir kanat diskini hemen kesmek üzere hızlı ve nazikçe bir diseksiyon çerçevesine aktarın.

Bu prosedür, toplamda yüz kanat diski sayısına ulaşıncaya kadar tekrarlanmalıdır. Beşinci adım, GFP işaretli kanat disklerinin belirli bölgelerinin lazer mikrodissection yöntemiyle ayrılmasıdır. Orijinal kanat diski membrana yerleştirildiğinde, kesme işlemine geçebilirsiniz.

Çerçeveyi tutucusuna yerleştirin ve tutucuyu motorlu sahneye sabitleyin. LMD 6,000'i standart bir mikroskop gibi kullanarak orijinal kanat diskini bulun. Disk üzerine odaklanın ve kesim alanını belirleyin.

Diskin hem GFP pozitif hem de diğer tarafına sığacak oval bir alan çizin. GFP pozitif kısmı toplamak istediğiniz tüp kapağını seçin. Start cut butonuna basın.

Mikro disektör, hareket ve kesme fonksiyonlarını seçerek önceden belirlediğiniz hız ve güçle dokuyu kesme işlemine devam eder. Seçilmeyen doku parçası düşene kadar kesme işlemini manuel olarak hassaslaştırabilirsiniz. 3D animasyon, mikro disektör kesimi sırasında neler olduğunu göstermektedir; burada bir lazer dokuya odaklanarak seçilen çevre boyunca bir kesik oluşturur.

Kesim işlemi tamamlandığında, doku parçası seçilen tüp kapağına ve sonuç olarak tri Reagent içine düşer. İlk kesimden sonra, eşdeğer bir GFP negatif alanı kesmek için kesim bölgesini kanat diskinin diğer tarafına taşıyın. Yeni kesime geçmeden önce, GFP pozitif dokuları GFP negatiflerden ayrı tutmak için farklı bir tüp kapağı seçtiğinizden emin olun.

Otomatik kesimden sonra başlatma kesme düğmesine basın. İkinci kesimden önce, 3D animasyonda gösterildiği gibi kesimi manuel olarak hassaslaştırma işlemine geçin. Motorlu tabla, seçilen tüp kapağını kesim alanının altına taşır.

Lazer ışını, seçilen çevre boyunca doku üzerine odaklanır ve kesim tamamlandığında doku parçası, Tri reajenı içeren seçili tüp kapağına düşer. Yeterli materyali toplamak için işlemi yüz adet imaginal kanat diskinde tekrarladık. Örnekleri topladıktan sonra tüpleri boşaltın.

Bu, şimdiye kadar yapmış olduğunuz tüm çalışmaları kaybetmenize neden olabilecek hassas bir adımdır. Bu nedenle dikkatli olun. Kapağı ters çevirerek kapatın ve deneye devam edin.

Bu, GFP pozitif dokunun bulunduğu örnektir. Diğeri ise GFP negatif dokunun bulunduğu örnektir. Altıncı adım, transkripsiyon profilleme.

Sıvıyı kapaktan ayırmak için tüpleri santrifüj edin ve bir mililitreye kadar Try reaktifi ekleyin. Her biri yaklaşık 5.000 µm² olan yüz adet alandan, standart try reaktifi protokolünü izleyerek RNA ekstraksiyonu gerçekleştirin. Elde ettiğimiz verim 1,5 µg RNA olmuştur.

Rastgele hekzamerler ile CD NA sentezlemek için vitrogen'de üst simge üç kullandık. Manuel diseksiyonun doğruluğu, iki örnekteki GFP ekspresyonu R-T-P-C-R ile kontrol edilerek denetlendi. Kantitatif R-T-P-C-R içeren jelde gösterildiği gibi.

Sessizleştirilmiş gen X'in ekspresyon seviyelerini, gen X aracılı düzenleyici yolağın olası varsayımsal hedeflerinin ekspresyon seviyeleriyle birlikte değerlendirdik. Bu diyagram, gen X ve varsayımsal hedeflerinden birinin ekspresyon seviyelerine bir örnek göstermektedir. Katılaşmamış kanat disklerinin ön ve arka kompartmanlarındaki bazal ekspresyon seviyelerine göre bunlara gen Y diyelim.

Seçilen gen X'in aktivitesinin susturma işlemi sonrası %40'a düştüğü saptanmıştır. Buna karşılık, olası hedeflerinden biri olan gen Y'nin anlamlı düzeyde yukarı regüle olduğu ve yedi kat arttığı görülmüştür; bu durum, gen Y'nin gen X tarafından negatif şekilde regüle edildiği hipotezini doğrulamamızı sağlamıştır. Yukarıda açıklanan deneysel yaklaşımın, çeşitli düzenleyici yolaklar üzerindeki olası hedeflerin doğrulanmasında başarıyla uygulanabileceği sonucuna varmış bulunmaktayız.