Name: Lazer Diseksiyon hücreleri Altküme Kaynak gösterilmeden Uygulanan Drosophila Kanat Disk (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 59 s
Description: Öğrenin lazer mikrodiseksiyon yöntemiyle Drosophila kanat disklerinde gen ifadesi profillemesini. Bu teknik, susturulmuş ve susturulmamış bölgeleri karşılaştırarak doku mikroekolojisindeki gen düzenlemesini araştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar prof teşekkür ederim. Chiara Campanella ve Amra Yetkinlik Merkezi, lazer microdissector kullanımını sağlayarak Naples Federico II Üniversitesi, Napoli, İtalya, ve 3D animasyon cömert yardım için Bay Vincenzo Vicidomini.

Bölüm 1. Özgül ve Lokalize RNAi Maruz Drosophila hayali Kanat Diskler hazırlanması. Biyolojik madde olarak, elde edilen transgenik larvaları GAL4/UAS sistemi 1 yerelleştirilmiş ve özel gen susturulması tabi Drosophila hayali kanat diskler kullanılır. GAL4 sürücü, ikinci UAS cevaplayıcı taşıyan: Bu larva döl iki ebeveyn hatları içeren bir genetik çapraz orginates. Belirli bir zamansal ve / veya uzaysal desen GAL4 ifade etmek için ek olarak, sürücü hattı GAL4 ifade etki alanı görüntülemenizi sağlar UAS-GFP muhabiri taşır. UAS cevaplayıcı hattı, UAS sırası kontrolü altında bir saç tokası, susturma özellikle ilgi seçilen gen (çağrı geni X) 2 hedef RNA (hpRNA) ifade eder. Hücrede ifade hpRNA X oluşturmak için özel olarak seçilen gen susturmak için küçük bir müdahale RNA (siRNA) bölünmüş. Larva döl, sürücü ve UAS susturulması inşa GAL4 protein ifade bu hücrelerin sadece transkripsiyonu cevaplayıcı transgenlerin taşır ve böylece, seçilen gen X mekansal sınırlı susturulması uyarabildiklerini Çeşitli olası uygulamalar arasında, engrailed-GAL4 kontrolü altında bizim ilgi seçilen bir gen (gen X) (tr) sürücüsü, kanat disk 3 posterior kompartman belirli susturulması tetikleyebilir susturmak için uygulanan bu yaklaşım , topraklarından UAS-GFP transgen ifadesi damgasını vurdu. Susturuldu hayali kanat diskler, el disseke özellikle çevre kirlenmesine neden olan dokular, yapıştırma tracheas ortadan kaldırmak için özen. Her izole kanat disk sonra hızlı bir şekilde ve yavaşça seçilen alanların hemen lazer mikrodiseksiyon için önceden tedavi, RNaz ücretsiz diseksiyonu çerçeve nakledildi. Bölüm 2. Lazer mikrodiseksiyon kanat disk susturuldu (posterior) ve (ön) unsilenced bölmeleri seçilmiş alanlarda. Unsilenced (anterior; GFP-etiketlenmemiş) bölmeleri elde edildi; sonra kanat disk susturuldu (GFP etiketli arka) belirli alanlarda lazer mikrodiseksiyon, membran üzerinde oldu. Bu bir alana çekerek, hem de kolayca sığabilir yapıldı, disk GFP pozitif ve GFP-negatif tarafları. Microdissector altında, ilk seçilen çevresince bir kesim, lazer ışını GFP pozitif doku üzerinde duruldu. Microdissector seçilen hız ve güç kesme ile devam eder, ancak doku seçilen alanın altındaki tüp düşene kadar, elle kesim rafine için mümkündür. Bu tüp GFP pozitif doku sonraki RNA ekstraksiyonu için hazır olması, TRI Reaktif küçük bir hacim içerir. Biz sonradan unsilenced, GFP-negatif doku eşdeğer bir bölgeyi incelemek amacıyla, GFP-olumsuz yan kanat disk, tam tersi kesim alana taşındı. Bir kez daha, sonra otomatik kesme, el kesme rafine başladı. Sonra RNA ekstraksiyonu için hazır kesilmiş, GFP-negatif doku TRI Reaktif kurtarıldı, yapıldı. Bölüm 3. Microdissected Doku Alanları RNA Ekstraksiyon ve Transkripsiyon Profilleme. Biz kap sıvı ayırmak için tüpler döndü ve daha sonra standart TRI Reaktif protokolü takip RNA ekstraksiyonu, 1 ml TRI Reaktif eklendi. Yeterince malzeme toplamak için, 100 hayali kanat diskler üzerinde kesme işlemi tekrarlanır. Yaklaşık 5000 mikron 2 adet 100 bölgelerden başlayarak, verim RNA 1.5 mikrogram oldu. Rastgele hekzamer ile cDNA sentez Super Senaryo III (Invitrogen) kullanarak, manuel diseksiyon Doğruluk sonra RT-PCR ile susturuldu ve unsilenced örnekleri GFP ifade kontrol tarafından kontrol edildi. Master Mix (Invitrogen) kullanarak Gerçek zamanlı RT-PCR ile düzenleyici yolun varsayılan hedefleri ile birlikte, susturuldu gen X ifade düzeylerini belirlemek için odaklanmış sonraki kantitatif analizleri yapıldı.

<ol><li>Elliott, D. A., Brand, A. H. The GAL4 System A Versatile System for the Expression of Gene. Dahmann, C. , Humana Press Inc. Totowa, NJ. (2008).</li>
<li>Klein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wing+disc+development+in+the+fly%3A+the+early+stages.+%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Wing disc development in the fly: the early stages. </a> Current Opinion in Genetics & Development. 11, 470-475 (2001).</li>
<li>Dietzl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+transgenic+RNAi+library+for+conditional+gene+inactivation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila.</a> Nature. 448, 151-U1-151-U1 (2007).</li>
<li>Martin, F. A., Morata, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartments+and+the+control+of+growth+in+the+Drosophila+wing+imaginal+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Compartments and the control of growth in the Drosophila wing imaginal disc.</a> Development. 133, 4421-4426 (2006).</li>
<li>Tabata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+morphogen+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetics of morphogen gradients.</a> Nature Reviews Genetics. 2, 620-630 (2001).</li>
<li>Moreno, E. &amp, Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dMyc+transforms+cells+into+super-competitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">dMyc transforms cells into super-competitors.</a> Cell. 117, 117-129 (2004).</li>
</ol>

Unsilenced kanat disklerin ön / arka bölümlerinde elde bazal ekspresyon düzeyleri ile ilgili olarak, seçilen gen X faaliyet susturulması üzerine% 40 düşürüldü bulundu. Bunun aksine, olası hedefler (genler Y) biri bizi olumsuz X geni tarafından düzenlenir olduğu hipotezi doğrulamak için önde gelen (7 kat artış) up-regüle önemli ölçüde bulundu Biz, yukarıda açıklanan deneysel yaklaşım, çeşitli yasal yollar varsayılan hedeflerinin doğrulama başarıyla uygulanabilir olduğu sonucuna varıldı. <...

Suşları Fly Drosophila UAS-susturma hatları VDRC RNAi toplama 2 elde edilebilir. Bloomington Drosophila Menkul Kıymetler Merkezi (Indiana, ABD), GAL4 sürücü hatları bir koleksiyon mevcuttur. Ekipman Gerekli ekipman Lazer microdissector (Leica LMD6000), Coulter mikrofuge&#39;de 22R (Beckman), PCR (Benim Cycler BIO-RAD), Real Time PCR (BIO-RAD iQ5) içerir. Araçları Gerekli araçlar şunlardır: cam kuyular, fırça, mikrodiseksiyon forseps, asılı damla slaytlar, şırınga iğneleri, PET membran, plastik borular (50 ml, 05 ml, 0.25 ml) ile metal çerçeveler üzerine monte böcek pimleri.

lazer diseksiyon hücreleri altküme kaynak gösterilmeden uygulanan drosophila kanat disk

Laser Microdissection Applied to Gene Expression Profiling of Subset of Cells from the Drosophila Wing Disc

Dokuların heterojen doğası, mansap analizleri ödün, biyolojik örnekler üretilen bilgi miktarı kısıtlayıcı bir faktör olduğu kanıtlanmıştır. In vivo etkileşimleri kapsamlı moleküler analiz özetlemek için, birçok dokuda içinde varolan karmaşık ve dinamik hücresel dernekler göz önüne alındığında biri kendi ana kapsamında özel hücre popülasyonlarının analiz etmek gerekir. Lazer-aracılı mikrodiseksiyon moleküler bütünlüğünü korurken ilgi hücreleri doğrudan mikroskobik görüntü altında açık kimliği ve başarılı bir hasat sağlayarak, bu hedefe ulaşabilirsiniz. Biz, büyüme kontrolü, hücre farklılaşması ve organogenez çalışma için avantajlı bir model sistemi temsil eden gelişmekte olan Drosophila kanat disk, tanımlı alanlar içinde gen ekspresyonu analiz etmek için bu teknolojiyi uyguladık. Larvaların hayali diskler precociously soy kısıtlama sınırları anterior ve posterior, dorsal ve ventral bölmelere ayrılmıştır. Indüklenebilir GAL4 UAS ikili ifade sistemi, bu bölmelerin her biri özel olarak inşa GAL4 uygun sürücünün kontrolü altında bir UAS-GFP transgen ifade transgenik sinekler etiketli olabilir kullanılması. Transgenik diskler, ayrık altkümelerini hücreleri gen ekspresyon profili tam olarak, lazer kesim kılavuzu floresan GFP sinyali kullanılarak, lazer aracılı mikrodiseksiyon sonra tespit edilebilir. Çeşitli aşağı uygulamaları arasında, lokalize RNA enterferans (RNAi) sonra RNA transkript profil üzerinde duruldu. GFP etiketleme, RNAi teknolojisi gelişiyle birlikte, belirli bir gen susturulması için ayrı bir hücre popülasyonu transkripsiyonel yanıt tespitine izin verilen bir genin lokalize demonte ile birleştiğinde olabilir. Bu yaklaşımı doğrulamak için, diskin posterior (GFP ifade etiketli) eşdeğer alanlar diseke ve bir başka yerde eksprese gen P bölmesi bölgesel susturulması üzerine anterior (etiketsiz) bölmesi. RNA microdissected susturulması ve unsilenced alanları ve kantitatif gerçek zamanlı RT-PCR tarafından belirlenen karşılaştırmalı gen ekspresyon profili çıkarılmıştır. Biz bu yöntem etkili Drosophila hayali diskler içinde hücreler altkümelerini doğru transkriptomik için uygulanabilir olduğunu göstermektedir. RNA kaynağı olarak büyük disk hazırlığı genellikle hücre homojenlik varsayar Nitekim, iyi transkripsiyonel ifade pozisyon bilgisi sonucunda bu yapıların içinde büyük ölçüde değişebilir bilinir. Lazer kesim kılavuzu lokalize floresan GFP sinyalini kullanarak, daha doğru transkripsiyonel analizleri yapılır ve kârlı onların yerli kapsamında farklı hücre soylarının transkript profil de dahil olmak üzere farklı uygulamaları, uygulanabilir.

Lazer mikrodiseksiyon Drosophila kanat diskin belirli bölümlerinde lokalize RNAi tabi gen ekspresyonu analiz etmek için uygulanan<em&gt; In vivo</em&gt;. RNA susturulması ve unsilenced bölmeleri eşdeğer alanlarında çıkarılan doğal dokuya microecology bağlamında karşılaştırmalı gen ekspresyon profili belirlemek için kantitatif RT-PCR ile analiz edildi.

Lazer Diseksiyon hücreleri Altküme Kaynak gösterilmeden Uygulanan Drosophila Kanat Disk

Dokuların heterojen doğasının, biyolojik örneklerden elde edilebilecek bilgi miktarında sınırlayıcı bir faktör olduğu kanıtlanmıştır, ...

Burada, drosophila kanat diskindeki susturulmuş ve susturulmamış bölgelerin karşılaştırmalı RNA transkript profillemesini gerçekleştirmek için uygulanan lazer mikrodisseksiyonun ayrıntılı bir açıklamasını sunmaktayız. Bu yaklaşım, biyolojik materyal olarak manuel olarak diseke edilmiş drosophila imaj diskleri, ana ekipman olarak ise bir lazer mikrodissektör gerektirmektedir. LI A-L-L-M-D 6, 000 ve bir gerçek zamanlı PCR cihazı kullanmaktayız.BioRad iq kullandık. Gereken beş küçük araç şunlardır: konkav lam, küçük bir boya fırçası, mikrodiseksiyon penseti, asılı damla lam, şırınga iğnelerine monte edilmiş böcek pensleri, PET membranlı metal çerçeve ve küçük plastik tüpler. Bu yöntem aşağıdaki adımları içerir.GAL dört UAS sistemini kullanarak progenyda lokalize ve spesifik bir gen susturmayı tetiklemek amacıyla, uygun iki oph transgenik hattını çaprazlamanın birinci adımı. İkinci adım, disseksiyon çerçevelerinin hazırlanması. Üçüncü adım, lazer mikro dissektörün kurulması.Dördüncü adım, genetik çaprazlama sonucu elde edilen larval soyundan kanat imaginal disklerini manuel olarak toplamaktır. Beşinci adım, GFP ile işaretlenmiş imaginal disklerin belirli alanlarına lazer mikrodissectio

laser-microdissection-applied-to-gene-expression-profiling-subset

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video makalede izole etmek için bir yöntem mevcut tek veya birden...

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon Drosophila Periferik Nöronlar

Drosophila'nın yetişkin yapıları, hayali diskler adı verilen kese benzeri yapılardan türetilmiştir. Bu disklerin analizi, doku tayini, kompartman sınırı oluşturma, hücre proliferasyonu, hücre kaderi spesifikasyonu ve düzlemsel hücre polaritesi dahil olmak üzere birçok gelişimsel süreç hakkında bilgi sağlar. Bu protokol, ışık/floresan mikroskobu için hayali diskleri hazırlamak için kullanılır.

Diseksiyon ve hayali Disklerin immün itibaren Drosophila melanogaster

Burada, transkripsiyonel profilleme için belirli bitki hücre tiplerinin lazer destekli mikrodiseksiyonu için bir protokol sunuyoruz. Protokol farklı türler ve hücre tipleri için uygun olsa da, odak noktası, turpgil cinsi Boechera'da eşeyli ve apomiktik üreme için önemli olan dişi germ hattının son derece erişilemez hücreleridir.

Bireysel Hücre Tiplerinin transkripsiyonel Profiling için bir alet olarak lazer destekli mikrodiseksiyon (LAM)

Bu protokol Drosophila göz / antennal hayali diskleri (EAD) floresan işaretli, genetik olarak tanımlanmış klonal tümörleri oluşturmak için nasıl gösterir. Üçüncü evre larvaları ve nasıl görselleştirmek ve gen ifadesi değişikliklerini ve tümör yayılmasını ölçmek için bunları işlemek için EAD ve beyin teşrih açıklamaktadır.

<em&gt; Drosophila</em&gt; Hayali Disk Tümör Modeli: Genetik Mozaikler kullanma Gen İfade ve Tümör invazivliğinin Görselleştirme ve

Gelişimsel olarak önemli birçok genin hücre veya dokuya özgü ekspresyon paternleri vardır. Bu makale, mısır yaprağı bıçak-kılıf sınırında ve lg1-R mutantlarında vahşi tipe kıyasla farklı şekilde ifade edilen genleri tanımlamak için LM RNA-seq deneylerini açıklamaktadır. Burada tartışılan deneysel düşünceler, diğer gelişimsel fenomenlerin transkriptomik analizleri için geçerlidir.

Lazer Diseksiyon RNA Sek için Deneysel Tasarım: Mısır Yaprak Kalkınma bir Analiz Dersler

Doğru bir şekilde transkript veya proteinler Drosophila dokularda algılama yeteneğini kendi bereket ve yerelleştirme için geliştirme süreci ile ilgili eğitim için önemlidir. Pupa kanatları incelemek için basit bir yordam açıklaması burada. Bu kanatlar örnekleri çeşitli teknikler (immünhistokimya, PCR tahlil, vb) olarak kullanılabilir.

Drosophila Immunodetections veya PCR deneyleri için uygun pupa Wings incelemek için hızlı ve etkili bir yöntem

Bu protokol, fare embriyosu taze dondurulmuş bölümlerinden kıkırdak ve kemik izolasyonu için lazer yakalama mikrodizeksiyon açıklar. Kıkırdak ve kemik hızla cresyl menekşe boyama ile görselleştirilmiş ve transkripsiyonanalizi için yüksek kaliteli RNA verim hassas toplanabilir.

Gen Ekspresyonu Analizi için Fare Embriyonik Kıkırdağı ve Kemiğinin Lazer Yakalama Mikrodizmesi

Ligandlara maruz kalmanın zamanlaması gelişimsel sonuçlarını etkileyebilir. Burada kanat diskhücrelerinden Dpp adı verilen Drosophila kemik morfogenetik proteininin (BMP) nasıl görüntülenebildiğini gösteriyoruz.

Drosophila Wing Disc'ten Görüntüleme Dpp Salınımı

RNA dizilimi için bireysel nematod dokularını izole etmek için lazer mikrodiseksiyonu kullanan bir protokol tanımlanmıştır. Protokol, türe özgü genetik araç setleri gerektirmez ve gen ekspresyon profillerinin tek doku örnekleri düzeyinde farklı türler arasında karşılaştırılmasına izin verir.

Türlerden Agnostik Tek Doku Uygulamaları için Lazer Mikrodiseksiyonu

Canlı Drosophila kanadı hayali disklerindeki bitişik epitel tabakalarındaki hücreler arasındaki temasları GFP sulandırma tabanlı bir yaklaşım kullanarak ölçmek için bir protokol açıklıyoruz.

Canlı Drosophila Wing Hayalinal Disklerde Sitonemlerin Aracılık Ettiği Hücre-Hücre Temasını Değerlendirmek için GFP Tamamlama Tabanlı Çift İfade Sistemi

Bu makale, reaktiflerle ekonomik olan ve az sayıda hayali disklerin işlenmesini kolaylaştıran verimli bir imaginal disk diseksiyon ve antikor boyama protokolünü tanımlar.

Drosophila melanogaster'den Göz-Antenli ve Kanat Hayali Disklerinin Küçük Ölçekli Diseksiyonu ve Antikor Boyama

Öğrenin lazer mikrodiseksiyon yöntemiyle Drosophila kanat disklerinde gen ifadesi profillemesini. Bu teknik, susturulmuş ve susturulmamış bölgeleri karşılaştırarak doku mikroekolojisindeki gen düzenlemesini araştırır.

Lazer Diseksiyon hücreleri Altküme Kaynak gösterilmeden Uygulanan Drosophila Kanat Disk

Daha fazla video keşfet