Canlı Drosophila Wing Hayalinal Disklerde Sitonemlerin Aracılık Ettiği Hücre-Hücre Temasını Değerlendirmek için GFP Tamamlama Tabanlı Çift İfade Sistemi

Bu nedenle araştırmamız, dokularda uzakta bulunan hücrelerin birbirleriyle nasıl iletişim kurduğunu anlamaya odaklanıyor. Sitidinin nasıl oluştuğunu, nasıl çalıştıklarını ve doku büyümesini lokal olarak kontrol etmede nasıl bir rol oynadıklarını anlamaya çalışmak için Drosophila kanadı hayali diskini bir model sistem olarak kullanıyoruz. Çalışmalar, büyüme faktörlerinin genellikle hedef hücrelere iletilmek üzere sitonem adı verilen aktin bazlı sinyal filopodisi gibi özel hücresel projeksiyonlar yoluyla seyahat ettiğini göstermektedir.

Sitonemler fiksasyon protokolü ile kolayca bozulabilen çok ince ve kırılgan yapılardır. Bunları gözlemlemek için, eksprese edilmiş floresan etiketli protein ile özel canlı görüntüleme yaklaşımları kullanmanız gerekir. Bu, onları araştırmak için kullanabileceğimiz araç ve yaklaşımları büyük ölçüde sınırlar.

Sitonem biyogenezinde rol oynayan Slik adlı bir protein kinaz tanımladık. Kanat hayali diskindeki bir epidural tabakada Slik'in ekspresyonu, disk lümenini geçen sitonem oluşumunu tetikler ve komşu epitel tabakasındaki hücrelerin çoğalmasını uyarır. Gelecekte, sitonem oluşumunu teşvik etmek için Slik'in aşağı akışında hareket eden proteini tanımlamak, perforasyonu teşvik etmek için bu sitonem yoluyla iletilen ligandı tanımlamak ve bu mekanizmanın doku büyümesini kontrol etmedeki fizyolojik önemini daha iyi anlamak istiyoruz.

Başlamak için, makas kullanarak sekiz oyuklu şeritten tek tek kuyucuklar kesin ve ardından her bir kuyucuğu ikiye bölün. Her bir yarının bir tarafındaki koruyucu desteği çıkarın ve ara parçaları mikroskop lamına yapıştırın, disk yerleştirme için korunaklı bir merkezi alan oluşturmak için hafifçe aralıklı yapın. Genetik çaprazlama ve 25 santigrat derecede inkübasyonun ardından yetiştirme tüpünden dolaşan üçüncü dönem larvalarını seçin.

Bir diseksiyon mikroskobu altında, larvaları silikon kaplı bir Petri kabı üzerinde bir damla canlı görüntüleme ortamına aktarın. İki diseksiyon forseps kullanarak, larvaları sabit tutmak için bir çift forseps ile önden yaklaşık 1/3 vücut uzunluğunda sıkıştırarak diseksiyona başlayın. İkinci çift ile, gövdeyi ilk noktanın hemen arkasından sıkıştırın ve ön bölümü izole ederek arka yarıyı ayırmak için çekin.

Kesilen ucun her iki tarafını cımbızla kavrayarak ve ikinci bir çift kullanarak kafayı iterek ters çevirerek ön yarıyı ters çevirin. Bu, hayali diskler, soluk borusu, tükürük bezleri, şişman vücut ve bağırsak gibi iç yapıları açığa çıkarır. Kanat disklerinin üzerindeki lateral trakeal gövdeleri rahatsız etmemeye dikkat ederek tükürük bezlerini, yağ gövdesini ve bağırsağı forseps kullanarak çıkarın.

Forseps kullanarak, kanat diskleri takılı temizlenmiş ön yarıları, slayt ara parçaları arasına yerleştirilmiş kancalarla bir damla temiz canlı görüntüleme ortamına aktarın. Kanat disklerini izole etmek için, diseksiyon forsepslerinin bir bıçağı veya diseksiyon iğnesi tutucusuna monte edilmiş ince bir tungsten tel ile ince trakeal dallardan nazikçe ayırın. Kalan karkası atın.

Kanat disklerini, peripodial membran tarafı yukarı bakacak şekilde bir diseksiyon forseps bıçağı veya tungsten iğnesi kullanarak yönlendirin. Orta hacmi, ara parça seviyesinin üzerindeki kuyuyu hafifçe dolduracak şekilde ayarlayın. Görüntüleme ara parçasından üst koruyucu desteği çıkarın ve numunenin üzerine bir lamel hafifçe indirin.

Uygun yapışmayı sağlamak için forsepsin yuvarlatılmış ucunu kullanarak lamel ara parça temas noktalarında bastırın. Görüntü yığınlarını ImageJ'de yansıtmak için Görüntü'yü, ardından Yığınlar'ı ve ardından Z Projesi'ni seçin ve menüden Maksimum Yoğunluk'u seçin. Maksimum yoğunluktaki projeksiyon görüntülerinde, kanca kanalını ve çokgen seçim aracını kullanarak kanat diski katlama modeline göre kanat kesesi alanını tanımlayın.

Aynı seçimi GFP kanalına uygulayın ve seçilen bölgenin dışındaki gürültüyü ortadan kaldırmak için Düzenle'yi ve ardından Dışarıyı Temizle'yi seçin. GFP görüntülerindeki yapay noktaları belirlemek için maksimum yoğunluklu projeksiyon görüntülerindeki kanca kanalını kullanın. Ardından, çokgen seçim aracını kullanarak alanı seçin.

Düzenle'ye tıklayın ve Temizle'yi seçin. Temizlenen maksimum yoğunluklu projeksiyon görüntülerinde Analiz Et'i, ardından Histogram'ı seçin ve tüm piksel değerlerini elde etmek için Liste'yi seçin. Bu listeyi bir elektronik tablo tablosuna kopyalayın.

Bir eşik değeri ayarlamak için, negatif kontrol numunelerindeki arka plan sinyalini analiz edin ve diğer numune görüntülerini kullanarak bu değeri onaylayın. Eşiğin üzerindeki piksel sayısını toplam geçerli piksel sayısına bölerek ve sonucu 100 ile çarparak GFP pozitif yüzey yüzdesini hesaplayın. Son olarak, hesaplanan her değeri, bire ayarlanan referans koşulunun ortalamasına böldükten sonra normalleştirin.

Her iki bölünmüş GFP bileşeninden yoksun vahşi tip disklerde, kanat kesesinin merkezine yakın bir yerde yalnızca minimal granüler GFP otofloresansı gözlendi ve bu temel sinyal, bir floresan eşiği tanımlamak için kullanıldı. Diskin uygun katmanında yalnızca CD4 bölünmüş GFP1-10'u eksprese eden diskler, vahşi tipten ayırt edilemeyen floresan seviyeleri gösterdi ve bu da tek başına GFP1-10'un floresan olmayan doğasını doğruladı. CD4 bölünmüş GFP1-10'un diskte ve CD4spGFP11'in peripodial membranda birlikte ekspresyonu, disk lümeninde lokalize ayrık, parlak GFP noktalarında gözle görülür bir artışa yol açtı ve eşik değerin üzerinde kontrollere göre önemli ölçüde daha büyük bir floresan pozitif alan oluştu.

Diskteki Slik ekspresyonu, peripodial membran çekirdek yoğunluğunda güçlü bir artışa ve kanat kesesi bölgesi boyunca GFP sinyal yoğunluğunda dramatik bir artışa neden oldu, bu da Slik tarafından indüklenen sitonemlerin peripodial membran hücreleri ile gelişmiş temas kurduğunu düşündürdü.