Name: Canlı Drosophila Wing Hayalinal Disklerde Sitonemlerin Aracılık Ettiği Hücre-Hücre Temasını Değerlendirmek için GFP Tamamlama Tabanlı Çift İfade Sistemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-22T12:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Keşfedin canlı Drosophila kanat hayalinal disklerinde sitonemlerin aracılık ettiği hücre-hücre temaslarını GFP tamamlama yöntemiyle görüntüleme tekniğini. Bu yöntem doku büyümesi düzenlemesinde hücre iletişimini anlamak için araştırmacılara güçlü bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nubbin-GAL4 sürücüsü, CD4-spGFP1-10'u özellikle DP'nin kanat kese bölgesinde eksprese etmek için kullanılır (Şekil 1A). PerM-LexA sürücüsü21, CD4-spGFP11'i özellikle PerM'de ifade etmek için kullanılır (Şekil 1A). Bu iki ekspresyon sistemi birbirinden bağımsızdır ve DP ve PerM'de farklı transgenlerin aynı anda ve spesifik ekspresyonuna izin verir (Şekil 1B,C).
Temel genetik şema, nub-GAL4 / UAS-CD4-spGFP1-10 genotipinin larvalarını üretmek için sinekleri çaprazlamayı içerir; PerM-LexA/LexAop-CD4-spGFP11. Negatif bir kontrol olarak, LexAop-CD4-spGFP11 transgenini dışarıda bırakıyoruz. Diğer transgenler (örneğin, protein kodlayan, çift sarmallı RNA), DP katmanında ( UAS dizilerinin kontrolü altında) veya PerM'de ( LexA operatörünün kontrolü altında) istenildiği gibi ifade edilebilir.
Bu, kesintiye uğratılamayan canlı bir görüntüleme protokolüdür. Malzeme hazırlığı ~ 10 dakika olarak tahmin edilmektedir. Görüntülemeden önce bir seferde 20 dakikadan fazla diseksiyon yapılmamalıdır. Görüntüleme ~ 30 dakika sürer ve ~ 1 saatten fazla sürmemelidir. Birden fazla koşul veya çok sayıda numune için, en iyi sonuçları elde etmek için prosedür birden fazla turda gerçekleştirilmelidir.
1. Malzeme hazırlama
<ol>
	<li>Diseksiyondan önce, cımbızları, 9 oyuklu bir cam çöküntü spot plakasını (veya larvaları toplamak ve temizlemek için uygun başka bir kap) ve p etanol ile diseksiyon için kullanılan yeniden kullanılabilir Sylgard (silikon) kaplı bir Petri kabını temizleyin.</li>
	<li>p etanol yıkama yaparak ve ardından kurutulmuş slayta bir görüntüleme ara parçası yapıştırarak mikroskop slaytları hazırlayın. 8 oyuklu şeritten tek tek kuyucukları makasla kesin ve ikiye bölün (Şekil 2A). Koruyucu desteği her iki yarının bir tarafından çıkarın ve ortada disklerin yerleştirileceği korunaklı bir alan oluşturmak için hafifçe aralıklı olarak sürgüye ara parçalar yapıştırın (Şekil 2B). NOT: Deneyimlerimize göre, slayta aktarılan ortamın kesin hacmi daha az kritik olduğundan, bu, numune montajını basitleştirir. Herhangi bir küçük fazla hacim, kayma sırasında boşluktan kolayca dışarı akacaktır. Sadece nispeten kısa bir süre (genellikle ~ 1 saat) görüntülediğimiz için, orta kurutma ile ilgili herhangi bir sorun yaşamadık.</li>
	<li>Canlı görüntüleme ortamını (donmuş 10 mL alikotlarda saklanan takviyesiz Schneider'in Drosophila Medium'u) çözün ve bir buz kovasında kolayca erişilebilir durumda tutun.</li>
	<li>2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde, 1.5 mL ortamı 20 μL 200 μg / mL Hoechst 33342 (nihai konsantrasyon 2.7 μg / mL) ile karıştırın. Tüpü buz üzerinde tutun. NOT: Hoechst boyasının bu özel formu, yüksek oranda zar geçirgen olduğu için kullanılır. DİKKAT: Hoechst 33342 ile çalışırken eldiven kullanılmalıdır. Aletler kullanıldıktan sonra yıkanmalıdır.</li>
</ol>
2. Kanat diski diseksiyonu ve slayt hazırlama
<ol>
	<li>Genetik çaprazlama ve 25 ° C'de yetiştirmeyi takiben, tüpten dolaşan üçüncü instar larvaları toplayın ve bunları 9 oyuklu bir cam çöküntü spot plakasında soğuk canlı görüntüleme ortamında yıkayın. NOT: Sitonemler çok kırılgandır. İlerleyen adımlarda, diskler ve diseksiyon araçları arasında doğrudan temastan kaçınmaya çalışarak, disklerin etrafındaki dokuları manipüle etmeye özen gösterilmelidir. Bir seferde üç veya dört larva hazırlıyoruz, çünkü birkaç diske zarar vermek kaçınılmazdır ve bu sadece görüntüleme adımları sırasında fark edilebilir hale gelebilir.</li>
	<li>Diseksiyon mikroskobu altında, larvaları silikon kaplı bir Petri kabı üzerinde bir damla canlı görüntüleme ortamına aktarın ve iki diseksiyon forseps kullanarak diseksiyona başlayın. Bunu yapmak için, önce larvaları bir çift forseps ile vücut uzunluğunun yaklaşık üçte biri kadar (önden) sıkıştırarak baş ve ön vücut kısmını sabit tutun. İkinci forseps çiftini kullanarak, vücudu ilk forsepsin hemen arkasına sıkıştırın. Ardından, ön "yarıyı" izole etmek için larvaların arka kısmını çekin.</li>
	<li>Hayali diskler, trakea, tükürük bezleri, yağ gövdesi ve bağırsak dahil olmak üzere iç yapıları ortaya çıkarmak için kesilen ucun her iki yanında bir cımbızla sabitleyerek ve diğer çiftle başı iterek (bir çorabı ters çevirmek gibi) ön yarıyı ters çevirin.</li>
	<li>Tükürük bezlerini, yağ gövdesini ve bağırsakları dikkatlice çıkarın, trakeanın yan gövdelerini rahatsız etmemeye dikkat edin, bu da kanat disklerinin üzerine örtülmeli ve korunmalıdır.</li>
	<li>Bağlı kanat diskleri ile temizlenmiş ön yarımları, hazırlanmış bir slayt üzerindeki ara parçalar arasına yerleştirilmiş Hoechst ile bir damla temiz canlı görüntüleme ortamına dikkatlice aktarmak için forseps kullanın (Şekil 2C). Kanat disklerini, diseksiyon forsepslerinin bir bıçağını veya bir diseksiyon iğnesi tutucusuna bağlı ince bir tungsten tel kullanarak, diske bağlanan trakeanın ince dallarından nazikçe künt diseksiyon yaparak dokuların geri kalanından izole edin. Karkasın geri kalanını atın.</li>
	<li>Diseksiyon forsepslerinin bir bıçağını veya tungsten tel diseksiyon iğnesini kullanarak diskleri yönlendirin. Düzleştirilmiş gözyaşı damlası benzeri şekilleri nedeniyle, kanat diskleri DP veya PerM yukarı bakacak şekilde düşecektir. Bu protokol için, tüm diskleri PerM tarafı yukarı bakacak şekilde yönlendirin.</li>
	<li>Ortamı gerektiği gibi ekleyerek veya çıkararak, orta hacmi kuyuyu tamamen dolduracak şekilde, görüntüleme ara parçasının seviyesinin biraz üzerine ayarlayın. Her bir görüntüleme ara parçasının yarısının üst tarafından koruyucu desteği çıkarın ve ardından numunenin üzerine dikkatlice bir lamel indirin. Lamelin ara parçaya yapıştığından emin olmak için lamellerin görüntüleme ara parçalarına temas ettiği yere (örn. diseksiyon forsepslerinin yuvarlatılmış ucu ile) hafifçe bastırın. NOT: Orta seviye, hava kabarcıklarının sıkışmasını önlemek için ara parça yüksekliğinin biraz üzerinde olmalı, ancak lamel indirildiğinde önemli bir akış oluşturacak kadar yüksek olmamalıdır.</li>
</ol>
3. Görüntüleme
<ol>
	<li>40x/1.30 NA yağa daldırma lensi ve mikroskopi yazılımı ile donatılmış konfokal mikroskop (GFP için 488 nm dalga boyuna sahip argon iyon lazer, Hoechst için 350 nm dalga boyuna sahip UV lazer) kullanarak oda sıcaklığında görüntü örnekleri. PerM'nin en yüksek seviyesinin hemen üstünden (Hoechst floresansının azaldığı yer) DP'nin bazal tarafına kadar uzanan ve genellikle yığın başına 100'den fazla görüntüye ulaşan 1 μm adım boyutuna sahip görüntü yığınları elde edin. Zaman atlamalı filmler oluşturmak için tekrarlanan görüntü yığınları elde edin. NOT: ~ 1-2 saatten fazla olmayan bir slayt görüntülüyoruz.</li>
	<li>Mikroskop yazılım ayarları için, 8 bit kodlama, 2 satır ortalaması, genellikle 650 ile 750 arasında dedektör kazancı ve sinyal sızıntısını azaltmak için ayrılmış kanal izleri kullanarak görüntüler elde edin. Tüm koşullar için, her koşul üzerinde önceden testler yapılarak önceden belirlenmiş aynı lazer ve dedektör ayarlarını kullanın. NOT: 40x büyütmede, görüntülerimiz μm başına 5.0386 piksel çözünürlüğe sahiptir (piksel boyutu: 0.1985 x 0.1985 μm2). Kurulumumuzda, optimum konfokal mikroskop ayarları, mümkün olduğunca fazla sinyal yakalamak için mümkün olan en yüksek lazer yoğunluğunu (dokuya zarar vermeden) içerirken, aynı zamanda çok az doygunluk sağladı veya hiç doygunluk vermedi; ve negatif kontrollerde değerlendirildiği gibi mümkün olan en düşük gürültü, dedektör ofsetinin ve alım hızının (gerekirse) azaltılmasıyla elde edilir. Genellikle %5'ten daha az lazer gücü ve maksimum tarama kafası hızı (Zen yazılım ayarlarında '9') kullanırız. Tek bir görüntü yığınının elde edilmesi genellikle ~ 1 dakika 45 saniye sürer ve zaman atlamalı analizler için her 2-3 dakikada bir görüntüler alınır.</li>
</ol>
4. Görüntü analizi
<ol>
	<li>ImageJ yazılım paketinin maksimum yoğunluk projeksiyon işlevini kullanarak proje yığınları ( resmin üzerine tıklayın | Yığınlar | Z projesi, menüden Maksimum yoğunluk'u seçin).</li>
	<li>MIP görüntülerinde, Çokgen Seçimi'ni kullanarak kanat diski katlama modeline göre (Hoechst kanalını kullanarak) kanat torbası alanını belirleyin. Clear Outside Function (Dıştan Temizle) fonksiyonu ile GFP kanalında aynı seçimi kullanın ( Düzenle | Dışını temizle) her dış piksel değerini 0 olarak ayarlamak için.</li>
	<li>MIP görüntülerinde, GFP görüntülerini temizlemek için Hoechst kanalını kullanın, özellikle ilgili piksel değerini 0 olarak ayarlayarak her iki kanalda görünen artefakt noktaları kaldırın ( Çokgen Seçimi'ne tıklayın, ardından Düzenle | temizle'ye tıklayın).</li>
	<li>Temizlenen MIP görüntülerinde Histogram işlevini kullanın ( Analiz Et | Histogram | Liste) tüm piksel değerlerinin listesini almak ve bir elektronik tablodaki bir tabloya kopyalamak için.</li>
	<li>Negatif kontrollerde arka plan sinyalinin analizine dayalı olarak bir eşik değeri ayarlayın (ve ardından diğer örneklerde doğrulandı; tartışmaya bakın).</li>
	<li>Aşağıdaki formülü kullanarak GFP-pozitif yüzey yüzdesini hesaplayın: %GFP-pozitif yüzey = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68411/68411eq01.jpg" style="margin: auto;"> × 100</li>
	<li>Her bir değeri referans koşulunun ortalamasına (1 olarak ayarlanmış) bölerek sondaki verileri normalleştirin. NOT: Geçerli piksel = değeri 1 olan piksel≥ değeri 0 olarak ayarlanmış silinmiş pikselleri etkin bir şekilde yok sayar. 0 piksel değerleri doğal olarak oluşmaz.</li>
	<li>Sulandırılmış GFP sinyalinin disklerin neresinde lokalize olduğunu belirlemek için, disk epitelinin apikobazal eksenine bakmak için görüntü yığınlarının XZ-yeniden dilimlerini kullanın. Fiji'de enterpolasyon olmadan yeniden dilimlemeleri gerçekleştirin ve görünürlüğü artırmak için çift doğrusal enterpolasyonlu Ölçek işlevini kullanarak Z eksenindeki görüntü yüksekliğini artırın.</li>
</ol>

<ol><li>Ng, J. K., Tamura, K., Buscher, D., Izpisua-Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+basis+of+pattern+formation+during+vertebrate+limb+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular basis of pattern formation during vertebrate limb development.</a> Curr Top Dev Biol. 41, 37-66 (1999).</li>
<li>Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytonemes+and+the+dispersion+of+morphogens%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytonemes and the dispersion of morphogens.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 3 (6), 445-463 (2014).</li>
<li>Daly, C. A., Hall, E. T., Ogden, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+mechanisms+of+cytoneme-based+morphogen+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulatory mechanisms of cytoneme-based morphogen transport.</a> Cell Mol Life Sci. 79 (2), 119(2022).</li>
<li>Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytonemes%3A+cellular+processes+that+project+to+the+principal+signaling+center+in+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytonemes: cellular processes that project to the principal signaling center in Drosophila imaginal discs.</a> Cell. 97 (5), 599-607 (1999).</li>
<li>Hall, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoneme+delivery+of+Sonic+Hedgehog+from+ligand-producing+cells+requires+Myosin+10+and+a+Dispatched-BOC%2FCDON+co-receptor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Cytoneme delivery of Sonic Hedgehog from ligand-producing cells requires Myosin 10 and a Dispatched-BOC/CDON co-receptor complex.</a> Elife. 10, e61432(2021).</li>
<li>Sanders, T. A., Llagostera, E., Barna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+filopodia+direct+long-range+transport+of+SHH+during+vertebrate+tissue+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specialized filopodia direct long-range transport of SHH during vertebrate tissue patterning.</a> Nature. 497 (7451), 628-632 (2013).</li>
<li>Stanganello, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodia-based+Wnt+transport+during+vertebrate+tissue+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Filopodia-based Wnt transport during vertebrate tissue patterning.</a> Nat Commun. 6, 5846(2015).</li>
<li>Hall, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoneme+signaling+provides+essential+contributions+to+mammalian+tissue+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytoneme signaling provides essential contributions to mammalian tissue patterning.</a> Cell. 187 (2), 276-293.e23 (2024).</li>
<li>Zhang, C., Brunt, L., Ono, Y., Rogers, S., Scholpp, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoneme-mediated+transport+of+active+Wnt5b-Ror2+complexes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cytoneme-mediated transport of active Wnt5b-Ror2 complexes in zebrafish.</a> Nature. 625 (7993), 126-133 (2024).</li>
<li>Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+signaling+at+cytoneme+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Glutamate signaling at cytoneme synapses.</a> Science. 363 (6430), 948-955 (2019).</li>
<li>Wood, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytonemes+with+complex+geometries+and+composition+extend+into+invaginations+of+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytonemes with complex geometries and composition extend into invaginations of target cells.</a> J Cell Biol. 220 (5), e202101116(2021).</li>
<li>Gonzalez-Mendez, L., Seijo-Barandiaran, I., Guerrero, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoneme-mediated+cell-cell+contacts+for+Hedgehog+reception%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Cytoneme-mediated cell-cell contacts for Hedgehog reception.</a> Elife. 6, e24045(2017).</li>
<li>Du, L., Sohr, A., Li, Y., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPI-anchored+FGF+directs+cytoneme-mediated+bidirectional+contacts+to+regulate+its+tissue-specific+dispersion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">GPI-anchored FGF directs cytoneme-mediated bidirectional contacts to regulate its tissue-specific dispersion.</a> Nat Commun. 13 (1), 3482(2022).</li>
<li>Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoneme-mediated+contact-dependent+transport+of+the+Drosophila+decapentaplegic+signaling+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein.</a> Science. 343 (6173), 1244624(2014).</li>
<li>Feinberg, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP+Reconstitution+Across+Synaptic+Partners+%28GRASP%29+defines+cell+contacts+and+synapses+in+living+nervous+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) defines cell contacts and synapses in living nervous systems.</a> Neuron. 57 (3), 353-363 (2008).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competitive+coordination+of+the+dual+roles+of+the+Hedgehog+co-receptor+in+homophilic+adhesion+and+signal+reception%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Competitive coordination of the dual roles of the Hedgehog co-receptor in homophilic adhesion and signal reception.</a> Elife. 10, e65770(2021).</li>
<li>Patel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytonemes+coordinate+asymmetric+signaling+and+organization+in+the+Drosophila+muscle+progenitor+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cytonemes coordinate asymmetric signaling and organization in the Drosophila muscle progenitor niche.</a> Nat Commun. 13 (1), 1185(2022).</li>
<li>Chen, W., Huang, H., Hatori, R., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+basal+cytonemes+take+up+Hedgehog+in+the+Drosophila+wing+imaginal+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Essential basal cytonemes take up Hedgehog in the Drosophila wing imaginal disc.</a> Development. 144 (17), 3134-3144 (2017).</li>
<li>Huang, H., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myoblast+cytonemes+mediate+Wg+signaling+from+the+wing+imaginal+disc+and+Delta-Notch+signaling+to+the+air+sac+primordium%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Myoblast cytonemes mediate Wg signaling from the wing imaginal disc and Delta-Notch signaling to the air sac primordium.</a> Elife. 4, e06114(2015).</li>
<li>Hatori, R., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+produced+by+the+Drosophila+wing+imaginal+disc+induces+distinct+responses+in+three+target+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog produced by the Drosophila wing imaginal disc induces distinct responses in three target tissues.</a> Development. 147 (22), dev195974(2020).</li>
<li>Rambaud, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slik+sculpts+the+plasma+membrane+into+cytonemes+to+control+cell-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Slik sculpts the plasma membrane into cytonemes to control cell-cell communication.</a> EMBO J. 44 (8), 2186-2210 (2025).</li>
<li>Gibson, M. C., Schubiger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripodial+cells+regulate+proliferation+and+patterning+of+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Peripodial cells regulate proliferation and patterning of Drosophila imaginal discs.</a> Cell. 103 (2), 343-350 (2000).</li>
<li>Gibson, M. C., Lehman, D. A., Schubiger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumenal+transmission+of+decapentaplegic+in+Drosophila+imaginal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Lumenal transmission of decapentaplegic in Drosophila imaginal discs.</a> Dev Cell. 3 (3), 451-460 (2002).</li>
<li>Pallavi, S. K., Shashidhara, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egfr%2FRas+pathway+mediates+interactions+between+peripodial+and+disc+proper+cells+in+Drosophila+wing+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Egfr/Ras pathway mediates interactions between peripodial and disc proper cells in Drosophila wing discs.</a> Development. 130 (20), 4931-4941 (2003).</li>
<li>Pallavi, S. K., Shashidhara, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+interactions+between+squamous+and+columnar+epithelia+of+the+Drosophila+wing+disc%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Signaling interactions between squamous and columnar epithelia of the Drosophila wing disc.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 15), 3363-3370 (2005).</li>
<li>Pedelacq, J. D., Cabantous, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+superfolder+and+split+fluorescent+protein+detection+systems+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Development and applications of superfolder and split fluorescent protein detection systems in biology.</a> Int J Mol Sci. 20 (14), 3479(2019).</li>
<li>Panneton, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+catalytic+and+non-catalytic+functions+of+the+Drosophila+Ste20+kinase+Slik+by+activation+segment+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of catalytic and non-catalytic functions of the Drosophila Ste20 kinase Slik by activation segment phosphorylation.</a> J Biol Chem. 290 (34), 20960-20971 (2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Discovery V12 diseksiyon mikroskobu</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Diseksiyon Mikroskobu</td></tr><tr><td>Dumont #55 forseps, Biyoloji ipuçları</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11255-20</td><td>diseksiyon forsepsleri</td></tr><tr><td>EP-Slik (slik20358)</td><td>BDSC Hakkında</td><td>Panneton ve ark. 2015&nbsp;</td><td>Slik'i ifade etmek için sinek suşu</td></tr><tr><td>FİJİ</td><td></td><td>Schindelin J. ve ark. (2012)&nbsp;</td><td>Görüntü Analiz Yazılımı</td></tr><tr><td>Hoechst 33342&nbsp;</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>H3570&nbsp;</td><td>canlı görüntüleme nükleer leke&nbsp;</td></tr><tr><td>LexAop-CD4-spGFP11&nbsp; </td><td>BDSC Hakkında</td><td>93018</td><td>sinek gerginliği</td></tr><tr><td>LSM 700 konfokal mikroskop&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Konfokal mikroskop</td></tr><tr><td>nub-GAL4</td><td>Bloomington Drosophila Stok Merkezi (BDSC)</td><td>86108</td><td>sinek gerginliği</td></tr><tr><td>PerM-LexA</td><td></td><td>Rambaud, Joseph ve diğerleri, 2025</td><td>sinek gerginliği</td></tr><tr><td>PYREX 9-çöküntü cam spot plaka satışı</td><td>Corning Yaşam Bilimleri</td><td>7220-85</td><td>larvaları toplamak ve yıkamak için</td></tr><tr><td>Schneider'in Drosophila Ortamı</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>21720024</td><td>Canlı görüntüleme ortamı</td></tr><tr><td>SecureSeal görüntüleme aralıkları, 8-kuyu, 0.12 mm kalın&nbsp;</td><td>Grace Biyo-Laboratuvarları</td><td>654008</td><td>Spacer</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 silikon elastomer kiti</td><td>Sylgard</td><td>3097358-1004</td><td>diseksiyon plakaları yapmak için</td></tr><tr><td>UAS-CD4-spGFP1-10&nbsp; </td><td>BDSC Hakkında</td><td>93017</td><td>sinek gerginliği</td></tr><tr><td>Zen Siyahı</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Edinme yazılımı</td></tr></tbody></table>

canlı drosophila wing hayalinal disklerde sitonemlerin aracılık ettiği hücre-hücre temasını değerlendirmek için gfp tamamlama tabanlı Çift İfade sistemi

A GFP Complementation-based Dual-expression System for Assessing Cell-Cell Contact Mediated by Cytonemes in Live Drosophila Wing Imaginal Discs

DP ve PerM hücreleri arasındaki temasları ölçmek için GRASP prosedürünün kullanışlılığını test etmek için, dört farklı genotipin kanat disklerini inceledik: GFP kanalında yalnızca arka plan otofloresan seviyelerini gösterecek olan vahşi tip negatif kontrol diskleri (genotip: w1118); DP katmanında CD4-spGFP1-10'u eksprese eden, ancak tek başına GFP1-10 tarafından üretilen floresan seviyesini gösterecek olan CD4-spGFP11 transgeninden yoksun diskler (GFP1-10'un floresan26 olmaması...

Canlı Drosophila Wing Hayalinal Disklerde Sitonemlerin Aracılık Ettiği Hücre-Hücre Temasını Değerlendirmek için GFP Tamamlama Tabanlı Çift İfade Sistemi

Embryonic tissue growth and patterning are largely controlled by signals exchanged locally between cell populations within the tissues themselves. ...

a-gfp-complementation-based-dual-expression-system-for-assessing-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Burada, glial hücreler göç GFP etiketli glial hücreler ile eşleştirilmiş canlı mikroskobik analizi ile gelişmekte olan Drosophila göz içine incelemek için bir protokol açıklar.

Drosophila Göz hayali Disk Glial Hücre Göç Canlı Görüntüleme

Drosophila hemocytes gelişmekte olan embriyonun bütünlüğü içinde dağılırlar . Bu protokol, floresan etiketli hemocytes embriyoları kullanılarak bu göçler montaj ve görüntü nasıl gösteriyor.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

SAC kardeş kromatidler arasında mitotik segregasyon izlenmesi, sinyali başlatır nerede kinetochore olduğunu. A metodunda kromozom hareketi ile kinetochore proteinler ve koordinasyon birinin seçilmesi ve devir görselleştirme tarif...

Living Görselleştirilmesi Dinamik Kinetochore Protein Davranış ve Kromozom Hareket tarafından Mitotik Checkpoint incelenmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Sinsityal Embriyolar

Bu video, glial hücrelerin tek hücreli görüntülenmesi için transgenik bir Drosophila beyninin immünofloresan boyamasını göstermektedir. Beyin, glial spesifik bir rekombinaz sisteminin kontrolü altında farklı antijenik epitop kombinasyonları ile kaynaşmış zar hedefli proteinleri eksprese eder. İzole ve sabit beyinler, antijenik epitoplara özgü primer antikorlarla boyanır, ardından florofor konjuge sekonder antikorlar gelir. Bu etiketleme, çeşitli beyin bölgelerinde farklı glial hücre alt...

Glial Hücrelerin Tek Hücreli Görüntülenmesi için Drosophila Beyinlerinin İmmünofloresan Boyaması

Bu protokol, dokunulmamış larva beyin bağlamında canlı hücre görüntüleme yapmak için kullanılan akıcı bir yöntem göstermektedir. Canlı hücre görüntüleme yaklaşımları sürekli daha önce gözardı mekanizmaları ortaya çıkarılması, asimetrik nöral kök hücre bölünmeleri çalışmanın yanı sıra diğer nörolojik ve gelişimsel süreçleri için paha biçilmezdir.

Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva nöroblastomun

Drosophila'nın yetişkin yapıları, hayali diskler adı verilen kese benzeri yapılardan türetilmiştir. Bu disklerin analizi, doku tayini, kompartman sınırı oluşturma, hücre proliferasyonu, hücre kaderi spesifikasyonu ve düzlemsel hücre polaritesi dahil olmak üzere birçok gelişimsel süreç hakkında bilgi sağlar. Bu protokol, ışık/floresan mikroskobu için hayali diskleri hazırlamak için kullanılır.

Diseksiyon ve hayali Disklerin immün itibaren Drosophila melanogaster

Bu protokol, canlı Drosophila pupa göz nöroepitelini görüntülemek için etkili bir yöntem sunar. Bu yöntem, doku hareketini ve düzensiz topolojiyi telafi eder, birden fazla GFP etiketli bağlantı proteininin kullanılması yoluyla hücre sınırlarının görselleştirilmesini geliştirir ve kolayca monte edilebilen bir görüntüleme teçhizatı kullanır.

Canlı-görüntüleme Drosophila Pupa Göz

Hücre türleri farklı morfoloji görüntülemek ve a değişiklik-in onların komşuları ile etkileşim kurmak. Bu iletişim kuralı tek hücre morfolojisi açıklamaya ve hücre-hücre etkileşim köklü Gal4/UAS ifade sistemi kullanılarak incelemek için açıklar.

Yüksek çözünürlüklü tek hücre türleri morfoloji ve Glia Drosophila içinde etkileşimlerin hücre çalışmaya uygulama çok renkli FlpOut tekniği

Ligandlara maruz kalmanın zamanlaması gelişimsel sonuçlarını etkileyebilir. Burada kanat diskhücrelerinden Dpp adı verilen Drosophila kemik morfogenetik proteininin (BMP) nasıl görüntülenebildiğini gösteriyoruz.

Drosophila Wing Disc'ten Görüntüleme Dpp Salınımı

Burada, Drosophila yumurtalık nişindeki germ hattı kök hücrelerinin (GSC'ler) asimetrik bölünmesinin canlı görüntülemesini gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Spektrozom proteini Par-1'in yeşil floresan proteini (GFP) füzyonunu her yerde ifade eden bir transgenik çizgi kullanıyoruz.

Kadın Drosophila melanogaster Germline Kök Hücre Nişlerinin Genişletilmiş Canlı Görüntülenmesi

Genişleme Destekli Yinelemeli Floresan In Situ Hibridizasyon (EASI-FISH), kalın dokuda birden fazla genin ekspresyonunu tespit etmek için genleşme mikroskobunu floresan in situ hibridizasyon (FISH) ile birleştiren sağlam bir tekniktir. Bu protokol, yöntemdeki son gelişmeleri ve bozulmamış Drosophila merkezi sinir sistemini etiketlemek için adaptasyonunu özetlemektedir.

Genişleme Destekli Yinelemeli Floresan In Situ Hibridizasyon Kullanılarak Sağlam Drosophila Beyindeki Gen Ekspresyonunun Multipleks Tespiti

Keşfedin canlı Drosophila kanat hayalinal disklerinde sitonemlerin aracılık ettiği hücre-hücre temaslarını GFP tamamlama yöntemiyle görüntüleme tekniğini. Bu yöntem doku büyümesi düzenlemesinde hücre iletişimini anlamak için araştırmacılara güçlü bir araç sunar.

Canlı Drosophila Wing Hayalinal Disklerde Sitonemlerin Aracılık Ettiği Hücre-Hücre Temasını Değerlendirmek için GFP Tamamlama Tabanlı Çift İfade Sistemi (Video) | JoVE Journal

Canlı Drosophila Wing Hayalinal Disklerde Sitonemlerin Aracılık Ettiği Hücre-Hücre Temasını Değerlendirmek için GFP Tamamlama Tabanlı Çift İfade Sistemi

Daha fazla video keşfet