Name: Maya Colony Gömme Yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-22T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Öğrenin maya kolonilerini gömme ve kesit alma yöntemini. Bu teknik, sporlu ve yalancı hifal hücrelerin dağılımını ışık ve elektron mikroskobu ile analiz ederek fungal toplulukların organizasyonunu anlamanıza yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Araştırma NIH 1R15GM094770 tarafından finanse edildi.

1. Colony İzolasyon ve Fiksasyon <ol><li> Belirtilen süre için agar 300 kolonileri (izole edilmiş bir koloni çapı 1-2 mm olmalıdır) inkübe edin. </li><li> Koloni (yüz yukarı) ve dar bir spatula ile altta yatan orta çıkarın. </li><li> % 2 agar birkaç damla koyun 42 ° C katılaşır önce 1 ml agar yüzünde Pipetman ucu ve hemen yer koloni kullanarak bir mikroskop lamı üzerine. </li><li> 42 ° C kolonisi üzerinde% 2 agar birkaç damla koyun ve sağlamlaştırmak için izin. </li><li> Bu protokolün kalan bütün adımlar için eldiven giyin </li><li> Trim jilet ile, 4 blok ve 7 gün boyunca,% 2 paraformaldehid /% 2 glutaraldehid fiksatif içeren bir 3.5 mL borosilikat vida kapaklı flakon koyun ° C </li></ol> 2. Yıkama ve Osmium Tedavi <ol><li> Yaklaşık 1 hafta sonra, 5 dakika sonra koloni (yaklaşık 1.5 ml) iki kez daha tamamen aynı hacmi ile karşılamak için yeterli 0.15m sodyum cacodylate (pH 7.2) ile iki kez 15 dakika boyunca inkübe kimyasal davlumbaz altında buz üzerinde agar blokları yıkamak 1X OS tamponu (100 mM KH 2 PO 4 10 mM MgCl 2, pH 6.0). </li><li> Sonra 1 saat süreyle kimyasal davlumbaz altında agar blokları karşılamak için aynı hacimde% 1 OsO 4 [2 mL OsO 4 (% 2) + 2 ml 2x OS Tampon] şişeleri (buz) aynı miktarda iki kez yıkayın her biri için 10 dakika 1X OS tampon. </li><li> Şişeleri, 4 gece bekletin ° C 1X OS tampon. </li><li> Sabitleme ve bu adımda bütün yıkar tehlikeli atık olarak bertaraf edilir. OsO 4 içeren Tüm pipetler, bitkisel yağ ile 3X durulanır . </li></ol> 3. Yıkama ve dehidratasyon <ol><li> Pasteur pipeti kullanarak her bir 10 dakika soğuk su yukarıdaki gibi aynı hacimde iki kez buz üzerinde Ertesi sabah yıkama agar blokları. </li><li> Sırayla aynı hacimde% 25,% 50,% 75, her 10 dakika, 10 dakika boyunca% 100 etanol ile 2 yıkar takip için% 95 etanol ile yıkayın. 4 gece bekletin ° C% 100 etanol. </li><li> Bu adımda tüm yıkar tehlikeli atık olarak bertaraf edilir. </li></ol> 4. Spurr Kullanıcı Hazırlık <ol><li> Ertesi sabah (mümkün olduğunca erken) Spurr reaktifi hazırlamak için bir davlumbaz altında tek kullanımlık plastik behere aşağıdaki çözümleri (EM Bilimler) tartın. Bu reaktif kullanılarak sonraki tüm iş için, bir davlumbaz kullanmaya devam. (ERL 4221 çözüm 5 gram) (DER 736 çözümü, 4 gram) (NSA çözüm 13 gram) </li><li> bir heyecan çubuğunu kullanarak kaput 20 dakika boyunca bu çözümler karıştırmayın (yavaş) </li><li> DMAE çözüm 0.15 gram ekleyin ve yukarıdaki gibi 20 dakika karıştırın. </li><li> Degas kaputu 1-2 saat için yukarıdaki karışımı. </li></ol> 5. Spurr Kullanıcı Sızma <ol><li> Spurr aynı hacmi ile% 100 her biri için 10 dakika oda sıcaklığında etanol yukarıda agar blokları 5 kez yıkayın kısa sürede yapılır. Son etanol yıkama sonra kalan etanol sadece agar blokları kapsar, böylece Pasteur pipeti kullanarak etanol çıkarın. </li><li> Spurr reaktifi (yaklaşık 0,5 ml) yaklaşık eşit miktarda ekleyin ve tekerlek şişeleri döndürmek ve oda sıcaklığında 15 dakika sonra 30 dakika süreyle bekletilmesi. 30 dakika tamamen Pasteur pipeti kullanarak çözüm kaldırdıktan sonra, ekle Spurr agar bloğu (yaklaşık 1.5 ml) kapsayacak şekilde, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca tekerlek şişeleri döndürmek ve 30 dakika bekletilmesi. Spurr yerine, döndürme ve inkübasyon 3 kez daha tekrarlayın. </li><li> Son 30 dakika sonra, Spurr reaktifi kaldırmak ve blokları karşılamak için taze Spurr ekleyin. Agar bloklar 4 saat oda sıcaklığında bekletin. </li><li> Spurr değiştirin ve bir gecede döndürmek. </li><li> Sabah Spurr Kullanıcı değiştirin ve şu güne kadar dönen bırakın. </li><li> Ertesi sabah yer Spurr sonra kalıp alt kapağı kalıpları agar blokları eklemek sayılı silikon kalıplar (Fisher Scientific). 4 saat boyunca 60 ° C'de inkübe </li><li> Daha Spurr ve inkübe 60 ° C gecede kalıpları üstlük 4 saat sonra,. </li><li> Kalıpları blokları çıkardıktan sonra bloklar hala biraz esnek iseniz, kalıpları dönmek ve ek bir 2 gün inkübe </li></ol> 6. Kesit <ol><li> Leica Ultracut S mikrotom ışık mikroskobu ve 0.1 μ iletim EM için ince bölümleri için 0.5 μ kalınlığında kesitler kesmek için kullanılır oldu. </li><li> Kesitler olduğu gibi ışık mikroskobu için, dH 2 O bir damla yerleştirildi, ve 52 ° C ısı blok üzerinde kurutulur. Kurutulmuş bölümlerde daha sonra% 1,0 oranında toluidin mavi, 5-15 saniye için% 1 Sodyum Borat bir düşüş ile boyandı. Boyama sonra, bölümleri, hemen bir su akışı altında yıkanıp kurutulur, montaj medya (KPL) kaplı ve bir kapak kayma örnek üzerinde mühürlenir. </li></ol> Maya ve diğer mikroorganizmaları desen oluşumu ölçme geniş önemi daha önce 1 incelendi. Özellikle not düzensiz topluluklar göre organize mikrobiyal kolonilerin artan işlevselliği. Açıklanan yöntemi, daha büyük uzmanlaşmış koloniler 2 gömmek için bir yöntem bir değişiklik ve modifikasyonlar kısa bir açıklama 3 yayımlanmıştır . Bir örnek, vahşi S. bir koloni merkezinden geçerek bir bölümü hafif bir mikrografı cerevisiae maya koloni Şekil 1'de gösterilmiştir. Aşçı, psödohif ve ovoid maya kolayca ayırt edilebilir ve altta yatan agar işgalci koloni bölgesi de açıktır. Maya bir laboratuvar suşu (W303 arka plan) bir elektron mikrografı bir örneği Şekil 2'de gösterilmiştir. Görüntü yüksek frekanslı sporulated hücreleri içeren koloninin bir bölge. <img src="/files/ftp_upload/2510/2510fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 vahşi bir maya koloni Işık mikroskobu. Bu maya (YPS133) ağaç eksuda 4 izole edilmiştir. 6 gün önce kesit YNA orta 5 koloni inkübe edildi. Açık oklar dolu ok uçları uzamış hücrelerinin zincirleri (psödohif) ve asci göstermektedir dolu oklar temsilcisi oval vejetatif hücreler gösterir, temsilcisi asci göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/2510/2510fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 Elektron mikroskobu bir laboratuvar maya suşu. SH1020 (W303 arka plan) koloni 3 kesit YNA orta 6 gün önce inkübe edildi. Resim asci bir yüksek frekans bölümünde bir bölge gösterir. Bir ok spor duvarın iki katmanlı bir yapı gösterir. <img src="/files/ftp_upload/2510/2510fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Koloniler halinde sporulated hücrelerinin dağılımı Niceleme: A), uzun kenarı boyunca yığılmış 15 bitişik dikdörtgenler içeren bir ızgara, bir koloni bölümünde bir görüntü merkezi bölgeye bindirilir . Sadece oranları sabit tutarken ızgara sadece koloninin alt ve üst kapakları, ölçeklenir. (B &amp; C) o dikdörtgenin içinde toplam hücrelere göre her dikdörtgen sporulated hücreler kısmını 4 gün eski (B) ve 8-günlük eski (C) koloniler görüntüleri görsel muayene ile belirlenir. Örneğin, koloninin üst kısmında dikdörtgen ("1" etiketli) grafiğin sol tarafına karşılık gelir. 4 koloni ortalaması gösterilir; hata çubukları std gösterilecek. hata.

<ol><li>Kimmel, A. R., Firtel, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+symmetries%3A+regulation+of+Dictyostelium+development+through+chemoattractant+and+morphogen+signal-response%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Breaking symmetries: regulation of Dictyostelium development through chemoattractant and morphogen signal-response.</a> Curr Opin Genet Dev. 14, 540-540 (2004).</li>
<li>Palkova, Z., Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+within+a+community%3A+benefit+to+yeast+long-term+survival%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Life within a community: benefit to yeast long-term survival.</a> FEMS Microbiol Rev. 30, 806-806 (2006).</li>
<li>Shapiro, J., Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significances+of+bacterial+colony+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">The significances of bacterial colony patterns.</a> Bioessays. 17, 597-597 (1995).</li>
<li>Shapiro, J., Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinking+about+bacterial+populations+as+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Thinking about bacterial populations as multicellular organisms.</a> Annu Rev Microbiol. 52, 81-81 (1998).</li>
<li>Engelberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+stalk-like+structures+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Multicellular stalk-like structures in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Bacteriol. 180, 3992-3992 (1998).</li>
<li>Scherz, R., Shinder, V., Engelberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+analysis+of+Saccharomyces+cerevisiae+stalk-like+structures+reveals+spatial+organization+and+cell+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Anatomical analysis of Saccharomyces cerevisiae stalk-like structures reveals spatial organization and cell specialization.</a> J Bacteriol. 183, 5402-5402 (2001).</li>
<li>Piccirillo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rim101p%2FPacC+pathway+and+alkaline+pH+regulate+pattern+formation+in+yeast+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Rim101p/PacC pathway and alkaline pH regulate pattern formation in yeast colonies.</a> Genetics. 184, 707-707 (2010).</li>
<li>Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+and+Saccharomyces+paradoxus+coexist+in+a+natural+woodland+site+in+North+America+and+display+different+levels+of+reproductive+isolation+from+European+conspecifics%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics.</a> FEMS Yeast Res. 1, 299-299 (2002).</li>
<li>Piccirillo, S., Honigberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+patterning+and+invasive+growth+in+wild+and+domesticated+yeast+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sporulation patterning and invasive growth in wild and domesticated yeast colonies.</a> Res Microbiol. 161, 390-390 (2002).</li>
<li>Vachova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+developing+multicellular+yeast+colony%3A+spatio-temporal+expression+of+Ato1p+ammonium+exporter%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter.</a> Environ Microbiol. , (2009).</li>
</ol>

Sunulan yöntem kolonilerin iç yapıları ortaya koymaktadır. S. bir dizi hücre tiplerinin kalıplarını belirleyen yöntem etkili olduğundan cerevisiae suşlarının farklı koloni morfolojileri ve aynı zamanda ilgili bir tür S. paradoksus 5, yöntem aynı zamanda geniş bir mantar ve diğer mikroorganizmalar üzerinde çalışmak için muhtemeldir . Yöntemin başarısı için kritik bir adım koloninin dahil olmak üzere tüm koloni, protokol boyunca agar kaplı olduğundan emin olmak içi...

<table><tbody><tr><td>Osmiyum tetroksit</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 19152</td><td></td></tr><tr><td>Silikon gömme kalıpları</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC 9975029</td><td></td></tr><tr><td>Sikloalifatik epoksit reçinesi</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 15004</td><td>ERL 4221</td></tr><tr><td>Epoksi reçinesi</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 13000</td><td>DER 736</td></tr><tr><td>Nonenil Süksinik Anhidrit</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 19050</td><td>NSA</td></tr><tr><td>2-Dimetil amin&amp;#8211;etanol</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 13300</td><td>DMAE</td></tr><tr><td>Montaj ortamı</td><td>KPL Inc</td><td>71-00-16</td><td></td></tr><tr><td>Döner tekerlek</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>Pelco 1055</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica Microsystems</td><td>Ultracut S</td><td></td></tr></tbody></table>

maya colony gömme yöntemi

Yeast Colony Embedding Method

Embriyolar farklı hücre tipleri Desenlendirme metazoan gelişiminde kilit bir mekanizma. Koloniler ve biyofilm olarak mikroorganizmalar, topluluklar da hücre tiplerinin kalıplarını gösterilecek. Örneğin, maya S. cerevisiae, sporulated hücreleri ve pseudohyphal hücrelerin düzgün koloniler halinde dağıtılan değildir. Desenlendirme ve bu kalıplar altında yatan moleküler mekanizmaları fonksiyonel önemi halen yeterince anlaşılamamıştır. Mantar kolonilerin hücre tiplerinin kalıplarını soruşturma açısından bir sorun metazoan doku aksine, koloniler halinde hücrelerin nispeten zayıf birbirine bağlı olduğunu. Özellikle, mantar kolonileri, en dokularda bulunan ekstrasellüler matriks aynı geniş düzeyde içermez. İşte bu kolonilerin hücre tiplerinin iç desenler ortaya koymaktadır maya kolonileri gömme ve kesit için bir yöntem rapor. Bu yöntem, ışık mikroskobu ve transmisyon elektron mikroskopi için uygun ince bölümler (0,1 μ) için yararlıdır (0,5 μ) kalınlığında kesitler hazırlamak için kullanılabilir. Aşçı ve pseudohyphal hücreleri kolayca bu hücrelerin iç yapısı EM tarafından görüntülenmiştir olabilir, ışık mikroskobu ile oval maya hücreleri ayırt edilebilir. Yöntemi, agar kolonileri çevreleyen, onları Spurr orta infiltre ve sonra kesit dayanmaktadır. Çapı 1-2 mm aralığında bir Kolonileri, bu protokol için uygundur. Kolonilerin iç görüntülenmesine ek olarak, yöntem temel agar işgal koloni bölgesi görselleştirme sağlar.

Işık ve elektron mikroskopi için kesit maya kolonileri izin gömmek için bir yöntem. Bu protokol, bir mantar toplum içinde hücre tiplerinin organizasyon anlayışına yönelik yeni bir araç sağlayan koloniler içinde sporulated hücreleri ve pseudohyphal hücrelerin dağılımı belirliyor.

Maya Colony Gömme Yöntemi

Embriyolarda farklı hücre tiplerinin desenlenmesi, metazoon gelişiminde temel bir mekanizmadır. Koloniler ve biyofilmler gibi mikroorganizma toplulukları...

Bu prosedürün genel amacı, maya kolonilerini gömmektir. Bu işlem, öncelikle bir koloninin ve altındaki agarın bir agar plakasından çıkarılması, erimiş agar damlalarının üzerine yerleştirilmesi ve hızla daha fazla erimiş agar ile kaplanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, koloninin bir kalıba sığacak kadar küçük olması için fazla agar budanır.Ardından, AER gömülü koloni fikse edilir, boyanır,ydehidre edilir ve son olarak spurs resin ile infiltre edilir. Blok, ek spurs resin içeren bir kalıba yerleştirilip sertleşene kadar inkübe edilir ve ardından kesitler alınır. Nihayetinde, ışık veya elektron mikroskobu aracılığıyla bir maya kolonisi içindeki hücre tiplerinin dağılımını gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu tekniğin taramalı elektron mikroskobu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, koloninin iç yapısının belirlenmesine olanak tanımasıdır. Bu yöntem, koloniler içindeki hücre tipi dağılımı gibi mikrobiyal gelişim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem, croce CAC kolonilerinin yapısına dair içgörü sağlamıştır ancak diğer mikroorganizmalara da uygulanabileceği muhtemeldir.Kolonilerin işlenmesi ve gömülmesi yazılı bir protokolden öğrenilmesi zor olabileceğinden, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Bu yöntem fikri, sporların kolonilerde eşit dağılmadığını öne süren ve 2002 yılında yayınladığımız bazı genetik verilerden esinlenilmiştir. Fin laboratuvarında Engelberg tarafından geliştirilen koloni kesit alma yöntemini uyarladık.Hadi başlayalım. İlk olarak, yaklaşık 300 koloni oluşana kadar Wild S visi mayasını 30 °C'de agar plaklarında inkübe edin. İnce bir spatula kullanarak, plakadan birer birer bir ila iki milimetre çapındaki kolonileri alın.Ardından, bir mililitrelik pipet ucu kullanarak bir mikroskop lamı üzerine 42 °C'deki %2'lik agar çözeltisinden birkaç damla damlatın ve AER katılaşmadan önce koloniyi hemen agar üzerine yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Koloninin üzerine birkaç damla daha agar ekleyin ve koloninin üst kısmı dahil tamamının agarla kaplandığından emin olarak agarın katılaşmasını bekleyin. Sonraki tüm protokol adımlarında bir jilet kullanın.Koloninin etrafındaki AER kısmını kesin ve koloniyi içeren AER bloğunu yerleştirin. %2 paraformaldehit ve %2 glutaraldehit fiksatör içeren 3,5 mililitrelik borosilikat vidalı kapaklı flakonda, kurumayı önlemek için koloniler tek tek işlenmelidir, ancak aynı flakona 10 koloniye kadar yerleştirilebilir. Kolonileri dört derece santigrat sıcaklıkta yedi gün boyunca bekletin.Bir hafta sonra fiksatif kaldırılır ve agri kolonileri, pH 7.2'de yaklaşık 1,5 mililitre 0,15 molar sodyum kate kullanılarak iki kez yıkanır; her yıkamanın ardından 15 dakika boyunca karıştırmadan buz üzerinde inkübe edilir. Bu yıkama işlemi iki kez daha tekrarlanır.100 millimolar mono potasyum fosfat ve pH 6.0'da 10 millimolar magnezyum klorürden oluşan 1.5 mililitre bir X OS tamponu kullanarak, her yıkama sonrası buz üzerinde beş dakika inkübasyon yapın. Ardından, aynı tüpü kullanarak, burada ve bu protokolün yazılı kısmında belirtilen osmiyum işlemini ve yıkamaları gerçekleştirin. Daha sonra yine aynı tüpü kullanarak, burada ve beraberindeki yazılı protokolde belirtilen kademeli dehidrasyon işlemlerini ertesi sabah erken saatlerde uygulayın.Burada ve beraberindeki yazılı protokolde gösterildiği gibi spurs reaktifini hazırlayın. Agri bloklarını, oda sıcaklığındaki %100 etanolün 1,5 mililitresi ile her biri 10 dakika sürecek şekilde hemen beş kez yıkayın. Son etanol yıkamasından sonra, agri bloğu kapalı kalacak kadar etanol bırakarak geri kalanını uzaklaştırın.Pastör pipeti kullanarak, flakona yaklaşık 0.5 milliliters spurs reaktifi koyun ve düşük hızda bir döndürücü üzerinde 15 dakika boyunca döndürün. Döndürme işleminden sonra oda sıcaklığında, flakonu 30 dakika boyunca bekletin. Ardından, solüsyonu tamamen uzaklaştırın.Ardından, agri bloğu kaplayacak şekilde 1,5 milliliters spurs reaktifi ekleyin. Vial'i oda sıcaklığında 15 dakika boyunca tekrar bir tekerlek üzerinde döndürün ve 30 dakika boyunca bekletin. Bu yıkama işlemini tekrarlayın.Üç kez daha tekrarlayın. Son 30 dakikanın ardından, spurs reaktifini çıkarın ve blokları kaplayacak şekilde taze spurs reaktif ekleyin. Agri blokları oda sıcaklığında dört saat boyunca bekletin.Spurs reaktifini yenileyin ve gece boyunca döndürün. Ertesi sabah, spurs reaktifini tekrar yenileyin ve vialleri bir sonraki güne kadar döndürmeye bırakın. Bir sonraki sabah, kalıpların tabanını hafifçe kaplayacak şekilde numaralandırılmış silikon kalıplara spurs reaktifi yerleştirin.Ardından agri bloklarını kalıplara yerleştirin ve 60 °C'de dört saat boyunca inkübe edin. Dört saat sonra, kalıpların üzerini daha fazla gömme blok ve reaktif ile tamamlayın ve 60 °C'de gece boyunca inkübe edin. Kesim işlemi için blokları kalıptan çıkarın.Burada, bir Wild S Visia maya kolonisinin merkezinden alınan bir kesitin ışık mikrografı örneği gösterilmektedir. Bu maya, ağaç eksudalarından izole edilmiş bir vahşi tip suştur. Koloni, kesme işleminden önce altı gün boyunca YNA ortamında inkübe edilmiştir.Bu görüntüde asai, psödohif ve ovoid mayalar kolayca ayırt edilebilmekte ve koloninin altındaki agara nüfuz ettiği bölge de belirgin şekilde görülmektedir. Açık oklar temsili asaileri, dolu oklar temsili ovoid vejetatif hücreleri, dolu ok başları ise uzamış hücre zincirlerini ve si'yi göstermektedir. Bu görüntü, laboratuvar mayası suşları SH 1 0 2 0 ve W 3 0 3'ün ince bir kesitinden alınan bir elektron mikrograf örneğidir. Arka plan.Koloni, kesit alınmadan önce altı gün boyunca YNA besiyerinde inkübe edildi. Görüntü, koloninin sporülasyon göstermiş hücrelerin yüksek frekansta bulunduğu bir bölgesini göstermektedir. Bir ok, spor duvarının çift katmanlı yapısını işaret etmektedir.A bölümünde, dört günlük bir koloninin kesiti ile B bölümündeki görüntü üzerine bindirilmiş 15 dikdörtgenden oluşan bir ızgara gösterilmektedir. Her bir dikdörtgendeki spor ilişkili hücrelerin sıklığı, A bölümünde gösterilen 15 dikdörtgene karşılık gelen 15 çubukla grafik haline getirilmiştir. Veriler, dört bağımsız dört günlük koloninin ortalaması ve standart hatasıdır. C bölümünde, dört bağımsız sekiz günlük koloni için ortalamalar ve standart hatalar gösterilmektedir. Bu teknik bir kez kavrandığında, bir tam gün ve birkaç tane bir ila üç saatlik günle iki hafta içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedür uygulanırken, blokların kurumaması için çözeltilerin hemen eklenmesinin hatırlanması önemlidir. Bu prosedürü takip edin.Gelişimden sonra belirli proteinleri eksprese eden hücrelerin dağılımını belirlemek için immün elektron mikroskopi gibi diğer yöntemler de kullanılabilir. Bu teknik, sadece sporüle hücrelerin paternine değil, aynı zamanda croce CCI kolonilerindeki psödohifal hücrelerin paternine de bakmamıza olanak tanıdı. Bu videoyu izledikten sonra, maya kolonilerinin kesit alma işlemi için nasıl gömüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Bu protokolde kullanılan mikroskopi reaktiflerinin çoğunun son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Lütfen çeker ocak kullanmayı, koruyucu kıyafetler giymeyi ve reaktifleri uygun şekilde bertaraf etmeyi hatırlayın. Tamam, işte bu kadar.İzlediğiniz için teşekkürler. Deneylerinizde başarılar dileriz.

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada sessiz çiftleşme lokusların HML ve HMR floresan gazetecilere uygulanan büyüyen immobilize maya hücreleri görünüm için hızlı bir...

Canlı İmmobilize Maya Hücreleri Görselleştirme Hızlı Tekniği

Bu videoda, mikroskopi kullanarak mantar hifleri üzerinde bakteriyel biyofilmleri büyütmek ve kalitatif olarak analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bakteriyel biyofilmler sıklıkla mantar yüzeylerinde oluşur ve metabolik işbirliği, rekabet veya avlanma gibi çok sayıda bakteri-mantar etkileşim sürecini içerir.

Mantar Hifleri Üzerinde Biyofilm Oluşturan Bakterileri Görselleştirmek için Numune Hazırlama Yöntemi

Biz floresan hücrelerin iç kalıplarını gözlemlemek maya topluluklar donma ve cryosectioning için bir protokol mevcut. Yöntem metanol-sabitleme dayalıdır ve bir topluluk içinde floresan proteinleri inaktive olmadan hücrelerinin mekansal dağılımını korumak için OCT-katıştırma.

Floresans Desenler incelenmesi için Maya Toplulukları Cryosectioning

Tomurcuklanan mayadan yüzeye yayılan kromozomlar için bir yöntem sunulmuştur. Bu yöntem, daha önce Loidl ve Klein tarafından açıklanan bir yöntemden türetilmiştir. Ek olarak, yayılmış kromozomların immün boyaması için bir prosedür gösteriyoruz.

Yüzey Yayma ve Maya Kromozomlar immün

Maya tomurcuklanan nedeniyle güçlü genetik ve mikrotübül hücre iskeletinin basitliği için in vivo olarak mikrotübül dinamiklerinin çalışmak için avantajlı bir modeldir. Aşağıdaki protokol dönüşümü ve kültür maya hücreleri eş odaklı mikroskopi görüntü elde ve kantitatif maya hücrelerini canlı mikrotübül dinamiklerini analiz etmek açıklamaktadır.

Yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve Bireysel Astral Mikrotubul Dynamics Analizi Budding Maya

Fiksasyon, parafin katıştırma ve mikrobiyal koloni biyofilmler için ince parça teknikler açıklanmaktadır. Hazır örnekleri, mikroskobu tarafından biyofilm altyapı ve muhabir ifade desenleri görüntülenmeyecektir.

Parafin gömme ve ince mikrobiyal koloni biyofilmler mikroskobik analizlerin yapıldığı için kesit

Burada, floresan mikroorganizma ve tomurcuklanan Maya hücrelerinin floresans mikroskopisi görüntülerinin otomatik algılama ve niceliksel tanımı ile ilgili bir MATLAB uygulaması sunuyoruz.

Otomatik görüntü Işleme kullanarak Fission ve budding yeasts lipid damlacık Içeriğinin Analizi

Mikrobiyal mühendisliğin 'tasarım-yap-test' döngüsündeki bir darboğaz, suşların işlevsel ekranlarını gerçekleştirebildiğimiz hızdır. Damlacık bazlı RNA dizilimi kullanan deney başına yüzlerce ila binlerce maya hücresine uygulanan gerinim taraması için yüksek iş letme yöntemini tanımlıyoruz.

Damlacık Tabanlı RNA Sıralamaile Yüksek EldeLi Maya Zorlanma Fenotilik

Maya büyüme fenotipleri, mikrokolonlara dönüşen hareketsiz hücrelerin son derece paralel zaman atlamalı görüntülemesi ile tam olarak ölçülür. Aynı zamanda, stres toleransı, protein ekspresyasyonu ve protein lokalizasyonu izlenebilir, çevresel ve genetik farklılıkların yanı sıra izojenik hücreler arasındaki gen ekspresyon heterojenliğinin büyümeyi nasıl modüle ettiğini incelemek için entegre veri kümeleri üretilebilir.

Büyüme ve Gen İfadesinde Heterojenliği Ölçmek için Mikrokolonların Yüksek Verimli Canlı Görüntülemesi

Bu protokol, mayaların ve küf Aspergillus fumigatus'un 7 gün gibi kısa bir sürede büyük toprak numunelerinden kültürlenmesi için etkili ve hızlı bir yöntemdir. Yöntemler, deneyler için gerektiğinde bir dizi inkübasyon ortamına ve sıcaklığına uyum sağlamak için kolayca değiştirilebilir.

Mantar Popülasyon Yapısını Araştırmak için Kültürlenebilir Maya ve Küflerin Topraklardan İzolasyonu

Öğrenin maya kolonilerini gömme ve kesit alma yöntemini. Bu teknik, sporlu ve yalancı hifal hücrelerin dağılımını ışık ve elektron mikroskobu ile analiz ederek fungal toplulukların organizasyonunu anlamanıza yardımcı olur.

Maya Colony Gömme Yöntemi

Daha fazla video keşfet