JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiyoloji
0 görüntüleme • 2:43 dk • September 26th, 2025
Stres indüksiyonundan önce ve sonra bir bakteri kültüründen elde edilen radyoaktif işaretli nükleotid ekstraktları ile başlayın.
Stres altında, bakteriyel enzimler guanozin trifosfat ve guanozin difosfatı stres kaynaklı nükleotidler guanozin pentafosfat ve guanozin tetrafosfata dönüştürür.
Ekstraktları, sabit faz olarak katyonik bir polimer ile önceden kaplanmış ince tabakalı bir kromatografi plakasına yerleştirin.
Plakayı mobil faz olarak tampon içeren bir odaya yerleştirin ve erken difüzyonu önlemek için sıvının noktanın altında kalmasını sağlayın.
Negatif yüklü nükleotidleri yüklerine ve boyutlarına göre farklı bantlara ayırarak tamponun kılcal hareketle yükselmesine izin verin.
Geliştirmeden sonra plakayı çıkarın, havayla kurutun ve serbest izotopları ortadan kaldırmak ve arka plan sinyalini azaltmak için üst kısmı düzeltin.
Radyoaktif sinyali algılamak için plakayı radyasyona duyarlı bir ekrana maruz bırakın.
Stres indüksiyonundan sonra artan guanozin tetrafosfat ve guanozin pentafosfat seviyeleri, guanozin nükleotid havuzundaki dinamik kaymaları ortaya çıkarır.
İlk olarak, 20 x 20 santimetrelik bir PEI selüloz TLC plakası yerleştirin.
Üstteki beş santimetreyi çıkarmak için makas kullanın ve kenardan bir santimetre uzakta bir başlangıç çizgisini işaretlemek için yumuşak bir kalem kullanın. PEI yüzeyine her numuneden beş mikrolitrelik bir damla uygulayın.
Leke kurumadan önce, plakayı, orijin numune noktasına dokunmayacak kadar sığ olan 1,5 molar monopotasyum fosfat tabakası içeren bir tanka aktarın. Depoyu hava geçirmez bir conta ile kapatın ve sıvının 15 santimetrelik kesilmiş tabakanın üstüne çıkmasına izin verin. Bundan sonra, tam gelişmiş kromatogramı çıkarın ve oda sıcaklığında havayla kurutun.
Serbest P32'yi içeren kromatogramın üst kısmını kesin ve radyoaktif atık haline getirin. Odyoradyografik filmleri gece boyunca pozlamak için bir fosfor ekran kullanın. Ertesi gün, filmi geliştirin ve fosforun yeşil sinyalini yakalamak ve ölçmek için bir fosfor görüntüleyici kullanın.
Ardından, radyoaktif noktaların miktarını belirlemek için ImageJ yazılımını kullanın.