Ultra Performanslı Sıvı Kromatografisi ile Bileşimsel Analiz için Bakteriyel Hücre Duvarlarının İzolasyonu ve Hazırlanması

Bu prosedürün genel amacı, farklı nöropeptitlerin kimliklerini ve nispi fraksiyonlarını belirlemek için bakteri hücre duvarlarını izole etmek ve sindirmektir. UPLC analizi kullanılarak bu, ilk olarak bakteri numunelerinin sodyum ekol sülfat içinde kaynatılarak parçalanmasıyla gerçekleştirilir. SDS'yi yıkadıktan sonra, ikinci adım, gram negatif bakterilerin dış zarını arındırmak için numuneleri pronaz E ile sindirmektir.

Daha sonra, peptidoglikanı bireysel nöropeptitlere çözündürmek için numuneler mease ile sindirilir. Son adım, nöropeptitleri azaltmak ve pH'ı nöropeptit izoelektrik noktasına ayarlamaktır. Sonuç olarak, UPLC, nöropeptitleri boyuta ve hidrofobikliğe göre ayırmak için kullanılır ve çapraz bağlanma derecesi ve ortalama glikan ipliği uzunluğu gibi önemli hücre duvarı özelliklerinin nicelleştirilmesini kolaylaştırır.

Bu yöntem, morfogenez, hücre duvarı mimarisi, bağışıklık sistemi aktivasyonu ve patogenez arasındaki ilişkiler gibi mikrobiyoloji alanındaki temel soruların cevaplarını ortaya çıkarmaya yardımcı olabilir. Bu yöntem gram-negatif Peptidil glikanı saflaştırmak için geliştirilmiş olsa da, birkaç enzim ilavesi ve kimyasal işlemlerle gram pozitif bakterilere de uygulanabilir: Bakteri kültürlerini geri büyütmek için, gece boyunca kültürleri bir ila 100 ila 250 mililitre taze ortam seyreltin ve seyreltilmiş kültürler büyürken 600 nanometrede istenen optik yoğunluğa kadar büyütün. Bir litrelik beherde sıcak bir plaka üzerinde kaynar su banyosu kurun.

Su kaynadıktan sonra, altı mililitre% 6 sodyum dyl sülfat veya SDS'yi 50 mililitrelik polipropilen tüplere alın. Her tüpe küçük bir karıştırma çubuğu ekleyin ve tüp kapaklarını parmakla sıkıca sıkın. Tüpleri kaynar su banyosuna yerleştirin ve sıcak plaka üzerinde 500 RPM'de karıştırın.

250 mililitrelik kültürleri, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 5.000 kez G'de döndürerek hasat edin. Peletleri üç mililitre ortamda veya bir x fosfat tamponlu tuzlu suda yeniden süspanse edin. Tüpler kaynar su banyosuna daldırılırken hücreleri bitlemek için% 6 kaynayan SDS ile hücre süspansiyonlarını 50 mililitrelik tüplere yavaşça pipetleyin ve kapakları parmaklarınızla sıkıca kapatın.

Kaynar su banyosunu örtün ve hücrelerin üç saat kaynamasına izin verin, su seviyesini periyodik olarak kontrol edin ve gerektiğinde su banyosunu yeniden doldurun. Üç saat sonra, sıcak plakadaki ısıyı kapatın ve gece boyunca 500 RPM'de karıştırmaya devam edin. SDS gece boyunca 50 mililitrelik tüplerde çökeldiyse, su banyosunu bir ila iki saat daha kaynatmaya ayarlayın.

Burada, normal bir kültürün gece boyunca parçalandıktan sonra nasıl görünmesi gerektiği gösterilmektedir. SDS'de, yağışla ilişkili opaklığın aksine şeffaflığa dikkat edin. Yüzüstü e tamponunu hazırlayın ve yüzüstü E'yi 60 santigrat derecede bir ısı bloğunda en az 30 dakika boyunca etkinleştirin.

Büyük peptol glikan veya PG makro moleküllerini peletlemek ve böylece bunları diğer hücresel bileşenlerden arındırmak için numuneleri oda sıcaklığında 20 dakika döndürmek için 400.000 kez G'ye ayarlanmış bir ultrasantrifüj kullanın. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve ardından her peleti oda sıcaklığında yeniden süspanse edin. Ultra saf su reçinesi süspansiyon hacmi, kullanılan ultrasantrifüj tüplerinin hacmine bağlıdır.

Tüpleri en az yarıya kadar dolduran, ancak tüplerin maksimum hacmini aşmayan bir hacim kullanın. Resus süspansiyonu sırasında su kabarcık oluşmayana kadar santrifüjleme ve yıkamayı tekrarlayın, bu noktada SDS'nin tamamen çıkarıldığını gösterir. Resus, numuneleri 900 mikrolitre tris HCL tamponunda askıya alır ve daha önce üst kısımlarında delikler bulunan iki mililitrelik tüplere aktarır.

Küçük bir iğne kullanarak, iki saat boyunca 60 santigrat derecede inkübe etmeden önce her numuneye 100 mikrolitre aktif pronaz E ekleyin. Her numuneye 200 mikrolitre% 6 SDS ekleyerek eğilimli hazımsızlığı durdurun ve numuneleri 100 santigrat derece ısı bloğunda 30 dakika kaynatın. Daha önce olduğu gibi, numuneleri oda sıcaklığında 20 dakika döndürmek için 400.000 kez G'ye ayarlanmış bir ultrasantrifüj kullanın ve son santrifüjleme yıkama adımında SDS tamamen çıkarılana kadar oda sıcaklığında ultra saf su ile yıkayın, numuneleri 200 mikrolitre 50 milimolar sodyum fosfat tamponunda tekrar askıya alın.

Bu hacim, numunedeki Pepto glikan miktarına göre ayarlanabilir ve türe bağlı olabilir. Örnek daha fazla pep glikan içeriyorsa, süspansiyon hacmini artırın. Numunede çok az peptit glikan varsa.

Reçine süspansiyon hacmini minimum 50 mikrolitreye düşürün. Numuneleri 1.5 mililitrelik tüplere aktarın ve mililitre başına 40 mikrogramlık bir nihai konsantrasyon elde etmek için mililitre başına bir miligram ekleyin. 37 santigrat derecelik bir ısı bloğunda altı ila sekiz saat veya gece boyunca inkübe edin.

UPLC için numune hazırlamak için, 100 santigrat dereceye kadar bir ısı bloğu açın. Mease sindirimi santrifüj numunelerini durdurmak için numuneleri 16.000 kez 10 dakika boyunca SDS olmadan beş dakika kaynatın. Oda sıcaklığında G.

Nöropeptitler şimdi süpernatanın içindedir. Süpernatanı 13 x 100 milimetre cam tüplere aktarın. Mümkün olduğu kadar çok süpernatanı kurtarmaya çalışın, damağa rahatsız etmeden çok yaklaşın.

100 milimolar borat tampon deliği sekiz tamponun nihai konsantrasyonu için numuneye 500 milimolar borat tamponu ekleyerek pH'ı ayarlayın, indirgeyici ajan ile uyumludur. Sodyum boro hidrit: Her numuneyi azaltmak için birkaç tane sodyum boro hidrit ekleyin ve reaksiyonun oda sıcaklığında en az 30 dakika ilerlemesine izin verin. Daha sonra, numuneleri 20 mikrolitrelik artışlarla orto fosforik asitli pH indikatör kağıdı ile ölçüldüğü gibi pH altıya ayarlayın, numune orto fosforik asit ilavesine yanıt olarak köpürmelidir.

Numune tipik olarak altı pH'a ulaşıldığında köpürmeyi durdurur. Ardından, iki mikrolitrelik artışlarla orto fosforik asit ile numuneleri pH üç ile dört arasında ayarlamaya devam edin. Numuneyi 0.22 mikronluk bir şırıngadan süzün.

Doğrudan A-U-P-L-C şişesine süzün. UPLC şişelerine aktarıldıktan sonra numunelerde bir çökelti oluşmuşsa, şişeleri bir alevden birkaç geçişle ısıtın. UPLC şişesini otomatik numune alma cihazına yerleştirin ve her numuneden 10 mikrolitre A-U-P-L-C cihazına enjekte edin.

Bir C 18 ters faz UPLC kolonu ve izlemek için ayarlanmış bir absorbans detektörü ile donatılmıştır. 202 ila 208 nanometre numuneler sırayla enjekte edilir. Akışı dakikada 0,25 mililitreye ayarlayın ve 30 dakika içinde %100 çözücü B ve sıralı nöropeptit E elde etmek için 25 dakika boyunca doğrusal bir gradyan kullanın.

UPLC'den sonra nöropeptitleri karakterize etmek için kütle spektrometresi kullanılacaksa, ilgilenilen zirvenin fraksiyonlarını bir fraksiyon toplayıcıda toplayın, fraksiyonları 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve daha sonra fraksiyonları bir santrifüj buharlaştırıcı kullanarak kurutun, fraksiyonlar MS analizinden önce tuzdan arındırılmalıdır. Bu tipik UPLC sonucunda. Zamanın bir fonksiyonu olarak 202 ila 208 nanometrede UV absorbansı ile algılama, belirli bir nöropeptit tutma süresi oluşturur.

Çoğu nöropeptit türü ile spektrum boyunca güçlü sinyal gücü arasında net bir çözünürlük gözlenir, bu da çapraz bağlanma derecesinin ortalama glikan ipliği uzunluğunun ve nöropeptitlerin kimliğinin ve konsantrasyonlarının analizini sağlar. Nöropeptitlerin C çökelmesini yansıtan örnek bir kromatogram burada gösterilmiştir. PG bileşimi hakkında herhangi bir veri bulunmamasına neden olan hiçbir tepe noktası ima edilmedi.

UPLC analizinden fark edilebilir piklerin olmaması, numunenin süper konsantre edilmesinin veya pH'ın nöropeptitlerin izoelektrik noktasının çok altına ayarlanmasının bir sonucu olarak ortaya çıkabilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik telaşlı da olsa üç gün içinde yapılabilir Bu prosedürü takiben düzgün bir şekilde gerçekleştirildi. Kütle spektrometresi gibi diğer yöntemler, geliştirilmesinden sonra kütleye dayalı olarak nöropeptit türlerini pozitif olarak tanımlamak için kullanılabilir.

Bu teknik, mikrobiyoloji alanındaki araştırmacıların, anahtar hücre duvarı enzimlerinin biyokimyasal işlevini ve çok çeşitli türlerde ve mutantlarda kimyasal inhibitörlerin etki şeklini keşfetmelerinin yolunu açtı.