Bir arınma ve In Vitro etkinliği tahlil için (p) ppGpp sentetaz Clostridium difficile üzerinden

Bu yöntem, enzim substrat özgüllüğü ve reaksiyon kinetiği de dahil olmak üzere fosfotransfer enzimleri ile ilgili anahtar soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, enzim aktivitesinin istatistiksel olarak sağlam bir şekilde ölçülmesini sağlayarak çok tutarlı birden fazla veri kümesinin hızlı bir şekilde toplanmasına olanak sağlamasıdır. Bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir, çünkü TLC plakaları üzerindeki reaksiyonları tespit etmek ve reaksiyonlarda radyoaktif türlerin ölçülmesi açıklamaktan çok daha kolaydır.

Astha'ya ek olarak, prosedürü gösteren asia Poudel, laboratuvarımdaki başka bir yüksek lisans öğrencisi olacak. Bu protokolü metin protokolünde açıklandığı gibi histidin etiketli bir proteinin indükedilemez aşırı ekspresyonu ile başlayın. Proteini arındırmak için bir mililitre nikel nitriloasetik asit reçinesini yerçekimi sütununda hazırlayın.

Kullanımdan bir gün önce, iki mililitre denge tamponu ile sütunu bir gecede dört santigrat derecede dengeleyin. Ertesi gün, kolondört santigrat dereceden oda sıcaklığına getirilince, açıklık lısatı yüklemeden önce yaklaşık 2-3 saat bekletin. Daha sonra lysis tampon undaki peleti yeniden askıya alın.

Darbeler arasında 30 saniye duraklatarak, 10 kez 10 saniyelik aralıklarla buzdaki hücreleri sonicate. Mikrosantrifüj kullanarak 3, 080 kez g 30 dakika 4 santigrat derecede santrifüj ile lysate netleştirin. Eşit hacimlerde lisis arabelleği ile açıklığa kavuşturulan lysate'yi hazırlayın, sonra hazır, açıklıklı lysate'yi sütuna uygulayın ve akış tanbirini toplayın.

Açıklığa kavuşturulan akış akışını sütuna yeniden uygulayın ve ikincil akışı toplayın. Sonra yıkama tampon bir beş mililitre ile sütun yıkayın ve akış toplamak. Sütunu beş mililitre yıkama tamponu iki ile tekrar yıkayın ve akışı toplayın.

Şimdi iki mililitre elüsyon tamponu uygulayın. Her biri bir mililitrenin iki fraksiyonu halinde akış-through toplamak. Protein saflaştırma sırasında, magnezyum klorür saflaştırma tamponlar dahil, üreticinin protokolü bir değişiklik, enzimatik aktivite için gereklidir.

SDS-PAGE ile protein saflaşmasını nitel olarak değerlendirmek için, tüm sütun fraksiyonlarının 20 mikrolitre aliquot'larını %4 istifleme, %10'u 170 voltta 60 dakika boyunca poliakrilamid jel çalıştırın. Beş saat boyunca oda sıcaklığında% 0.1 Coomassie mavi ile jel Leke, bir tezgah üstü rocker hafifçe sallanan. Sonra oda sıcaklığında bir gecede% 40 metanol-10% buzul asetik asit jel destain, benchtop rocker üzerinde sallanan.

Diyaliz tamponuna karşı eluted fraksiyonu 200:1 oranında bir mililitrediyaliz cihazı ile bir gecede 20 kilodalton moleküler ağırlık kesme ile dört derece santigrat de eluted kesir 2. 280 nanometrede emiciliği ölçerek ve hesaplanan molar yok olma katsayısını kullanarak diyaliz protein numunesinin konsantrasyonu belirleyin. 100 mikrolitrelik diyaliz protein örneğini kullanıma kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Reaksiyonu gerçekleştirmeden önce, PEI selüloz ince tabaka kromatografi plakalarını deiyonize suda yıkayarak hazırlayın. Yaklaşık 0,5 santimetre derinliğe çift distile su ile bir cam odasına plakaları yerleştirin. Suyun plakanın üstüne çıkmasına izin verdikten sonra, tabakları cam hazneden çıkarve bir tezgah üstü rafta bekletin.

Kurutulmuş tabakları bir kenardan iki santimetre yumuşak bir kalemle işaretleyin ve örneklerin TLC için nereye uygulanacağını belirtin. İki mikrolitrelik numuneler için, numuneleri en az bir santimetre arayla uygulayın. Denemeler planlarken, her plakaüzerinde her zaman bir nokta bırakın örnek nicelleştirme için boş bir şerit olarak hizmet vermek için kullanılmaz.

Enzim aktivitesi testini gerçekleştirmek için metin protokolünde açıklandığı gibi gamma P32 ATP kullanarak bireysel reaksiyonlar hazırlayın. Diğer bileşenler karıştırıldıktan sonra RSH'yi ekleyin, nükleotit içeren karışıma RSH ilavesi enzimatik aktivite yitirir. ATP hidrolizininnü nükleaz aktivitesini kirletmekten kontrol etmek için, protein içermeyen 10 mikrolitrelik bir reaksiyon uyguluyor ve paralel olarak kuluçkaya yatırın.

İki mikrolitrelik numuneleri T'de sıfıra eşit olarak ve deney sonunda ATP'nin protein yokluğunda hidrolize edilmediğinden emin olmak için noktalandırın. RSH'nin eklenmesinden hemen sonra, iki mikrolitreyi çıkarın ve T sıfır dakika örneğine eşit olduğu için etiketli PEI-selüloz plakasına yerleştirin. Reaksiyonu 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın, istenilen zaman noktalarında iki mikrolitrelik aliquotları çıkarın.

Tüm aliquots toplandıktan sonra, 0.5 santimetre derinliğe 1.5 molar monobasic potasyum fosfat ile kromatografi odası doldurarak ince tabaka kromatografi yapmak. Plakanın alt kenarını çözücüye batırın ve çözücünün yaklaşık 90 dakika boyunca plakanın üst kısmına geçişini bekleyin. Plakayı kromatografi tankından çıkarın ve bir gece boyunca kuruması için tezgah üstü kurutma rafına yerleştirin.

Plaka kuruduktan sonra, radyoaktif maddenin görüntüleme kasetine aktarılmasını önlemek için plakayı plastik filme sarın ve otoradyografi ile analiz edin. Oda sıcaklığında dört saat boyunca fosforimager kasete ayrılmış reaksiyonlar içeren PEI-selüloz plakasını açığa çıkarın. Pozlamayı takiben, kaseti fosforlu görüntüleyicinin üzerinde görüntüleyin.

Grafik kullanıcı arabirimi ile görüntüleme yazılımı kullanarak, ilk bir Dikdörtgen Çiz'i seçerek ilgi bölgeleri veya ROI'lar çizin, ardından fareyi kullanarak tüm şerit etrafında dikdörtgen ROI'lar ve bu şeridin içinde bulunan ATP ve guanozin-tetrafosfat noktalarını çizin. ROI'ların her şeritteki aynı alanlarda sinyal ölçtüğünden emin olmak için diğer şeritler içinde aynı ROI'ları çizmek için Seç, Kopyala ve Yapıştır komutlarını kullanın. Boş olarak kullanılmak üzere kullanılmayan bir şeritten ROI'lar ekleyin.

Analiz, Araçlar, Yatırım Getirisi Yöneticisi, Görüntüleme yazılımıkomutları ekleyin kullanarak, PEI-selüloz plaka üzerinde çizilmiş ROI'ların tümünü seçin. Şimdi her YG içindeki sinyal yoğunluğunu ölçmek ve ölçümleri spreadsheeet olarak dışa aktarmak için Analiz, Ölçümleri Ayarla, Ölçü komutlarını kullanın. Elektronik tabloda, boş YG değerlerini deneysel sinyallerden çıkarın.

Verilerin sentezlenmiş yüzde guanozin-tetrafosfata dönüştürülmesi çok önemlidir, çünkü farklı günlerde farklı protein veya farklı gama P32 ATP ile toplanan veri kümelerinin tutarlı olmasını ve istatistiksel titizlik için bir araya getirilebilmesini sağlar. Bu karikatür, ilgi alanlarının, bir numunedeki toplam radyoaktif sinyali ve bileşen radyoaktif ATP'yi ve guanozin tetrafosfat bölgelerini içeren bir şeridi tanımlamak için nasıl kullanıldığını göstermektedir. ATP ve guanozin tetrafosfat sinyalleri mutlak değerleri bildirmek yerine toplam sinyale normalleştirilir, çünkü radyoaktif substrat borulama hatası veya çürümesi numunedeki toplam sinyali etkileyebilir, ancak enzim aktivitesini etkilemez.

Burada gösterilen safLaştırılmış C.difficile RSH kullanılarak yapılan bir reaksiyonun gerçek bir TLC plaka. Protein içermeyen bir kontrol reaksiyonu katalize edilmemiş ATP hidrolizinin nicelleştirilmesine izin verirken, boş bir şerit doğru sinyal nicelemesine izin verir. ATP ve guanozin-tetrafosfat lekelerinde enzim radyoaktif fosfatı ATP substratından GSYİh öncüsörüne aktararak radyoaktif guanozin tetrafosfat oluşturur.

Bu, C.difficile'den gelen putatif guanozin tetrafosfat sentezinin aktif bir enzim olduğunu doğrular. Reaksiyonun aralıklarla örneklendiği gibi, ilerleme gözlemlenebilir. Burada ham sinyal her zaman noktasında gözlenir.

ATP azalıyor ve guanozin tetrafosfat artıyor. Burada normalleştirilmiş veriler gösterilmiştir. Normalleştirme herhangi bir pipetleme hatası için hesaplar, çünkü hata çubukları çok daha küçüktür.

Bu yordamı denerken, TLC plakaüzerindeki rezorin çizilmemeye dikkat etmek önemlidir, çünkü bu solvent geçişini engelleyebilir. Bu hızlı bir şekilde enzim aktivitesinin sağlam niceleme sağlayabilir basit veri analizi ile çok erişilebilir bir tekniktir. Clostridium difficile'ın guanozin tetrafosfatsentezini doğrulamak için kullandık.

Radyoaktivite ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın ve bu işlemi gerçekleştirirken radyoaktif maddelerin depolanması ve kullanılması için kurumunuzun kurallarına uymanız gerekir. Bu yöntem guanozin tetrafosfat sentezine ışık verebilir, ancak protein kinaz aktivitesi ve siklik diguanylate sentezi de dahil olmak üzere diğer fosfotransfer reaksiyonlarına da uygulanabilir.