Damla Akış ve Döner Disk Reaktörler kullanın Staphylococcus aureus Biyofilm Analizi
December 27th, 2010
Damla akış reaktörleri, açık sistem akış biyofilm kullanan ve diski reaktörler dönen için Protokoller ayrıntılı olarak sunulmuştur.
Bu prosedürün genel amacı, bir damla akışlı biyofilm reaktörü veya dönen bir disk reaktörü kullanarak düşük veya orta derecede saf kuvvet altında bakteriyel biyofilmleri büyütmektir. Biyofilmdeki kuponlar ilk olarak bakterilerle aşılanır ve bakteri hücrelerinin büyüme yüzeylerine yapışmasını sağlamak için 37 santigrat derecede inkübe edilir. Hücreler kuponlara bağlandıktan sonra, biyofilm gelişimi sırasında çalışan saf bir kuvvet üreten bir büyüme ortamı akışı başlar.
Olgun biyofilmler daha sonra biyofilmlerin analizi, gözlemi için hasat edilebilir. Üretilen biyofilmlerin ultra yapısını belirlemek için taramalı elektron mikroskobu kullanılabilir. Ben Blaze Balls.
Akış hücreleri gibi mevcut yöntemlerin bu tekniğinin temel avantajı, yüksek biyokütle üretiminin ve çoklu özdeş biyofilmlerin kolayca elde edilmesidir. Bu prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir teknisyen ve yüksek lisans öğrencisi olan Rachel Stevenson ve Kelly Schwartz olacak. Damla akışlı biyofilm reaktörü, ortam girişi için giriş portları ve atık çıkışı için çıkış portları olan dört odadan oluşur.
Her odanın içinde, biyofilmin üzerinde büyüdüğü çıkarılabilir bir kupon bulunur. Damlama akışlı biyofilm reaktörünü monte etmek için kuponları her bir paralel odaya yerleştirin ve oda kapaklarını sabitleyin. Kullanmadan önce sistemi sterilize etmek için monte edilmiş reaktörü ve akıcı besin borusunu otoklavlayın.
Ayrıca sterilize edilmiş damla akış reaktörünü aşılamak için biyofilm büyüme ortamını otoklavlayın. Cihazı düz bir yüzeye yerleştirin ve atık su hatlarını sıkıştırın. Daha sonra, her odayı 10 mililitre steril triptik soya suyu bazlı büyüme ortamı ile doldurun ve 100 mikrolitre staphylococcus aureus ekleyin.
Gece boyunca kültür, aynı ortamda her odaya ayrı ayrı büyütülür. Hücrelerin kupon yüzeyine yapışmasını sağlamak için aşılanmış reaktörü 18 saat boyunca 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin. İnkübasyondan sonra, UNC atık su borusunu sıkıştırın ve reaktörü 10 derecelik bir açıyla eğimli bir ahşap blok kesiciye yerleştirin. Aseptik olarak.
Akıcı besin hortumunu sürekli akışlı besin suyu içeren bir şişeye bağlayın. Boru hattını pompadan geçirin ve pompayı tam hızda çalıştırarak boruyu doldurun. Akıcı boru doldurulduktan sonra, pompayı durdurun ve her tüpün ucuna 22 gauge bir inçlik iğneler takın.
Hazne giriş durdurucusunu bir etanol mendille ve aseptik olarak silin. İğneleri giriş durdurucusundan geçirin. Pompayı açın ve ortamın kuponların üzerine damlamasına izin verin.
Dakikada yaklaşık 125 mikrolitrelik bir akış hızında, ortamın giriş durdurucu portundan atık su portuna aşağı doğru akması gerekir. Reaktörü üç gün boyunca sürekli akışta çalıştırın. Ara sıra reaktörü uygun drenaj için kontrol edin.
Drenaj, ortamın odalarda birikmediğinden emin olmak için odaların görsel muayenesi ile kontrol edilir. Ortam birikiyorsa, sıkışıyorsa, çıkış borusu genellikle biyofilmleri toplamak, pompayı durdurmak ve iğneleri reaktörden çıkarmak için uygun drenajı teşvik edecektir. Ardından reaktörü düz bir yüzeye yerleştirin.
Üç günlük sürekli akıştan sonra, staphylococcus aureus biyofilmleri, aşılanmış kuponların uzunluğu boyunca yayılmış sarı biyokütle olarak görünür. Biyofilmin taramalı elektron mikrografı, yüzeyle ilişkili bir biyofilm topluluğunda kuponu kaplayan staphylococcus aureus'u ortaya çıkarır. Elde edilen biyokütleyi ölçmek için, septik olarak steril forseps kullanın, kuponları çıkarın, bakterileri bir hücre kazıyıcı kullanarak hasat edin, ardından bunları beş mililitre steril PBS içeren konik bir tüpe aktarın.
Homojenizatör, bir doku kullanarak, homojen bir süspansiyon elde edilene kadar bakteri kümelerini ayrıştırır. Koloni oluşturan birimler, seri seyreltmelerin triptik sogar plakaları üzerine kaplanması, 37 santigrat derecede 24 saat inkübe edilmesi ve kolonilerin sayılmasıyla niceliklendirilir. Dönen disk biyofilm reaktörü, içinden büyüme ortamının pompalandığı bir kemos statından oluşur.
Dönen diske sığacak şekilde tasarlanmış bir yıldız çubuğu ve 18 kuponu olan bir dönen disk. Önce reaktörü monte etmek için, dönen disk kuponlarını dönen diskin yuvalarına yükleyin. Ardından, yüklü diski taşma portu olan bir litrelik cam kabın içine yerleştirin ve reaktörü, ortam akışı için bir delik ve havalandırma için bir delik bulunan 15 numaralı bir lastik tıpa ile kapatın.
Sistemi sterilize etmek için otoklav, monte edilmiş reaktör ve giriş borusu. Reaktörü aşılamak için, kabı 250 mililitre steril kültür ortamı ile doldurun ve triptik soya suyunda yetiştirilen bir gece boyunca staphylococcus aureus kültüründen 500 mikrolitre ekleyin. Reaktörü dakikada 250 dönüşe ayarlanmış bir karıştırma plakasına yerleştirin ve hücrelerin kuponlara yapışmasını sağlamak için gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Gece boyunca inkübasyonun ardından, giriş borusunu orta rezervuardaki porta ve peristaltik pompaya bağlayın. Pompayı açın ve akışı dakikada 0,25 mililitreye ayarlayın. Elde edilen biyofilmleri toplamak için reaktörün 37 santigrat derecede 24 saat çalışmasına izin verin.
Reaktörü durdurun ve aseptik olarak. Kuponlara dokunmadan diski çıkarın. Steril forseps kullanarak, kuponları çıkarın ve antimikrobiyal bileşik testi için gevşek bir şekilde bağlanmış bakterileri çıkarmak için her birini dikkatlice steril PBS'ye batırın.
Aseptik olarak, kuponları, ilgilenilen bileşikleri içeren 96 oyuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına yerleştirin. Plakayı 37 santigrat derecede dört saat inkübe edin. Daha sonra kuponları bir kez PBS içeren 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın ve biyofilmleri bir homojenizatör kullanarak dağıtın.
Son olarak, daha önce tarif edildiği gibi numune başına canlı koloni oluşturan birimlerin sayısını belirlemek için hücrelerin besleyici agar ortamı üzerindeki plaka seri seyreltmeleri. Bu grafik, eğirme diski reaktörü kullanılarak hazırlanan ve hidrojen peroksite maruz bırakılan biyofilmlerdeki koloni oluşturan birimlerin sayısını, 18 adede kadar özdeş biyofilm üretme yeteneğini göstermektedir. Eğirme diski reaktörünün kullanılması, bu tekniği antimikrobiyal bileşik testi için ideal hale getirir.
Bu videoyu izledikten sonra, damla akışı ve dönen disk reaktör biyofilmlerinin nasıl çalıştırılacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu biyofilm reaktörleri, akış hücresi ve mikrotitre plaka biyofilmlerine alternatifler sunar ve yüksek miktarda biyofilm biyokütlesine ihtiyaç duyulduğunda veya kurulu biyofilmler üzerinde antimikrobiyal test istendiğinde idealdir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, damla akış reaktörleri ve döner disk reaktörleri kullanarak bakteriyel biyofilmlerin yetiştirilmesi için protokolleri sunmaktadır. Prosedürler, kuponların bakterilerle inokülasyonunu ve ardından kontrollü kesme kuvvetleri altında biyofilmlerin gelişimini detaylandırmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Biyofilm Mühendisliği
- Biyoteknoloji
Arka Plan
- Bakteriyel biyofilmler, yüzeylere yapışan karmaşık topluluklardır.
- Biyofilm gelişimini anlamak çeşitli uygulamalar için kritik öneme sahiptir.
- Kesme kuvvetleri biyofilmlerin yapısını ve işlevini etkiler.
- Farklı reaktör tasarımları biyofilm büyüme dinamiklerini etkileyebilir.
Çalışmanın Amacı
- Biyofilm büyümesi için ayrıntılı protokoller sağlamak.
- Damla akış ve döner disk reaktörlerin etkinliğini karşılaştırmak.
- Mature biyofilmlerin analizini kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Kuponların bakteri hücreleri ile inokülasyonu.
- Yapışma için 37 derece Celsius'ta inkübasyon.
- Gelişimin sırasında kesme kuvvetleri oluşturmak için büyüme ortamının akışı.
- Biyofilm analizi için taramalı elektron mikroskobu.
Ana Sonuçlar
- Belirtilen koşullar altında bakteriyel biyofilmlerin başarılı büyümesi.
- Farklı reaktör tiplerinden biyofilm yapılarının karşılaştırılması.
- Kesme kuvvetinin biyofilm morfolojisi üzerindeki etkilerine ilişkin içgörüler.
- Elektron mikroskobu kullanarak biyofilmlerin detaylı görüntülemeleri.
Sonuçlar
- Özgün protokoller biyofilm araştırmaları için etkilidir.
- Reaktör seçimi biyofilm özelliklerini önemli ölçüde etkiler.
- Bu yöntemler üzerinde ileri uygulamalar için daha fazla çalışma yapılabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Robust biofilm models are essential for evaluating antimicrobial strategies and material performance in pharmaceutical and biotechnology R&D. Drip flow and rotating disk reactors enable reproducible, high-biomass Staphylococcus aureus biofilm formation under controlled shear, supporting predictive confidence in compound screening and device testing. These systems address critical early discovery and preclinical inflection points by standardizing biofilm growth for downstream quantitative analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of antimicrobial hypotheses in disease-relevant biofilm models.
- Supports functional validation of anti-biofilm targets and materials.
- Facilitates mechanistic de-risking by controlling shear and growth conditions.
- Provides reproducible platforms for portfolio triage of candidate compounds.
Screening & Assay Development
- Generates standardized, high-biomass biofilms for quantitative compound evaluation.
- Enables parallel production of identical biofilm samples for reproducibility.
- Supports scalable screening of antimicrobial efficacy and material performance.
- Delivers quantitative outputs such as colony forming units for assay comparability.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro biofilm models with clinically relevant device and material testing.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of anti-biofilm strategies.
- Supports risk-adjusted advancement of candidates based on robust biofilm challenge data.
- Provides mechanistic insight into biofilm resilience and removal under defined shear.
Pipeline & Workflow Integration
Drip flow and rotating disk reactors position biofilm analysis from early discovery through preclinical evaluation, bridging hypothesis testing, screening, and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of antimicrobial and anti-fouling interventions in controlled biofilm systems.
- Screening: Provides reproducible, quantitative biofilm assays for compound and material evaluation.
- Analytics: Enables measurement of colony forming units and biofilm biomass for comparative analysis.
- Translational Research: Facilitates alignment with device and material testing relevant to clinical applications.
- Enterprise Reuse: Offers standardized, scalable platforms for repeated use across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in anti-biofilm efficacy and material performance.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable biofilm production workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in anti-infective and device portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates based on robust biofilm data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in aseptic technique and biofilm quantification.
- Needs access to specialized reactors, incubators, and analytical tools such as homogenizers and microscopy.
- Demands cross-team standardization of protocols for reproducibility.
- Adaptable to various coupon materials and device-relevant surfaces.
- Limited to in vitro modeling; translation to in vivo systems requires further validation.
