Name: Head-On RNA Polimeraz Stalled Çoğaltma Fork Doğrudan yeniden başlatın (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Öğrenin, RNA polimeraz ile çarpışan replizomun yeniden başlatılmasını Mfd aracılığıyla nasıl gerçekleştiğini. Bu yöntem, DNA çoğaltma ve transkripsiyon dinamiklerini anlamak için kritik öneme sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Seth Darst RNAP ve MFD proteinler ve ifade vektörleri sağlamak için özellikle teşekkür ediyoruz. Ayrıca, teknik destek Greb ve Dan Zhang sağlamak için Sergei Borukhov teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, Sağlık (MOD) National Institutes hibe ve Marie-josee ve Rockefeller Üniversitesi (RTP) Henry Kravis Bursu tarafından desteklenmiştir.

Bu yöntem bildirilen araştırmada kullanılan <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content-nw/full/327/5965/590/F3">Pomerantz ve O'Donnell, Science 327, 590-592 (2010)</a> . 1. Durdurulmuş RNAP uzama kompleksi Meclisi şu şekilde yapıldı: E. 500 nM nihai konsantrasyonu coli RNAP HE 100 A (20 mM Tris-Cl (pH 7.5), 8 mM MgCl 2, 0.5 mM EDTA, 5 tampon ul T7A1 organizatörü içeren bir biotinlenmiş 3.6 kb DNA örneğinin 5 nM nihai konsantrasyonu ile karışık 70 σ 10 dk 37 mM DTT,% 10 gliserol) ° C. APU ve her biri 40 mcM, GTP, ATP ve CTP 100 mcM 37 ek bir 10 dakika ° C eklendi 2. Streptavidin boncuk üzerine durduruldu RNAP uzama kompleksi immobilizasyonu şu şekilde yapıldı: 200 ul streptavidin kaplı manyetik boncuk (Invitrogen) Yukarıdaki reaksiyon oda sıcaklığında 10 dakika ilave edildi. 3. Immobilize durduruldu RNAP uzama kompleksi Arıtma şu şekilde yapıldı: Boncuk tampon 0.9 ml A içeren 0.75 M NaCl, 200 mg / ml heparin ve 20 mg / ml Sonraki ssDNA (süpernatant manyetik ayırma her yıkama adımdan sonra kaldırıldı.), (Yukarıda) ile 5 kez yıkandı boncuk, 2 kez 0.9 ml tampon A. ile yıkandı 4. Baş-on RNAP şu şekilde yapılmıştır downstream göreceli bir replikasyon çatal Oluşumu ° C, boncuk (yukarıda) New England Biolabs tampon 4 ve Sap (New England Biolabs) 10 adet 100 ul yeniden süspanse 37 10 dakika eklendi. Boncuk 0.9 ml tampon A ile 3 kez yıkanır ve ardından Hızlı T4 ligasyon reaksiyon tamponu (New England Biolabs) 50 ul yeniden süspanse edildi. Hızlı T4 ligaz (New England Biolabs) 2 ul oda sıcaklığında 10 dakika için ön tav-çatallı DNA 6 nM final konsantrasyonu (RP10, RP22, RP25) ile birlikte eklendi. Boncuk 0.9 ml tampon A. ile 3 kez yıkandı 5. Çoğaltma çatal önde gelen iplikçik sentez replisome ve inisiyasyon Kurul şu şekilde yapıldı: Tampon boncuk 150 ul 448 pmol DnaB (hexamer gibi) ile inkübe edildi (20 mM Tris-Cl (pH 7.5), 8 mM MgCl 2, 0.5 mM EDTA, 5 mM DTT,% 10 gliserol) az 30 s 23 ° C Pol III 4.9 pmol * (Pol III HE eksi β), 15 pmol β, 2 mM ATP ve her biri 60 mcM dGTP ve dATP hacmi 200 ul eklenir ve 37 az bir 5 dakika daha ° C inkübe edildi Çoğaltma ile birlikte 10 mg SSB ve her biri 24 mcM dATP ve dTTP ekleyerek üzerine başlatılan [α-32 P] dTTP ve [α-32 P] dCTP (spesifik aktivite, 3.000-5.000 cpm / pmol) son hacmi 250 mcL. Reaksiyonları 12 ul 500 mM EDTA ekleyerek üzerine 10 dakika sonra sona erdirildi. 6. Arıtma ve radyo-işaretli DNA ürünlerin konsantrasyonu şu şekilde yapıldı: Reaksiyon boncuk DNA kaldırmak için sona erdirildi sonra boncuk (yukarıda) kaynatılır. 50 - 30 dk 10 ul hacmi proteinaz K ile boncuk tedavi ° C boncuklar bağlı kalan herhangi bir kalıntı DNA tarafından kaldırıldı Boncuk sonra kaynatılmış ve manyetik ayırma süpernatantı tarafından kaldırıldı. DNA içeren kombine süpernatant Qiagen PCR Temizleme kiti kullanarak saflaştırılmış. Saf radyo-işaretli DNA ürünleri daha sonra alkali agaroz jel analiz edildi. * Baş RNAP uzama kompleksi yukarıdaki gibi yapıldı durdurdu, ancak σ 70 yokluğunda Çoğaltma atlandı. Temsilcisi Sonuçlar: Çarpışma ile replisome bir baş-RNAP genellikle 2,5 kb ve uzunluğu 3,6 kb iki ürün ile sonuçlanır. 2,5 kb ürün durduruldu RNAP ve RNAP ile çarpışması üzerine durdurduklarını replisome sonuçları çatal DNA uzunluğu temsil eder. 3.6 kb ürün eksik RNAP organizatörü doluluk veya kısmi replisome baş RNAP salt yoluyla tam uzunlukta DNA ve sonuçları temsil eder. Iyi ya da doğru bir sonucu, yaklaşık% 50 tam uzunlukta DNA olduğunu göstermektedir. Ancak, bazı durumlarda RNAP organizatörü az doluluk oluşur ve daha yüksek bir yüzdesi tam uzunlukta DNA replisomes daha büyük bir nüfus beri gözlemlenen bir baş-RNAP karşılaşma yok. Sadece tam uzunlukta DNA (3.6 kb) durduruldu RNAP sonuçları yokluğunda Çoğaltma. <img src="/files/ftp_upload/1919/1919fig1.jpg" alt="Şekil 1"> Şekil. 1 replisome baş RNAP engellemektedir. (A) Deneysel kurulum. A E. coli RNAP durduruldu uzama kompleks, daha önce açıklandığı gibi T7A1 organizatörü (9) içeren bir biotinlenmiş DNA üzerine monte edildi . Kısaca, durdurulmuş bir uzama kompleksi APU, GTP, ATP ve CTP bir 10 dakika daha ilave edilerek 10 dakika için biotinlenmiş DNA ile RNAP holoenzyme kuluçka organizatörü 20 bps downstream kuruldu. Streptavidin boncuk boncuk 0.75 m NaCl, 200 mg / ml heparin içeren ve 100 nM tek iplikli DNA kararsız RNAP-DNA kompleksleri ve aşırı UTP'larının kaldırmak için 0.9 ml tampon beş kez yıkandı ek bir 10 dakika ilave edildi . DNA sonra Sapi ile sindirilmiş, yıkanmış ve bir ön tav-çatallı DNA bağlandı oldu. Boncuk replisome montaj öncesinde tekrar yıkandı. (B) DnaB sonra replisome toplandı eklendi ve çoğaltma ya varlığında başlatılan (şeritli 2) veya yokluğu (şeritli 1) organizatörü çatal 2,5 kb bulunan ve çatal yönelik doğrudan transkripsiyon yönelik. baş üzerinde RNAP.

<ol><li>Rudolph, C. J., Dhillon, P., Moore, T., Lloyd, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avoiding+and+resolving+conflicts+between+DNA+replication+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Avoiding and resolving conflicts between DNA replication and transcription.</a> DNA Repair (Amst). 6, 981-98 (2007).</li>
<li>Vilette, D., Ehrlich, S. D., Michel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription-induced+deletions+in+plasmid+vectors%3A+M13+DNA+replication+as+a+source+of+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcription-induced deletions in plasmid vectors: M13 DNA replication as a source of instability.</a> Mol Gen Genet. 252, 398-398 (1996).</li>
<li>Trautinger, B. W., Jaktaji, R. P., Rusakova, E., Lloyd, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+modulators+and+DNA+repair+activities+resolve+conflicts+between+DNA+replication+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase modulators and DNA repair activities resolve conflicts between DNA replication and transcription.</a> Mol Cell. 19, 247-247 (2005).</li>
<li>McGlynn, P., Lloyd, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+RNA+Polymerase+by+%28p%29ppGpp+Reveals+a+RecG-Dependent+Mechanism+for+Replication+Fork+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modulation of RNA Polymerase by (p)ppGpp Reveals a RecG-Dependent Mechanism for Replication Fork Progression.</a> Cell. 101, 35-35 (2000).</li>
<li>McGlynn, P., Guy, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+forks+blocked+by+protein-DNA+complexes+have+limited+stability+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro.</a> J Mol Biol. 381, 249-249 (2008).</li>
<li>Labib, K., Hodgson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+barriers%3A+pausing+for+a+break+or+stalling+for+time%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Replication fork barriers: pausing for a break or stalling for time.</a> EMBO Rep. 8, 346-346 (2007).</li>
<li>Bidnenko, V., Ehrlich, S. D., Michel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+collapse+at+replication+terminator+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Replication fork collapse at replication terminator sequences.</a> Embo J. 21, 3898-3898 (2002).</li>
<li>Pomerantz, R. T., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replisome+mechanics%3A+insights+into+a+twin+DNA+polymerase+machine%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Replisome mechanics: insights into a twin DNA polymerase machine.</a> Trends Microbiol. 15, 156-156 (2007).</li>
<li>Pomerantz, R. T., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+replisome+uses+mRNA+as+a+primer+after+colliding+with+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The replisome uses mRNA as a primer after colliding with RNA polymerase.</a> Nature. 456, 762-762 (2008).</li>
<li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439, 557-557 (2006).</li>
<li>Yuzhakov, A., Turner, J., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Cell. 86, 557-557 (1996).</li>
<li>Hinkle, D. C., Ring, J., Chamberlin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replisome+assembly+reveals+the+basis+for+asymmetric+function+in+leading+and+lagging+strand+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Replisome assembly reveals the basis for asymmetric function in leading and lagging strand replication.</a> J Mol Biol. 70, 197-197 (1972).</li>
<li>Kaplan, D. L., O'Donnell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+the+binding+of+Escherichia+coli+RNA+polymerase+to+DNA.+V.+T7+RNA+chain+initiation+by+enzyme-DNA+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Studies of the binding of Escherichia coli RNA polymerase to DNA. V. T7 RNA chain initiation by enzyme-DNA complexes.</a> Mol Cell. 15, 453-453 (2004).</li>
<li>Park, J. S., Marr, M. T., Roberts, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twin+DNA+pumps+of+a+hexameric+helicase+provide+power+to+simultaneously+melt+two+duplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Twin DNA pumps of a hexameric helicase provide power to simultaneously melt two duplexes.</a> Cell. 109, 757-757 (2002).</li>
<li>Hanawalt, P. C., Spivak, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((coli+Transcription+repair+coupling+factor+%28Mfd+protein%29+rescues+arrested+complexes+by+promoting+forward+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">coli Transcription repair coupling factor (Mfd protein) rescues arrested complexes by promoting forward translocation.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 958-958 (2008).</li>
<li>Hanawalt, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription-coupled+DNA+repair%3A+two+decades+of+progress+and+surprises%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises.</a> Science. 266, 1957-1957 (1994).</li>
<li>Selby, C. P., Sancar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription-coupled+repair+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Transcription-coupled repair and human disease.</a> J Biol Chem. 270, 4882-4882 (1995).</li>
<li>Liu, B., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+transcription-repair+coupling+factor.+I.+Structural+domains+and+binding+properties.+Head-on+collision+between+a+DNA+replication+apparatus+and+RNA+polymerase+transcription+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure and function of transcription-repair coupling factor. I. Structural domains and binding properties. Head-on collision between a DNA replication apparatus and RNA polymerase transcription complex.</a> Science. 267, 1131-1131 (1995).</li>
<li>George, D. L., Witkin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+excision+repair+in+an+mfd+mutant+of+Escherichia+coli+B%2Fr%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">Slow excision repair in an mfd mutant of Escherichia coli B/r.</a> Mol Gen Genet. 133, 283-283 (1974).</li>
</ol>

Çamaşır durduruldu uzama kompleksi yüksek tuz ile boncuklar bağlı herhangi bir dengesiz veya non-spesifik bağlı RNAP molekülleri kaldırmak için kritik öneme sahiptir. RNAP astar şablon türü DNA yapıları için son derece yüksek bir afinitesi vardır. Bu nedenle, astar şablon çoğaltma gerçekleştirmek için, non-spesifik RNAP-DNA kompleksleri kaldırmak için gereklidir. Qiagen PCR saflaştırma kiti kullanılarak, radyo-işaretli DNA ürünler Yoğunlaştırmalı jel görülebilir, yeterince yüksek bir radyoaktif sinyal elde etmek için de kritik öneme sahiptir.

<table><tbody><tr><td>Dynabeads M-270</td><td>Invitrogen</td><td>653.05</td><td></td></tr><tr><td>SapI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0569S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Quick Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>PCR Saflaştırma Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr></tbody></table>

head-on rna polimeraz stalled Çoğaltma fork doğrudan yeniden başlatın

Direct Restart of a Replication Fork Stalled by a Head-On RNA Polymerase

In vivo çalışmalarda çoğaltma çatal ile baş-transkripsiyon kompleksleri nedeniyle karşılaşmalar tutuklandı olduğunu düşündürmektedir. Ancak, replisome ve RNA polimeraz (RNAP) kaderi şu kafa kafaya çarpışmada bilinmiyor. Burada bulduğumuz E. replisome tezgahları ile çarpışması üzerine coli baş-transkripsiyon kompleksi, ama yerine çöken, çoğaltma çatal son derece kararlı kalır ve sonunda DNA RNAP yerinden sonra uzama devam eder. Biz transkripsiyon-onarım bağlantı faktörü, MFD, çatal RNAP yerinden kolaylaştırarak çarpışma sonucu doğrudan yeniden teşvik olduğunu da bulabilirsiniz. Bu bulgular içsel istikrar ve çoğaltma cihazı RNAP blok geçmiş çoğaltma teşvik transkripsiyon birleştiğinde onarım yolu için yeni bir rol göstermektedir.

Bir çarpışma replisome kaderi ile baş-RNA polimeraz (RNAP) bilinmiyor. Biz DNA RNAP yerinden sonra uzama replisome baş RNAP ile çarpışması üzerine tezgahları, ancak devam eder ki bulabilirsiniz. MFD çarpışmadan sonra RNAP yerinden kolaylaştırarak çoğaltma işlemini yeniden başlatın teşvik etmektedir.

Head-On RNA Polimeraz Stalled Çoğaltma Fork Doğrudan yeniden başlatın

In vivo çalışmalar, replikasyon çatallarının, kafa kafaya gelen transkripsiyon kompleksleriyle karşılaşmaları nedeniyle durdurulduğunu öne sürmektedir. Yine de, replizomun ve RNA'nın akıbeti...

Bu prosedürün genel amacı, karşı karşıya bir çarpışmanın ardından Repli bölgesinin ve RNA polimerazın veya RNAP'nin akıbetini gözlemlemektir. Bu, öncelikle biyotinlenmiş DNA üzerinde transkripsiyon kompleksinin kurulması ve Stripp tablet ile boncuklar üzerine immobilize edilmesiyle gerçekleştirilir; bu işlem, durdurulmuş RNAP elongasyon kompleksi ile sonuçlanacaktır. Prosedürün ikinci adımı, karşı karşıya RNAP'nin aşağısında bir replikasyon çatalı oluşturmak için önceden çatallanmış DNA'nın RNAP elongasyon kompleksine ligasyonudur.Prosedürün üçüncü adımı, repli zonun kurulması ve replikasyon çatalında öncü zincir sentezinin başlatılmasıdır. Prosedürün son adımı, DNA'nın manyetik boncuklardan izole edilmesi ve bir PCR temizleme kolonu üzerinden saflaştırılmasıdır. Nihayetinde, saflaştırılmış radyolabelenmiş DNA ürünlerinin alkali agaroz jeli aracılığıyla, roso'nun kafa kafaya transkripsiyon kompleksi ile çarpışması üzerine duraksadığını gösteren sonuçlar elde edilebilir.Merhaba, ben Rockefeller Üniversitesi'ndeki Mike O'Donnell Laboratuvarı'ndan Richard Pomerance. Bugün size katı fazda ribozomun RNA polimeraz ile kafa kafaya çarpışmasının nasıl gerçekleştirileceğine dair prosedürü göstereceğim. Laboratuvarımızda bu prosedürü, replikasyon sürecinin DNA boyunca yer alan transkripsiyon komplekslerinden nasıl etkilendiğini incelemek için kullanıyorum.Hadi başlayalım. Bu protokole başlamak için, RNAP holo enzimini, T7 A1 promoterini içeren biotinillenmiş 3.6 KB DNA kalıbı ile 100 µL tampon A içinde karıştırın ve karışımı 37 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin. 10 dakikalık inkübasyonun ardından, RNA sentezini 20 nükleotit ile sınırlayacak olan adenozin trifosfat, sitidin trifosfat ve uridin trifosfat ribonükleotidlerini ekleyin.Durdurulmuş RN ape uzama kompleksini boncuklara immobilize etmek için çözeltiyi 37 °C'de 10 dakika daha inkübe edin. Çözeltiyi streptavidin kaplı manyetik boncuklara ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.İmmobilize edilmiş durdurulmuş RNAP elongasyon kompleksini, boncukları 0,9 milliliters yüksek tuz tamponu ile yıkayarak saflaştırın. Her yıkamanın ardından spesifik olmayan R-N-A-P-D-N-A komplekslerini uzaklaştırmak için süpernatantı manyetik ayırma yöntemiyle alın. Bu yıkama işlemi beş kez tekrarlanmalıdır.Ardından boncuklar, 0.9 milliliters Tampon A ile iki kez daha yıkanmalıdır. Son yıkamadan sonra, head-On RNAP'nin aşağısında bir replikasyon çatalı oluşturmak için aşağı akış replikasyon çatalı birleştirilebilir. Durdurulmuş RNAP elongasyon kompleksine tutunmuş boncukları görünür kılmak için manyetik şeridi 100 microliters New England Biolabs Tampon 4 içinde süspanse edin. Daha sonra, 10 units karides alkalin fosfataz veya SAP 1 ekleyin ve örneği 37 degrees Celsius'ta 10 dakika inkübe edin. Boncukları 0.9 milliliters Tampon A ile üç kez yıkayın. Ardından boncukları 50 microliters Quick T4 ligasyon reaksiyon tamponu içinde yeniden süspanse edin.İki mikrolitre quick T4 ligaz ekleyin ve çatallı DNA'yı önceden hazırlayın, çözeltiyi oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Son olarak, boncukları 0.9 mililitre tampon A karışımı ile üç kez daha yıkayın; hekzamer DNA helikazı, durdurulmuş RNAP elongasyon kompleksine ve aşağı akış yönündeki replikasyon çatalına bağlı olan manyetik strep A boncuklarıyla karıştırın. Çözeltiyi 150 mikrolitre tampon A içinde hazırlayın ve 23 °C'de 30 saniye boyunca inkübe edin.23 °C'deki kısa süreli 32. inkübasyonun ardından, polimeraz üç beta klempe, toplam hacim 200 µL olacak şekilde A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P, α P 32 ile işaretli DGTP ve α P 32 ile işaretli DATP ekleyin. Örneği 37 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin.Tek zincirli DNA bağlayıcı protein DCTP ve DTTP ekleyerek replikasyonu başlatın. Ayrıca, final hacmi 250 microliters olacak şekilde alfa P 32 ile işaretlenmiş DTTP ve DCTP ekleyin. 10 dakika sonra, 12 microliters 0.5 molar EDTA ekleyerek reaksiyonları sonlandırın.Ardından, DNA'yı boncuklardan serbest bırakmak için strp din boncuklarını kaynatın. Boncukları 50 °C'de 30 dakika boyunca proteinaz K ile muamele ederek kalıntı DNA'yı uzaklaştırın. Boncukları tekrar kaynatın ve manyetik ayırma yöntemiyle süpernatantı uzaklaştırın.DNA içeren birleştirilmiş süpernatantı Kyogen PCR temizleme kiti kullanarak saflaştırın. Son olarak, saflaştırılmış radyoaktif işaretli DNA ürünlerini alkali agaroz jelde analiz edin. Bölgenin RNAP ile kafa kafaya çarpışması genellikle 2.5 KB ve 3.6 KB uzunluğunda iki ürünle sonuçlanır. 2.5 KB'lık ürün, çataldan durdurulan RNAP'ye kadar olan DNA uzunluğunu temsil eder.Bu durum, RNAP ile çarpışma sonucu replikasyonun durmasından kaynaklanır. 3,6 KB'lık ürün, tam uzunluktaki DNA'yı temsil eder ve ya RNAP'nin promotörü tam olarak doldurmamasından ya da replikasyonun kafa kafaya karşı karşıya gelen RNAP'yi kısmen okuyup geçmesinden kaynaklanır. İyi bir sonuç, yaklaşık %50 oranında tam uzunlukta DNA üretildiğini gösterir.Ancak bazı durumlarda, promotörün RNAP tarafından doluluk oranı daha düşük olur ve daha yüksek oranda tam uzunlukta DNA gözlemlenir. Bunun nedeni, durdurulmuş bir RNAP'nin yokluğunda, replikasyon bölgelerinin daha büyük bir kısmının kafa kafaya RNAP replikasyonu ile karşılaşmamasının yalnızca tam uzunlukta DNA ile sonuçlanmasıdır. DNA'ya bağlı durdurulmuş bir RNA polimeraz uzama kompleksinin varlığında replikasyonun ve katı fazın nasıl gerçekleştirileceğini göstermiş olduk. Bu prosedür uygulanırken, DNA'ya spesifik olmayan şekilde bağlanarak replikasyonu inhibe eden fazla RNA polimerazı uzaklaştırmak için durdurulmuş transkripsiyon kompleksinin yüksek tuz ile yıkanması önemlidir.İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

direct-restart-replication-fork-stalled-head-on-rna

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

DT40 bir model omurgalı genetik sistemi, protein fonksiyonu analiz etmek için güçlü bir araç sağlar. Burada tek bir molekül düzeyinde DT40 hücrelerinde S-fazında DNA sentezi etkileyen parametreler nitel analiz sağlayan basit bir yöntem açıklanmaktadır.

DNA replikasyonu Görselleştirme Omurgalı Model Sistemi DT40 DNA Fiber Tekniği

Burada, Escherichia coli'deki replikasyon çatallarını durdurmak ve çökertmek için bölgeye özgü, geri dönüşümlü in vivo protein bloğu kullanan bir sistemi tarif ediyoruz. Replikasyon bloğunun kurulması floresan mikroskobu ile değerlendirilir ve replikasyon ara ürünlerini görselleştirmek için nötr-nötr 2 boyutlu agaroz jel elektroforezi kullanılır.

Bir Siteye Özel çoğaltma Blokaj içinde uyaran<i&gt; E. E. coli</i&gt; Bir Floresan Baskılayıcı Operatör Sisteminin Kullanılması

Burada, 2 boyutlu jel elektroforezi kullanarak patojenik, yapıya eğilimli tekrarlar yoluyla replikasyon ilerlemesini analiz etme prosedürünü özetliyoruz.

SV40 Tabanlı İnsan Epizomu İçinde Yapıya Eğilimli DNA Tekrarları Yoluyla Replikasyonun Elektroforetik Analizi

Bu teknik, bir insan onkogen kodlama çoğaltma kusurlu retroviral stokları hazırlamak için etkin bir şekilde gösteriyor ve daha sonra fare modeli myeloproliferatif hastalığı indüksiyonu için kullanılır.

293T hücreleri geçici Transfeksiyon Çoğaltma-Arızalı Retrovirus Üretimi

Bu protokol, gerçek zamanlı olarak bireysel replisomes DNA replikasyonu görselleştirmek için basit bir tek-molekül floresan mikroskopi tekniği gösterir.

Floresan Mikroskop ile görselleştirme Tek molekül DNA replikasyonu

Biz bireysel DNA molekülleri bakteriyofaj çoğaltma sistemi proteinleri aracılığı ile gerçek zamanlı çoğaltma gözlemlemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Enzimlerin Klonlanması DNA Doğrudan Gözlem Tek bir molekülü DNA Testi Esneme

Görselleştirme RNA Yerelleştirme Xenopus Oosit

24hpf zebrafish otocyst doğrudan morpholinos sunmak için bir yöntem geliştirilmiştir. Otik vezikül ve penetrasyon etkisi elektroporasyon lümenine morpholinos, mikroenjeksiyon, morpholinos beyin üzerinde etkisi atlayacak ve iç kulak özgü efektler elde etmek mümkün.

Enjeksiyon ve Elektroporasyon Zebra balığı Otocyst içine MIF Morpholinos Stoktan teslim İç Kulak Geliştirme etkiler

Bu yöntem, Gaussia lusiferaz (GLuc) geni içeren lineerize edilmiş bir plazmidden hem kaplı hem de kaplanmamış mRNA'nın yüksek verimli in vitro sentezini tanımlamaktadır. RNA saflaştırılır ve kaplanmamış RNA'nın bir kısmı Vaccinia virüsü kaplama enzimi kullanılarak enzimatik olarak kaplanır. Son adımda, mRNA HeLa hücrelerine transfekte edilir ve hücre kültürü süpernatantları lusiferaz aktivitesi için analiz edilir.

HeLa Hücre Transfeksiyon Ardından Gaussia Lusiferaz mRNA in vitro transkripsiyon ve Kapatma yılında

RNA<em&gt; Yerinde</emTüm Dağı Embriyolar ve Hücre histolojisi&gt; Hibridizasyon Deniz Elasmobranchs İçin Uyarlanmış

Öğrenin, RNA polimeraz ile çarpışan replizomun yeniden başlatılmasını Mfd aracılığıyla nasıl gerçekleştiğini. Bu yöntem, DNA çoğaltma ve transkripsiyon dinamiklerini anlamak için kritik öneme sahiptir.

Head-On RNA Polimeraz Stalled Çoğaltma Fork Doğrudan yeniden başlatın

Daha fazla video keşfet