Lazer Diseksiyon hücreleri Altküme Kaynak gösterilmeden Uygulanan Drosophila Kanat Disk

Burada, drosophila kanat diskinin susturulmuş ve susturulmamış bölgelerinin karşılaştırılmış RNA transkript profillemesini elde etmek için uygulanan lazer mikrodiseksiyonunun kapsamlı bir tanımını sunuyoruz. Bu yaklaşım, biyolojik materyal olarak, ana ekipman olarak manuel olarak diseke edilmiş drosophila görüntü disklerini, bir lazer mikro disektör gerektirir. LI A-L-L-M-D 6.000 ve gerçek zamanlı bir PCR makinesi kullanıyoruz.

Bir BioRad iq kullandık. Gerekli olan beş küçük alet, içbükey bir plaka, küçük bir boya fırçası, mikrodiseksiyon forsepsleri, asılı, damla sürgü, böcek pingleri, şırınga iğnelerine monte edilmiş, pet membranlı metal çerçeve, küçük plastik tüplerdir. Bu yöntem aşağıdaki adımları içerir.

GAL dört UAS sistemini kullanarak döllerde lokalize ve spesifik bir gen susturmayı tetiklemek için iki uygun oph transgenik çizgiyi geçmek için birinci adım. İkinci adım, diseksiyon çerçevelerini tedavi etmek için. Lazer mikro disektörü kurmak için üçüncü adım.

Dördüncü adım, genetik çaprazlamanın larva döllerinden kanat hayali disklerini manuel olarak toplamak için. Beşinci adım, GFP etiketli hayali disklerin belirli alanlarının lazer mikrodiseksiyonunu gerçekleştirmek için. Altıncı adım, diskin susturulmuş ve katı olmayan bölgelerinin eşdeğer alanlarının transkripsiyon profili, ilgilendiğiniz genin susturulmasıyla tetiklenen etkilerin oluşturulmasına izin verecektir.

X geni olarak adlandırın in vivo transkripsiyon profili, mikro diseke alanlardan RNA'nın ekstraksiyonunu, manuel diseksiyonun doğruluğunun kontrolünü, iki numunedeki GFP ekspresyonunun R-T-P-C-R ile değerlendirilmesini, varsayılan ekspresyonunun ölçülmesini gerektirecektir. İki örnekteki sessizlik geninin gerçek zamanlı R-T-P-C-R veya bir mikrodizi analizi gerçekleştirilerek hedefleri. Şimdi her adımda daha fazla ayrıntı.

İlk adım, genetik çaprazlama. Genetik çaprazlama, GAL dört UAS transgenik suşunu içerir ve larva döllerinde susturulmuş hayali diskler elde etmeye odaklanır. Çok yönlü GAL four sistemi, RNA girişimi ile spesifik ve lokalize gen susturmayı tetiklemenize olanak tanır.

Bir suş, çaprazda, belirli bir zamansal veya mekansal modelde GAL dördünü ifade eden sürücü transgenini ortaya çıkarır. Ve GAL dört ifade alanının görselleştirilmesine izin veren A-U-A-S-G-F-P raporlayıcısı. İkinci suş, hücrede bir kez eksprese edildiğinde X genini spesifik olarak hedefleyebilen, saç tokası susturucu RNA'yı eksprese eden bir UAS yanıtlayıcı transgeni sunar.

Bu RNA, bu çaprazlamanın döllerinde seçilen X genini spesifik olarak susturabilen küçük enterferans yapan RNA üretmek üzere bölünür. UAS susturucu transgeni, yalnızca GAL dört proteinini eksprese eden hücrelerde kopyalanır, böylece X geninin uzamsal olarak kısıtlı bir susturulmasına neden olur. Çeşitli uygulamalar arasında, arka bölmede spesifik susturmayı yönlendiren Grailed GAL dört sürücü tarafından susturulan kanat diskinde RNA transkript profillemesine odaklandık.

Sessizlik bölgesi, U-A-S-G-F-P transgeninin ifadesi ile işaretlenir. Arka bölmede. GGFP'nin ifadesi ve x geninin susturulması iki olay tetiklenecektir.

İkinci adım, RNA'ların aktivitesini inhibe etmek için diseksiyon çerçevelerinin tedavisi. Çerçeve slaytlarını ve diseksiyon aletlerini oda sıcaklığında en az bir saat DEPC suyla yıkayın ve steril bir odada kurumaya bırakın. RNA'ların aktivitesini inhibe etmek için, tüpe konan forseps ile DEPC suyu ile doldurulmuş, zaten RNA içermeyen yepyeni bir 50 ml'lik tüp, asılı bir damla sürgü ve bir evcil hayvan çerçevesi kullanın.

Her ikisi de mikrodiseksiyon için gerekli. Tüpü kapatın, ters çevirin ve en az bir saat reaksiyona girmeye bırakın. Oda sıcaklığında, bir saat sonra DEPC suyunu forseps ile başka bir tüpe taşıyın.

Slaytları tüpün içinde tutun, böylece düşmesinler. Ardından slaytların tüpün içinde kurumasını bekleyin. Üçüncü adım, mikrodiseksiyon kurulumu.

İlk olarak, Gerekli tüm cihazları, floresan ampulü, mikroskobu ve mikrodiseksiyon yazılımını açın. Bir uyarı penceresi size lazeri de açmanızı hatırlatacaktır. Bunu yapın ve mikrodiseksiyon kurulumunu tamamlarken lazerin ısınmasına izin verin.

Şimdi dokuyu toplamak için kuyuları hazırlamanın zamanı geldi. Kesmek. Leica LMD 6.000 lazer kesim ekipmanı, farklı numuneleri toplamak için dört adede kadar tüpün yüklenmesine izin verir. Amacımız için sadece iki tüpe ihtiyacımız var.

Biri, GFP pozitif sessizlik dokusunu toplamak için, diğeri GFP negatif unil dokusunu toplamak için bir mikro pec ile. RNA'yı korumak için her iki tüp kapağını da 20 mikrolitre tri reaktif çözeltisi ile doldurun. Şimdi mikrodiseksiyon kullanıma hazırdır Dördüncü adım, joof larvalarından kanat görüntüleme disklerinin elle diseksiyonu.

Kanat disklerini daha önce tarif edildiği gibi elde edilen larva döllerinden izole edin ve diğer dokuların diskleri kontamine etmediğinden emin olun Bu amaca ulaşmak için, diseksiyon yaklaşımı, tüm orijinal disklerin büyük kısmını toplamak için yaygın olarak kullanılandan oldukça farklıdır. İlk olarak, yapışan ortamı çıkarmak için larvaları zil solüsyonunda yıkayın. Sonra asılı bir damla sürgüsüne aktarın ve hemen ağzı aşağı çekerek kafayı kesin.

Böcek pimlerini kullanarak şimdi diğer dokuları dikkatlice inceleyin. Kırmızı çerçeve, toplanacak hayali kanat disklerini gösterir. Diskleri yapışan dokudan hızlı ve nazik bir şekilde uzak tutun: İzole edilen her kanat diskini hemen kesmek için bir diseksiyon çerçevesine aktarın.

Bu prosedürün toplam yüz kanat diski sayısına ulaşılana kadar tekrarlanması gerekir. Beşinci adım, GFP etiketli kanat disklerinin belirli alanlarının lazer mikrodiseksiyonu. Orijinal kanat diski zarın üzerine geldikten sonra kesime devam edebilirsiniz.

Çerçeveyi tutucusuna yerleştirin ve tutucuyu motorlu sahneye sabitleyin. LMD 6.000'i yaygın bir mikroskop olarak kullanarak orijinal kanat diskini arayın. Ona odaklanın ve kesimi ayarlayın.

Diskin her iki tarafına, GFP pozitifine ve diğer tarafına sığacak oval bir alan çizin. GFP pozitif kısmını toplamak istediğiniz tüp kapağını seçin. Kesmeyi başlat düğmesine basın.

Mikro disektör: Hareket ve kesme fonksiyonunu seçerek dokuyu daha önce ayarladığınız hız ve güçle kesmeye devam eder. Seçilmemiş doku parçası düşene kadar kesimi manuel olarak iyileştirebilirsiniz. 3D animasyon, mikroların altında neler olduğunu gösterir: Dissektör kesimi, bir lazer, dokuya odaklanır, seçilen çevre boyunca bir kesim yapar.

Kesim yapıldıktan sonra, doku parçası seçilen tüp kapağına ve sonuç olarak tri Reaktife düşer. İlk Kesimden sonra, eşdeğer bir GFP negatif alanı kesmek için kanat diskinin diğer tarafındaki kesme alanını hareket ettirin. Yeni kesime devam etmeden önce, GFP pozitif dokuları GFP negatiften ayırmak için farklı bir tüp kapağı seçtiğinizden emin olun.

Otomatik kesimden sonra kesmeyi başlat düğmesine basın. İkinci kesimden önce 3D animasyonda gösterildiği gibi kesimi manuel olarak iyileştirmeye devam edin. Motorlu tabla, seçilen boru kapağını kesim alanının altında hareket ettirir.

Lazer ışını, seçilen çevre boyunca kesilen dokuya odaklanır ve kesim yapıldıktan sonra, doku parçası, Tri reaktifi içeren seçilen tüp kapağına düşer. Yeterli malzeme toplamak için, prosedürü yüz hayali kanat diski üzerinde tekrarladık. Numuneleri topladıktan sonra tüpleri boşaltın.

Bu, şimdiye kadar yaptığınız tüm işleri kaybetmenize neden olabilecek hassas bir adımdır. Bu yüzden dikkatli ol. Kapağı ters çevirin ve deneye devam edin.

Bu, GFP pozitif dokuya sahip olandır. Bu, GFP negatif dokuya sahip diğeridir. Altıncı adım, transkripsiyon profili oluşturma.

Sıvıyı kapaktan çıkarmak için Tüpleri döndürün ve bir mililitreye kadar Try reaktifi ekleyin. Her biri yaklaşık 5.000 mikrometre karelik yüz alandan standart deneme reaktif protokolünü izleyerek RNA ekstraksiyonu gerçekleştirin. Verimimiz 1.5 mikrogram RNA idi.

CD NA'yı rastgele hekza ile sentezlemek için in vitrojen olarak üç üst simge kullanıyoruz. Manuel diseksiyonun doğruluğu, iki numunedeki GFP ekspresyonunun R-T-P-C-R ile kontrol edilmesiyle kontrol edildi. Kantitatif R-T-P-C-R ile jelde gösterildiği gibi.

Sessizlik geni X'in ekspresyon seviyelerini, X geni aracılı düzenleyici yolun olası varsayılan hedeflerinin seviyeleriyle birlikte değerlendirdik. Bu diyagram, X geninin ifade seviyelerinin bir örneğini ve varsayılan hedeflerinden birini göstermektedir. Katı olmayan kanat disklerinin ön arka bölmelerindeki bazal ekspresyon seviyelerine göre onlara Y genleri deyin.

Seçilen X geninin aktivitesi susturulduktan sonra %40'a kadar düşmüş bulundu. Buna karşılık, varsayılan hedeflerinden biri olan Y geninin, X geni tarafından negatif olarak düzenlendiği hipotezini doğrulamamıza yol açan yedi kat artışla önemli ölçüde arttığı bulundu.