Head-On RNA Polimeraz Stalled Çoğaltma Fork Doğrudan yeniden başlatın

Bu prosedürün genel amacı, kafa kafaya çarpışma sonrası Repli bölgesinin ve RNA polimerazın veya RNAP'nin akıbetini gözlemlemektir. Bu, öncelikle biotinillenmiş DNA üzerinde transkripsiyon kompleksinin kurulması ve Stripp tablet ve boncuklar üzerine immobilize edilmesiyle gerçekleştirilir; bu işlem, durdurulmuş bir RNAP elongasyon kompleksi ile sonuçlanacaktır. Prosedürün ikinci adımı, kafa kafaya RNAP'nin aşağı akışında bir replikasyon çatalı oluşturmak için önceden hazırlanmış çatallı DNA'nın RNAP elongasyon kompleksine ligasyonudur.

Prosedürün üçüncü adımı, replikasyon bölgesini kurmak ve replikasyon çatalında öncü zincir sentezini başlatmaktır. Prosedürün son adımı, DNA'yı manyetik boncuklardan ayırmak ve bir PCR temizleme kolonunda DNA'yı saflaştırmaktır. Nihayetinde, saflaştırılmış radyoaktif olarak işaretlenmiş DNA ürünlerinin alkali agaroz jel elektroforezi aracılığıyla, roso'nun kafa kafaya transkripsiyon kompleksine çarpmasıyla duraksadığını gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, ben Rockefeller Üniversitesi'ndeki Mike O'Donnell Laboratuvarı'ndan Richard Pomerance. Bugün size, katı fazda ribozomun RNA polimeraz ile kafa kafaya çarpışmasının nasıl gerçekleştirileceğine dair prosedürü göstereceğim. DNA boyunca yer alan transkripsiyon komplekslerinin replikasyon sürecini nasıl etkilediğini incelemek için laboratuvarımızda bu prosedürü kullanıyorum.

Haydi başlayalım. Bu protokole başlamak için, T7 A1 promotörünü içeren biotinlenmiş 3,6 KB DNA kalıbını, 100 µL tampon A içerisinde RNAP holo enzim ile karıştırın ve karışımı 37 °C'de 10 dakika inkübe edin. 10 dakikalık inkübasyonun ardından, RNA sentezini 20 nükleotide sınırlayacak olan adenozin trifosfat, sitidin trifosfat ve uridin trifosfat ribonükleotidlerini ekleyin.

Durdurulmuş RN ape elongasyon kompleksini boncuklar üzerine immobilize etmek için çözeltiyi 37 °C'de 10 dakika daha inkübe edin. Çözeltiyi streptavidin kaplı manyetik boncuklara ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.

Boncukları 0,9 mililitre yüksek tuzlu tamponla yıkayarak immobilize edilmiş durdurulmuş RNAP elongasyon kompleksini saflaştırın. Her yıkamanın ardından spesifik olmayan R-N-A-P-D-N-A komplekslerini uzaklaştırmak için süpernatantı manyetik ayırma yöntemiyle alın. Bu yıkama işlemi beş kez tekrarlanmalıdır.

Ardından boncuklar, 0.9 milliliters tampon A ile iki kez daha yıkanmalıdır. Son yıkamadan sonra, durdurulmuş RNAP uzama kompleksine tutunmuş boncukları 100 microliters New England Biolabs tampon dört içerisinde süspanse etmek için manyetik şeridi kaldırarak kafa-kafa (head-on) RNAP'nin aşağısında bir replikasyon çatalı oluşturulabilir. Daha sonra, 10 units karides alkalin fosfataz veya SAP 1 ekleyin ve örneği 37 degrees Celsius'de 10 dakika boyunca inkübe edin. Boncukları 0.9 milliliters tampon A ile üç kez yıkayın. Ardından boncukları 50 microliters Quick T4 ligasyon reaksiyon tamponu içerisinde yeniden süspanse edin.

İki µL quick T4 ligaz ve önceden hazırlanmış çatallı DNA ekleyip çözeltiyi oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Son olarak, boncukları üç kez daha 0,9 mL Tampon A ile yıkayın; heksamer DNA helikazı, durdurulmuş RNAP elongasyon kompleksi ve aşağı akışta yer alan replikasyon çatalına bağlı olan manyetik strep A boncukları ile karıştırın. Çözeltiyi 150 µL Tampon A içerisinde hazırlayın ve 23 °C'de 30 saniye boyunca inkübe edin.

23 °C'deki kısa süreli 32. inkübasyonun ardından, polymerase three beta clamp'e, toplam hacim 200 µL olacak şekilde α-P32 işaretli DGTP ve α-P32 işaretli DATP ekleyin. Numuneyi 37 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin.

Tek zincirli DNA bağlayan protein DCTP ve DTTP ekleyerek replikasyonu başlatın. Ayrıca, son hacmi 250 microliters olacak şekilde alfa P 32 ile işaretlenmiş DTTP ve DCTP ekleyin. 10 dakika sonra, 12 microliters 0.5 molar EDTA ekleyerek reaksiyonları sonlandırın.

Ardından, DNA'yı boncuklardan ayırmak için strp din boncuklarını kaynatın. Boncukları 50 °C'de 30 dakika boyunca proteinaz K ile muamele ederek kalıntı DNA'yı uzaklaştırın. Boncukları tekrar kaynatın ve süpernatantı manyetik ayırma yöntemiyle uzaklaştırın.

DNA içeren birleştirilmiş süpernatantı Kyogen PCR temizleme kiti kullanarak saflaştırın. Son olarak, saflaştırılmış radyolojik olarak işaretli DNA ürünlerini alkali agaroz jelde analiz edin. Bölgenin bir RNAP ile kafa kafaya çarpışması genellikle 2.5 KB ve 3.6 KB uzunluğunda iki ürünle sonuçlanır. 2.5 KB'lık ürün, çataldan durdurulan RNAP'ye kadar olan DNA uzunluğunu temsil eder.

Bu durum, replizomun RNAP ile çarpışması sonucu duraksamasından kaynaklanmaktadır. 3,6 KB'lık ürün tam uzunluktaki DNA'yı temsil eder ve bu durum ya RNAP'ın promotörü tam olarak işgal etmemesinden ya da replizomun karşı karşıya gelen RNAP üzerinden kısmen geçiş yapmasından kaynaklanır. Başarılı bir sonuç, yaklaşık %50 oranında tam uzunlukta DNA üretildiğini gösterir.

Bununla birlikte, bazı durumlarda promoterin RNAP tarafından daha az işgal edildiği görülür ve daha yüksek oranda tam uzunlukta DNA gözlemlenir. Bunun nedeni, durdurulmuş bir RNAP'nin yokluğunda, replikasyon bölgelerinin daha büyük bir kısmının kafa kafaya bir RNAP replikasyonu ile karşılaşmaması sonucunda yalnızca tam uzunlukta DNA oluşmasıdır. DNA'ya bağlanmış, durdurulmuş bir RNA polimeraz elongasyon kompleksi varlığında replikasyonun ve katı faz işleminin nasıl gerçekleştirileceğini göstermiş olduk. Bu prosedür uygulanırken, DNA'ya spesifik olmayan şekilde bağlanan ve replikasyonu inhibe eden fazla RNA polimerazı uzaklaştırmak için durdurulmuş transkripsiyon kompleksinin yüksek tuz ile yıkanması önemlidir.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.