Name: Damla Akış ve Döner Disk Reaktörler kullanın Staphylococcus aureus Biyofilm Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-27T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Öğrenin damla akış ve döner disk reaktörlerle Staphylococcus aureus biyofilm yetiştirme yöntemlerini. Bu protokoller yüksek biyokütle üretimi ve antimikrobiyal testler için idealdir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NIAID hibe K22AI081748.

1. Damla Akış Biyofilm Reaktörü <ol><li> Damla akış biyofilm reaktörü monte edilmiş ve otoklava (Biosurface Technologies ya da özel olarak tasarlanmış sürümleri mevcuttur genellikle üniversite makine atölyeleri tarafından yapılabilir, bkz. Şekil 1). Meclis odaları ve güvence odasına kapakları iliştirilmesi kupon içerir. Biyofilm orta (triptik soy broth 2 gram / L ve glukoz 2 gram / L) ve akma besin boru ile birlikte odası, otoklav ile sterilize edilir. </li><li> Damla akış reaktör, reaktör, düz bir yüzey üzerine yerleştirerek, atık su boru hatları sıkma, 10 ml triptik soy broth her ​​odasını doldurmak ve S. 10 mcL ekleyerek Aşılama preformed. aureus kültürü triptik soy broth gecede büyüdü. Inoküle reaktör daha sonra 18 saat boyunca 37 ° C inkübatör yerdir. </li><li> 18 saat inkübasyondan sonra, atık su boru unclamped ve reaktör, 10 derecelik açıyla kesilmiş ahşap bir blok üzerine yerleştirilir. </li><li> Aseptik sürekli akış besin suyu şişesi gibi geleneksel besin hortumu bağlayın. Maksimum hız (pompa modeline göre değişir) pompa çalıştırarak, pompa ve başbakan tüpler aracılığıyla boru hattı besleyin. </li><li> Akma boru, pompa durdurmak ve her tüp sonuna kadar bağlantı iğne (22 gauge, 1 inç) eklemek astarlanmalıdır. Etanol silin ve aseptik giriş stoper üzerinden iğne eklemek odasına giriş stoper silin. </li><li> Pompa açın ve kuponlar üzerinde (akış hızı ~ 125 mcL / dakika) medya yavaş yavaş damla izin. Medya giriş stoper limandan çıkış portuna kupon boyunca aşağıya doğru akmalıdır. Bazen uygun drenaj için reaktör kontrol, 2-5 gün (uygulamaya bağlı olarak) sürekli akış reaktör çalıştırın. </li><li> Damla akış reaktör biyofilm hasat için, pompayı durdurun ve reaktör dikkatle iğneleri çıkarın. Reaktör daha sonra düz bir yüzeye yerleştirilir ve kuponlar aseptik olarak steril forseps kullanılarak silinebilir. Mikroskopi isteniyorsa, kuponlarını buna göre işlenmiş olabilir (Şekil 2B bir damla biyofilm reaktörde yetişen bir S. aureus biyofilm bir tarama elektron mikrografı). Biyofilm biyokütle veya fizyoloji çalışmaları ölçümü çalışmanın amacı ise, biyofilm bir hücre kazıyıcı kullanarak kupon silinebilir. Forseps ile kupon tutarken, fosfat içeren konik bir tüp içine yavaşça kupon kapalı biyofilm kazımak bir hücre kazıyıcı kullanarak tamponlu salin. Not: biyofilm koloni oluşturan birim ölçmek için, kümeleri parçalara ayırma ve homojen bir süspansiyon formu Homojenizatör bir doku ile hasat biyofilm homojenize gereklidir. Çeşitli modeller doku homojenizatörler bu uygulama için uygundur. Biyofilm örnekleri homojenize 1 dakika boyunca tam hızda bir Fisher Scientific Tissuemiser Homojenizatör (ürün # 15-338-420) kullanmaktadır. Biyofilm homojenize yapılmaması örnek mevcut birimleri oluşturan koloni küçümsenmesi neden olacaktır. </li></ol> 2. Döner Disk Biyofilm Reaktörü <ol><li> Dönen disk biyofilm reaktörü (yapılan bkz. Şekil 3 Biosurface Teknolojileri temin edinilebilir veya özel olabilir) toplandı ve otoklava. Ilk etapta reaktör birleştirin yuvalarına dönen diskin disk kupon iplik ve bir taşma bağlantı noktası ile 1 litrelik cam beher içine yerleştirerek. Medya akış ve havalandırma sağlamak için delikli bir dizi 15-lastik tıpa reaktör kap olarak kullanılır. Reaktör, biyofilm medya (triptik soy broth 2 g / L ve glukoz 2 g / L), ve giriş boruları, daha sonra otoklav ile sterilize edilir. </li><li> Dönen disk biyofilm reaktör, reaktör içine 250 mL steril ortamda koyarak inoküle ve bir gecede S. 0,5 mL ekleyerek aureus kültürü triptik soy broth yetiştirilen. Reaktör sonra, 250 rpm bir heyecan plaka üzerine yerleştirilir ve istenilen sıcaklıkta gece inkübe edilir. </li><li> 16 saat inkübasyondan orta rezervuar giriş boru bağlantı noktasına bağlamak ve peristaltik pompa bağlamak sonra. Pompa daha sonra açmak ve akış ~ 0.25 ml / dak (akış istenilen büyüme hızına bağlı olarak değiştirilebilir). </li><li> 24 saat sonra reaktör durdurmak ve aseptik biyofilm kupon dokunmadan diski çıkarın. Kuponları steril forseps kullanarak çıkarın ve fosfat içine her bir dip gevşek bağlı herhangi bir bakteri kaldırmak için tamponlu salin. </li><li> Antimikrobiyal bileşik testi için, cips ilgi bileşikleri içeren bir 96 plaka ayrı ayrı kuyu içine yerleştirilir. Inkübasyondan sonra, cips, 1 ml fosfat tamponu tuzlu su içeren 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine aktarılır ve bir doku bozulmadan biyofilm dağıtmak için homojenizatör ile homojenize. </li><li> Hücreler daha sonra seri seyreltilmiş ve canlı koloni formi belirlemek için besin agar üzerine kaplamang birimleri. </li><li> Not: Yukarıdaki protokol çok varyasyon yapılabilir. Örneğin, dönen disk kuponlar ile kaplı olabilir ya da etkinliğini test etmek için potansiyel anti-biyofilm bileşikler yapılmış. Biyofilm dispersant dağıtıcı bileşikler ve ekli karşı müstakil bakteri miktarının belirlenmesi kupon kuluçka olarak değerlendirilebilir. </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1 ise damla akış reaktör kadar bir dizi bir örnek gösterilmiştir. Biyofilm bol miktarda akışı üç gün sonra, kupon yüzeyi, Şekil 2A üzerinde birikir. Toplam biyokütle bakteri suşu ve hassas bir büyüme şartlarına bağlı olarak değişir. S. taramalı elektron mikrografı Şekil 2B damla akış reaktör yetiştirilen aureus biyofilm gösterilmiştir. Dönen bir disk reaktör rakam 3A gösterilmiştir. Açıklanan protokol, bir biyofilm oluşturma yeteneğine sahip, genellikle herhangi bir mikroorganizmanın özel gereksinimlerine adapte edilebilir. Şekil 3B 18 plastik diskler yapıştırılmış iplik disk gösterir. Bu disk yetiştirilen biyofilm, özellikle de antibiyotik testi için uygun ve yüksek tekrarlanabilir sonuçlar 11 verim . <img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 damla akım reaktöründe kurulum. Önemli bileşenleri etiketlenir. <img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2: Örnek bir damla akışı S. aureus biyofilm. A) Bu biyofilm açıklanan protokol izleyen üç gün için yetiştirilir. Kapaklar reaktörün ilk iki odalarından sarı S. göstermek için kaldırılır aureus biyofilm biyokütle. S. B) Sacnning elektron mikrografı aureus biyofilm damla akış reaktöründe büyüdü. <img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 Dönen disk reaktör. A) Örnek dönen disk çalışan bir reaktör. Anahtar bileşeni olarak etiketlenir. B) dönen bir disk kapatın.

<ol><li>Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial Biofilms.</a> Annu. Rev. Microbiol. 49, 711-745 (1995).</li>
<li>Costerton, J. W., Cheng, K. J., Gessey, G. G., Ladd, T. I., Nickel, J. C., Dasgupta, M., Marrie, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms+in+nature+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms in nature and disease.</a> Ann. Rev. Microbiol. 41, 435-464 (1987).</li>
<li>O'Toole, G. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+biofilm+formation+in+Pseudomonas+fluorescens+WCS365+proceeds+via+multiple%2C+convergent+signaling+pathways%3A+a+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Micro%22%5BJournal%5D)">Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signaling pathways: a genetic analysis.</a> Mol. Micro. 28, 449-461 (2002).</li>
<li>Boles, B. R., Horswill, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agr-mediated+dispersal+of+Staphylococcus+aureus+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Agr-mediated dispersal of Staphylococcus aureus biofilms.</a> PLoS Pathog. 4, e1000052-e1000052 (2008).</li>
<li>Goeres, D. M., Haamilton, M. A., Beck, N. A., Buckingham-Meyer, K., Hilyard, J., Loetterle, L. A., Walker, D. K., Stewart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+growing+a+biofilm+under+low+shear+at+the+air-liquid+interface+using+the+drip+flow+biofilm+reactor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor.</a> Nature Protocols. 4, 783-788 (2009).</li>
<li>Fu, W., Forster, T., Mayer, O., Curtin, J. J., Lehman, S. M., Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+cocktail+for+the+prevention+of+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa+on+catheters+in+an+in+vitro+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage cocktail for the prevention of biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa on catheters in an in vitro model system.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54, 397-404 (2010).</li>
<li>Xu, K. D., McFeters, G. A., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+resistance+to+antimicrobial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilm resistance to antimicrobial agents.</a> Microbiology. 146, 547-549 (2000).</li>
<li>Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+physiological+heterogeneity+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+is+determined+by+oxygen+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64, 4035-4039 (1998).</li>
<li>Boles, B. R., Thoendel, M., Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-generated+diversity+produces+%22insurance+effects%22+in+biofilm+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Self-generated diversity produces "insurance effects" in biofilm communities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 16630-16635 (2004).</li>
<li>Pitts, B., Willse, A., McFeters, G. A., Hamilton, M. A., Zelver, N., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+repeatable+laboratory+method+for+testing+the+efficacy+of+biocides+against+toilet+bowl+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A repeatable laboratory method for testing the efficacy of biocides against toilet bowl biofilms.</a> J. Appl. Microbiol. 91, 117-11 (2001).</li>
<li>Boles, B. R., Thoendel, M., Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhamnolipids+mediate+detachment+of+Pseudomonas+aeruginosa+from+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rhamnolipids mediate detachment of Pseudomonas aeruginosa from biofilms.</a> Mol. Microbiol. 57, 1210-1223 (2005).</li>
<li>Hentzer, M., Teitzel, G. M., Balzer, G. J., Heydorn, A., Molin, S., Givskov, M., Parsek, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+overproduction+affects+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function.</a> J. Bacteriol. 183, 5395-5401 (2001).</li>
<li>Lin, H. Y., Chen, C. T., Huang, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+merocyanine+540+for+photodynamic+inactivation+of+Staphylococcus+aureus+planktonic+and+biofilm+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of merocyanine 540 for photodynamic inactivation of Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6453-6458 (2004).</li>
</ol>

Farklı reaktörler yetiştirilen Biyofilmler genellikle farklı özelliklere sahip olacak ve her reaktör farklı uygulamalar vardır. Bir damla akış biyofilm reaktörü ve dönen bir disk reaktör: Bu çalışmada, iki biyofilm reaktörlerin kullanımı açıklanmaktadır. Damla akış reaktörleri düşük bir hava-sıvı arayüzü kesme biyofilm yetiştirmek için yararlı olan ve çeşitli koşullara uyarlanabilir. Biz büyük bir miktarda biyofilm biyokütle arzu edilir çalışmaları için son derece kullanışlı bulabilirsiniz. Bu kurulum mikrosensor potans...

Erratum: The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

<table><tbody><tr><td>Damla Akış Reaktörleri</td><td>BioSurface Technologies Corporation</td><td>DFR 110</td><td></td></tr><tr><td>Dönen Disk Reaktörleri</td><td>BioSurface Technologies Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

damla akış ve döner disk reaktörler kullanın staphylococcus aureus biyofilm analizi

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Doğada en çok mikrop 1 Bakteriyel biyofilm bir matriks içinde kaplı. Biyofilm yüzey ile ilişkili topluluklar gibi mevcut düşünce ve bir yüzey 2 Biyofilm oluşumu ve gelişimi bağlı yaygın microtiter plakalar veya akış gibi toplu sistemlerini kullanarak laboratuvarda incelenir sistemleri, akış hücreleri gibi. Bu metodolojileri mutant ve kimyasal kütüphaneleri (microtiter plakalar) görselleştirme (akış hücreleri) 4 için 3 ya da büyüyen biyofilm tarama için yararlıdır. Damla akışı biyofilm reaktörü ve dönen disk biyofilm reaktörü: Burada iki ek tip akış sistemi biyofilm büyüyen Staphylococcus aureus için ayrıntılı protokolleri mevcut. Damla akış biyofilm reaktörleri düşük kesme koşulları altında yetiştirilen biyofilm çalışma için tasarlanmış dört paralel test kanalları, her bir standart cam mikroskop lamı büyüklüğünde kupon tutma kapasitesine sahip, ya da bir kateter ya da çalıştıktan uzunluğu 5 damla akış reaktör oluşur . Damla akış reaktör mikrosensor izleme, genel biyofilm çalışmaları, biyofilm cryosectioning örnekleri, yüksek biyokütle üretimi, tıbbi malzeme değerlendirmeler ve kalıcı bir tıbbi cihazın denenmesi için idealdir. 6,7,8,9 Dönen disk reaktör, çıkarılabilir kuponlar için girinti içeren bir teflon disk oluşur. Çıkarılabilir 10 kupon yazan işlenebilir herhangi bir malzemeden yapılmış olabilir. Dönen disk alt diskin dönme yüzey yıkama kuponlar arasında sıvı yüzey kesme oluşturmak için izin veren bir çubuk mıknatıs içerir. 18 kupon içeren tüm disk, 1000 ml&#39;lik cam yan kol reaktör damar yerleştirilir. Disk, manyetik karıştırıcı ile döndürülmüş ise sıvı bir büyüme ortamı gemi dolaşıyor. Kupon reaktör damarı çıkarılmış ve ardından daha fazla çalışma veya mikroskopi görüntüleme biyofilm örnek toplamak için kazınır. Döner disk reaktörler biyosit etkinlik, biyofilm kaldırılması ve anti-kirlenme malzemeleri performans laboratuvar değerlendirmeler için tasarlanmıştır. 9,11,12,13

Damla akış reaktörleri, açık sistem akış biyofilm kullanan ve diski reaktörler dönen için Protokoller ayrıntılı olarak sunulmuştur.

Damla Akış ve Döner Disk Reaktörler kullanın Staphylococcus aureus Biyofilm Analizi

Doğadaki çoğu mikrobun, biyofilmlerde yüzeyle ilişkili topluluklar şeklinde var olduğu düşünülmektedir.1 Bakteriyel biyofilmler, bir matriks içine hapsolmuş durumdadırlar ve ...

Bu prosedürün genel amacı, damla akışlı biyofilm reaktörü veya döner disk reaktörü kullanılarak düşük veya orta düzeyde kayma kuvveti altında bakteriyel biyofilmler büyütmektir. Biyofilm reaktörlerindeki kuponlar, önce bakterilerle inoküle edilir ve bakteriyel hücrelerin büyüme yüzeylerine tutunmalarını sağlamak için 37 °C'de inkübe edilir. Hücreler kuponlara tutunduktan sonra, biyofilm gelişimi sırasında etki eden bir kayma kuvveti oluşturan büyüme besiyeri akışı başlatılır.Olgun biyofilmler daha sonra analiz ve biyofilmlerin gözlemi için toplanabilir. Üretilen biyofilmlerin ultrastrüktürünü belirlemek için taramalı elektron mikroskobu kullanılabilir. Ben Blaze Balls.Bu tekniğin akış hücreleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, yüksek biyokütle üretiminin ve çok sayıda özdeş biyofilmin kolaylıkla elde edilebilmesidir. Bu prosedürü, laboratuvarımdan bir teknisyen ve lisansüstü öğrencisi olan Rachel Stevenson ve Kelly Schwartz uygulamalı olarak gösterecekler. Damla akışlı biyofilm reaktörü, besiyeri girişi için giriş portları ve atık çıkışı için çıkış portları olan dört odacıktan oluşur.Her bir bölmenin içinde, biyofilmin üzerinde büyüdüğü çıkarılabilir bir kupon bulunur. Damlama akışlı biyofilm reaktörünü kurmak için, kuponları her bir paralel bölmeye yerleştirin ve bölme kapaklarını sabitleyin. Sistemi kullanmadan önce sterilize etmek için kurulu reaktörü ve besin giriş tüplerini otoklavlayın.Sterilize edilmiş damla akış reaktörünü inoküle etmek için biyofilm büyüme besiyerini de otoklavlayın. Cihazı düz bir yüzeye yerleştirin ve çıkış hatlarını kelepçeleyin. Ardından, her bir bölmeyi 10 milliliters sterile triptiç soya brok bazlı büyüme besiyeri ile doldurun ve 100 microliters staphylococcus aureus ekleyin.Gece boyu kültür, her bir bölmeye ayrı ayrı aynı ortamda büyütülür. Hücrelerin kupon yüzeyine tutunmasını sağlamak için inoküle edilen reaktörü 37 °C'lik bir inkübatöre 18 saat boyunca yerleştirin. İnkübasyonun ardından, çıkış borusunu klempleyin ve reaktörü 10 derecelik bir açıyla eğimli ahşap bir blok üzerine yerleştirin. Aseptik olarak.Akışkan besiyeri tüpünü, sürekli akışlı besiyeri içeren bir şişeye bağlayın. Tüp hattını pompanın içinden geçirin ve pompayı tam hızda çalıştırarak tüpteki havayı boşaltın. Akışkan tüplerdeki hava boşaltıldıktan sonra pompayı durdurun ve her tüpün ucuna 22 gauge bir inçlik iğneler takın.Kamar giriş tıpasına etanolle aseptik bir şekilde silme işlemi uygulayın. İğneleri giriş tıpası üzerinden içeri yerleştirin. Pompayı çalıştırın ve besiyerinin kuponların üzerine damlamasını sağlayın.Yaklaşık 125 µL/dakika akış hızında, besiyeri giriş tıpası portundan çıkış portuna doğru aşağı doğru akmalıdır. Reaktörü üç gün boyunca sürekli akış modunda çalıştırın. Bu sırada reaktörü uygun drenaj açısından ara ara kontrol edin.Besiyerinin odacıklarda birikmediğinden emin olmak için odacıklar görsel olarak kontrol edilerek drenaj denetlenir. Eğer besiyeri birikiyorsa, çıkış tüpünü sıkıştırmak genellikle biyofilmleri hasat etmek için uygun drenajı teşvik eder; pompayı durdurun ve iğneleri reaktörden çıkarın. Ardından reaktörü düz bir yüzeye yerleştirin.Üç günlük sürekli akışın ardından, Staphylococcus aureus biyofilmleri, inoküle edilen kuponların uzunluğu boyunca yayılmış sarı biyokütleler olarak görülür. Biyofilmin taramalı elektron mikroskobu görüntüsü, Staphylococcus aureus'un kuponu yüzeyle ilişkili bir biyofilm topluluğu şeklinde kapladığını ortaya koyar. Elde edilen biyokütleyi nicelleştirmek için, steril pensler kullanarak kuponları aseptik bir şekilde çıkarın, bakterileri bir hücre kazıyıcı kullanarak toplayın ve ardından bunları beş mililitre steril PBS içeren konik bir tüpe aktarın.Bir doku homojenizatörü kullanarak, homojen bir süspansiyon elde edilene kadar bakteriyel kümeleri dağıtın. Koloni oluşturan birimler, seri dilüsyonların triptik soya agar plaklarına ekilmesi, 37 °C'de 24 saat boyunca inkübe edilmesi ve kolonilerin sayılmasıyla belirlenir. Döner disk biyofilm reaktörü, içinden büyüme ortamının pompalandığı bir kemostattan oluşur.Yıldız çubuklu bir döner disk ve döner diske uyacak şekilde tasarlanmış 18 kupon. Reaktörü monte etmek için öncelikle döner disk kuponlarını döner diskin yuvalarına yerleştirin. Ardından, yüklü diski taşma portuna sahip bir litrelik bir cam behere yerleştirin ve reaktörü, biri medya akışı ve diğeri havalandırma için bir deliğe sahip 15 numara bir kauçuk tıpa ile kapatın.Sistemi sterilize etmek için otoklavda kurulu reaktörü ve giriş borularını sterilize edin. Reaktörü inoküle etmek için, beheri 250 milliliters steril kültür ortamı ile doldurun ve triptych soy broth içerisinde büyütülmüş staphylococcus aureus gecelik kültüründen 500 microliters ekleyin. Reaktörü dakikada 250 devir olarak ayarlanmış bir manyetik karıştırıcı üzerine yerleştirin ve hücrelerin kuponlara yapışmasını sağlamak için 37 degrees Celsius sıcaklıkta gecelik olarak inkübe edin.Gece boyu inkübasyonun ardından, giriş borusunu besiyeri rezervuarındaki porta ve peristaltik pompaya bağlayın. Pompayı çalıştırın ve akışı 0.25 milliliters per minute olarak ayarlayın. Oluşan biyofilmleri toplamak için reaktörün 37 degrees Celsius'de 24 saat boyunca çalışmasına izin verin.Reaktörü durdurun ve aseptik koşullarda işlemi gerçekleştirin. Kuponlara dokunmadan diski çıkarın. Steril pensler kullanarak kuponları çıkarın ve antimikrobiyal bileşik testi için gevşekçe tutunmuş bakterileri temizlemek amacıyla her birini dikkatlice steril PBS içine daldırın.Kuponları, ilgilenilen bileşikleri içeren 96 kuyucuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına aseptik olarak yerleştirin. Plakayı 37 °C'de dört saat boyunca inkübe edin. Ardından kuponları, 1x PBS içeren 1,5 mL'lik mikro santrifüj tüplerine aktarın ve biyofilmleri bir homogenizatör kullanarak dağıtın.Son olarak, örnek başına canlı koloni oluşturan birim sayısını belirlemek için, daha önce açıklanan şekilde hücrelerin seri dilüsyonlarını besiyeri agar ortamına ekiniz. Bu grafik, dönen disk reaktörü kullanılarak hazırlanan ve hidrojen perokside maruz bırakılan biyofilmlerdeki koloni oluşturan birim sayısını ve 18 adede kadar özdeş biyofilm üretme kapasitesini göstermektedir. Dönen disk reaktörünün kullanımı, bu tekniği antimikrobiyal bileşik testleri için ideal hale getirmektedir.Bu videoyu izledikten sonra, damla akışlı (drip flow) ve döner diskli reaktör biyofilmlerinin nasıl çalıştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bu biyofilm reaktörleri, akış hücresi ve mikrotitrasyon plakası biyofilmlerine alternatifler sunar ve yüksek miktarda biyofilm biyokütlesine ihtiyaç duyulduğunda veya yerleşmiş biyofilmler üzerinde antimikrobiyal testler yapılmak istendiğinde idealdir.

the-use-drip-flow-rotating-disk-reactors-for-staphylococcus-aureus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Protokolü Konfokal Lazer Tarama Mikroskobu (CLSM) mikrobiyal biyofilm büyüyen ve analiz etmek için bir akış hücresi sistemi uygulama nitelendirdi.

Pseudomonas aeruginosa ve Saccharomyces cerevisiae Biyofilm Akış Hücreler

Bu videoda, poli-L-Lizin kaplı çok kuyulu bir plakada S. aureus tarafından in vitro biyofilmin hazırlanmasını gösteriyoruz. Biyofilm biçimli plaka, sonraki deneyler için kullanılabilir.

Staphylococcus aureus ile İn Vitro Biyofilm Sentezi

Biyofilmlerin çevreleriyle karmaşık etkileşimleri vardır. Biyofilm-çevre etkileşimlerini kapsamlı bir şekilde araştırmak için, burada biyofilm gelişimi için heterojen kimyasal ortam oluşturmak, yerel akış hızını ölçmek ve biyofilm kolonileri içinde ve çevresinde kütle taşınmasını analiz etmek için bir dizi yöntem sunuyoruz.

Biyofilm ve Habitat Heterojen Eş-geliştirme karakterize Yöntemleri

Çoğu bakteriyel enfeksiyon bir biyofilm üretir. Çevreleri nedeniyle, biyofilm ile ilişkili bakteriler genellikle fenotipik olarak ilaca dirençlidir. Biyofilmlerdeki bakterileri öldüren yeni antibakteriyel moleküller bu nedenle yüksek bir önceliğe sahiptir. Biyofilmleri yok etmede etkili olan antimikrobiyal bileşikleri hızlı bir şekilde taramak için bir test oluşturuyoruz.

Biyofilm İlişkili Hedefleme<em&gt; Staphylococcus aureus</emKullanma&gt; Resazurin Tabanlı İlaç-duyarlılık Deneyi

Biz derleme işlemi, tarif ve gerçek zamanlı akış iken altında görüntü mantar biyofilm oluşumu için bir akış cihazları temizlik tasarlanmış. Biz de sağlamak ve elde edilen görüntülerde kullanılmak üzere sayısal algoritmalar tartışıyorlar.

Gerçek zamanlı görüntüleme ve miktar iki aşamalı dolaşım akış sistemi kullanarak mantar biyofilm gelişimi

Burada, Pseudomonas aeruginosa biyofilmler araç da dahil olmak üzere yeşil flüoresan proteinler ifade üzerinde kesme stres etkileri analizi için floresan mikroskop ile birleştiğinde bir akışı sağlayarak daha yüksek mikrosıvısal biyoreaktör kullanımını açıklar biyofilm kapsamı, büyüme oranı ve morfolojik özellikleri belirlenmesi, ayarla.

Canlı hücre analizi, yamultma stres bir otomatik yüksek üretilen iş mikrosıvısal sistemi kullanarak Pseudomonas aeruginosa

Bu yazıda, iki yüzey tipinde üç yaygın biyofilm toplama ve ayrıştırma tekniğini gösteren yöntemler, bir hasat yönteminin sağlamlık testi ve tekrarlanabilirliği artırmak için hasat ve ayrıştırma tekniklerini seçerken ve optimize ederken göz önünde bulundurulması gereken minimum bilgiler açıklanmaktadır.

Hasat ve Ayrıştırma: Biyofilm Yöntemleri Araştırmalarında Gözden Kaçan Bir Adım

Bu protokol, yüksek verimli 96 kuyulu sabitlenmiş kapak statik biyofilm taraması için kendinden montajlı derin kuyu PCR plakalı cihazları kullanarak biyofilm büyümesi ve biyokütle ölçümleri yapmak için metodoloji sunar.

PCR-Plate Deep Well Microplate Cihazları Kullanılarak Daha Büyük Bakteriyel Biyofilm Biyokütlesinin Oluşturulması

Bu protokol, süt endüstrisinde biyofilmlerin eradikasyonunda organik peroksiasitlerin etkinliğini değerlendirmek için statik ve dinamik yöntemleri birleştiren bir yaklaşımı açıklamaktadır. Bu yaklaşım, biyofilmleri kontrol etmek için yeni biyolojik veya kimyasal formülasyonların etkinliğini test etmek için de kullanılabilir.

Organik Peroksiasitlerin Süt Biyofilmlerinin Eradikasyonunda Etkinliğinin Statik ve Dinamik Yöntemleri Birleştiren Bir Yaklaşım Kullanılarak Değerlendirilmesi

Murin deri ve yumuşak doku enfeksiyonu modeli metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA) ve ev sahibi immünolojik yanıtlar virülans fonksiyonu değerlendirmek için kullanılmaktadır. Burada, biz, deri ve yumuşak doku enfeksiyonu için bir deri altı enfeksiyon modeli sundu.

Subkutan Enfeksiyon Metisiline Dirençli Stafilokok Aureus (MRSA)

Öğrenin damla akış ve döner disk reaktörlerle Staphylococcus aureus biyofilm yetiştirme yöntemlerini. Bu protokoller yüksek biyokütle üretimi ve antimikrobiyal testler için idealdir.

Damla Akış ve Döner Disk Reaktörler kullanın Staphylococcus aureus Biyofilm Analizi

Daha fazla video keşfet