Head-On RNA Polimeraz Stalled Çoğaltma Fork Doğrudan yeniden başlatın

Bir çarpışma replisome kaderi ile baş-RNA polimeraz (RNAP) bilinmiyor. Biz DNA RNAP yerinden sonra uzama replisome baş RNAP ile çarpışması üzerine tezgahları, ancak devam eder ki bulabilirsiniz. MFD çarpışmadan sonra RNAP yerinden kolaylaştırarak çoğaltma işlemini yeniden başlatın teşvik etmektedir.

Bu prosedürün genel amacı, kafa kafaya bir çarpışmayı takiben Repli bölgesinin ve RNA polimeraz veya RNAP'ın kaderini gözlemlemektir. Bu, önce transkripsiyon kompleksinin biyotinile DNA üzerinde birleştirilmesi ve Stripp tablet ve boncuklar üzerinde hareketsiz hale getirilmesiyle gerçekleştirilir, bu da RNAP uzama kompleksinin durmasına neden olur. Prosedürün ikinci adımı, kafa kafaya RNAP'ın aşağı akışında bir replikasyon çatalı oluşturmak için preen ön ihtiyaç çatallı DNA'yı RNAP uzama kompleksine bağlamaktır.

Prosedürün üçüncü adımı, repli bölgesini birleştirmek ve replikasyon çatalında önde gelen iplik sentezini başlatmaktır. Prosedürün son adımı, DNA'yı manyetik boncuklardan izole etmek ve DNA'yı bir PCR temizleme sütunu üzerinde saflaştırmaktır. Nihayetinde, saflaştırılmış radyo etiketli DNA ürünlerinin bir alkali agro jeli yoluyla kafa kafaya transkripsiyon kompleksi ile çarpıştığında roso'nun durduğunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, ben Rockefeller Üniversitesi'ndeki Mike O'Donnell Laboratuvarı'ndan Richard Pomerance. Bugün, katı fazda RNA polimeraz üzerinde bir kafa ile ribozomun çarpışmasının nasıl gerçekleştirileceğini prosedürünüze göstereceğim. Bu prosedürü laboratuvarımızda, replikasyon sürecinin DNA boyunca transkripsiyon komplekslerinden nasıl etkilendiğini incelemek için kullanıyorum.

Öyleyse başlayalım. Bu protokol karışımına başlamak için, 100 mikrolitre tampon a'da T yedi A bir promotör içeren biyotinile edilmiş 3.6 KB'lık bir DNA şablonuna sahip RNAP holo enzimi, karışımı 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe eder. 10 dakikalık inkübasyondan sonra, RNA sentezini 20 nükleotid ile sınırlayacak olan ribonükleotidler adenosin, tri fosfat, sitidin fosfat ve Aden alel üridin ekleyin.

Durdurulmuş RN maymun uzama kompleksini boncuklar üzerinde hareketsiz hale getirmek için çözeltiyi 37 santigrat derecede 10 dakika daha inkübe edin. Çözeltiyi streptavidin kaplı manyetik boncuklara ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Boncukları 0,9 mililitre yüksek tuz tamponu ile yıkayarak hareketsizleştirilmiş durdurulmuş RNAP uzama kompleksini saflaştırın. Her yıkamadan sonra spesifik olmayan R-N-A-P-D-N-A komplekslerini çıkarmak için, süpernatanı manyetik ayırma ile çıkarın. Bu yıkama beş kez tekrarlanmalıdır.

Daha sonra boncuklar 0.9 mililitre tampon A ile iki kez daha yıkanmalıdır.Son yıkamadan sonra, aşağı akış replikasyon çatalı, kafa üstü RNAP Resus'un aşağı akışında bir replikasyon çatalı oluşturmak üzere monte edilebilir, manyetik şeridi, 100 mikrolitre New England Biolabs tampon dörtte durdurulmuş RNAP uzama kompleksine bağlı belirgin boncuklara asılabilir. Daha sonra, 10 birim karides alkalin fosfataz veya SAP bir ekleyin ve numuneyi 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Boncukları 0.9 mililitre tampon A ile üç kez yıkayın. Daha sonra boncukları 50 mikrolitre hızlı T dört ligasyon reaksiyonu tamponunda yeniden süspanse edin.

İki mikrolitre hızlı T dört ligaz ekleyin ve çatallı DNA'ya ihtiyaç duyuldu, çözeltiyi oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Son olarak, boncukları 0.9 mililitre tampon A karışımı heksamer, manyetik strep A ile DNAB helikaz ve durdurulmuş RNAP uzama kompleksine ve aşağı akış replikasyon çatalına bağlı boncuklarla üç kez daha yıkayın. Çözeltiyi 150 mikrolitre tampon A'da hazırlayın ve 23 santigrat derecede 30 saniye inkübe edin.

23 santigrat derecede kısa 32. inkübasyonun ardından. Polimeraz üç beta klempinde, A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P alfa P 32 etiketli DGTP ve alfa P 32 etiketli DATP, 200 mikrolitre hacme kadar. Numuneyi 37 santigrat derecede beş dakika inkübe edin.

Tek sarmallı DNA bağlayıcı protein DCTP ve DTTP ekleyerek replikasyonu başlatın. Ayrıca, 250 mikrolitrelik bir son hacme DTTP ve DCTP etiketli alfa P 32 ekleyin. 10 dakika sonra, 12 mikrolitre 0.5 molar EDTA ekleyerek reaksiyonları sonlandırın.

Ardından, boncuklardan DNA'yı serbest bırakmak için strp din boncuklarını kaynatın. Boncukları 50 santigrat derecede 30 dakika boyunca proteinaz K ile muamele ederek kalan DNA'yı çıkarın. Boncukları tekrar kaynatın ve süpernatanı manyetik ayırma ile çıkarın.

Kyogen PCR temizleme kitini kullanarak DNA'yı içeren kombine süpernatanı saflaştırın. Son olarak, saflaştırılmış radyo etiketli DNA ürünlerini bir alkalin aros jel içinde analiz edin Bölgenin RNAP üzerindeki bir kafa ile çarpışması genellikle 2,5 KB ve 3,6 KB uzunluğunda iki ürünle sonuçlanır. 2,5 KB'lık ürün, çataldan durdurulan RNAP'a kadar olan DNA uzunluğunu temsil eder.

Bu, RNAP ile çarpışma üzerine yanıtın durmasından kaynaklanır. 3,6 KB'lık ürün, tam uzunlukta DNA'yı temsil eder ve promotörün RNAP tarafından eksik doluluğundan veya kafa kafaya RNAP'ın kısmi yanıt okumasından kaynaklanır. İyi bir sonuç, yaklaşık %50 oranında tam uzunlukta DNA üretildiğini göstermektedir.

Bununla birlikte, bazı durumlarda, promotörün RNAP tarafından daha az işgal edilmesi meydana gelir ve daha yüksek bir tam uzunlukta DNA yüzdesi gözlenir. Bunun nedeni, daha büyük bir repli bölgesi popülasyonunun, durdurulmuş bir RNAP'ın yokluğunda RNAP replikasyonunda bir kafa ile karşılaşmamasıdır, yalnızca tam uzunlukta DNA ile sonuçlanır, DNA'ya bağlı durdurulmuş bir RNA polimeraz uzama kompleksinin varlığında replikasyon ve katı fazın nasıl gerçekleştirileceğini size gösterdik. Bu prosedürü yaparken, DNA'ya spesifik olmayan bir şekilde bağlanan ve replikasyonu inhibe eden fazla RNA polimerazı uzaklaştırmak için durdurulmuş transkripsiyon kompleksini yüksek tuzla yıkamak önemlidir.

İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.