Maya Colony Gömme Yöntemi

Bu prosedürün genel amacı, maya kolonilerini gömmektir. Bu, önce bir koloniyi ve alttaki agarı bir agar plakasından çıkararak, birkaç damla erimiş agar üzerine yerleştirerek ve hızlı bir şekilde daha fazla erimiş aeer ile kaplayarak gerçekleştirilir. Daha sonra, fazla AER, bir kalıba sığacak kadar küçük hale getirmek için koloniden kesilir.

AER gömülü koloni daha sonra sabitlenir, boyanır, kurutulur ve son olarak mahmuz reçinesi ile sızar. Blok daha sonra ilave mahmuz reçinesi ile bir kalıba yerleştirilir, sertleşene kadar inkübe edilir ve daha sonra bölümlere ayrılır. Sonuç olarak, ışık veya elektron mikroskobu ile bir maya kolonisi içindeki hücre tiplerinin dağılımını gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin taramalı elektron mikroskobu gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, koloninin iç yapısının belirlenmesine izin vermesidir. Bu yöntem, hücre tiplerinin koloniler içindeki dağılımı gibi mikrobiyal gelişim alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem, croce CAC kolonilerinin yapısı hakkında bilgi sağlamıştır, ancak diğer mikroorganizmalara da uygulanabilmesi muhtemeldir.

Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi çok önemlidir, çünkü kolonilerin işlenmesi ve gömülmesi yazılı bir protokolden öğrenilmesi zor olabilir. Bu yöntem fikri, 2002 yılında yayınladığımız ve sporların koloniler halinde eşit olarak dağılmadığını öne süren bazı genetik verilerden ilham aldı. Fin laboratuvarında Engelberg tarafından geliştirilen kolonileri bölmek için bir yöntem uyarladık.

Öyleyse başlayalım. Yabani S görünür mayayı burgu plakaları üzerinde yaklaşık 300 koloni mevcut olana kadar 30 derecede kuluçkaya yatırarak başlayın. Dar bir spatula kullanarak, bir ila iki milimetre çapındaki kolonileri plakadan birer birer çıkarın.

Daha sonra bir mililitrelik bir pipet adam ucu kullanarak, bir mikroskop lamı üzerine 42 santigrat derecede birkaç damla %2 agar damlatın ve AER katılaşmadan hemen koloniyi agar yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Koloninin üzerine birkaç damla daha agar damlatın ve agarın katılaşmasına izin verin, koloninin üst kısmı da dahil olmak üzere tüm koloninin agar ile kaplandığından emin olun. Bir tıraş bıçağı ile sonraki tüm protokol adımlarında.

AER'yi koloninin etrafına kesin ve koloniyi içeren AER bloğunu yerleştirin. % 2 paraform aldehit ve% 2 glutaraldehit içeren 3.5 mililitrelik bo silikat vidalı kapaklı bir şişede, kurumayı önlemek için her seferinde bir tane olmak üzere koloniler işlenmelidir, ancak aynı şişeye 10 koloniye kadar yerleştirilebilir. Kolonileri yedi gün boyunca dört santigrat derecede bırakın.

Bir hafta sonra, fiksatifi çıkarın ve yaklaşık 1,5 mililitre 0,15 molar sodyum kullanarak ağrı kolonilerini iki kez yıkayın. PH 7.2'de pişirin ve her yıkamadan sonra çalkalama olmadan 15 dakika buz üzerinde inkübe edin. Bunu takiben iki kez daha yıkayın.

100 milimolar mono potasyum fosfat, pH 6.0'da 10 milimolar magnezyum klorürden oluşan 1.5 mililitre bir X OS tamponu kullanarak, her yıkamadan sonra beş dakika buz üzerinde inkübe edin. Daha sonra, aynı şişeyi kullanarak, burada ve bu protokolün yazılı kısmında listelenen osmiyum işlemini ve yıkamaları gerçekleştirin. Daha sonra, aynı şişeyi kullanarak, ertesi sabah erken saatlerde burada ve beraberindeki yazılı protokolde listelenen kademeli dehidrasyonları gerçekleştirin.

Mahmuz reaktifini burada ve beraberindeki yazılı protokolde gösterildiği gibi hazırlayın. Agri blokları hemen 1,5 mililitre %100 oda sıcaklığında etanol ile 10 dakika boyunca beş kez yıkayın. Son etanol yıkamasından sonra, ağrı bloğunun kapalı kalması için yalnızca yeterli miktarda etanolü çıkarın.

Mera pipeti kullanarak, şişeye yaklaşık 0,5 mililitre mahmuz reaktifi yerleştirin ve 15 dakika boyunca düşük hızda bir tekerlek üzerinde döndürün. Rotasyondan sonra oda sıcaklığında, şişenin 30 dakika bekletilmesine izin verin. Ardından, çözeltiyi tamamen çıkarın.

Daha sonra ağrı bloğunu kaplamak için 1,5 mililitre mahmuz reaktifi ekleyin. Yine, şişeyi oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir tekerlek üzerinde döndürün ve 30 dakika bekletin. Bu yıkamayı tekrarlayın.

Üç kez daha adım atın. Son 30 dakikadan sonra, mahmuz reaktifini çıkarın ve blokları kaplamak için taze mahmuz reaktifi ekleyin. Tarım bloklarının dört saat oda sıcaklığında beklemesine izin verin.

Mahmuz reaktifini değiştirin ve gece boyunca döndürün. Ertesi sabah, mahmuz reaktifini değiştirin ve şişeleri ertesi güne kadar döndürmeye bırakın. Ertesi sabah, mahmuz reaktifini kalıpların sadece altını kaplayacak şekilde numaralı silikon kalıplara yerleştirin.

Daha sonra ağrı bloklarını kalıplara yerleştirin ve 60 santigrat derecede dört saat inkübe edin. Dört saat sonra, kalıpları daha fazla mahmuz, reaktif ile doldurun ve gece boyunca 60 santigrat derecede inkübe edin. Kesit almak için blokları kalıptan çıkarın.

Yabani S Visia maya kolonisinin merkezinden geçen bir bölümün hafif mikrografının bir örneği burada gösterilmiştir. Bu maya, ağaç eksüdalarından izole edilen yabani tip bir türdür. Koloni, kesitlemeden önce YNA besiyerinde altı gün boyunca inkübe edildi.

Bu görüntüde, asai, psödohi ve oval maya kolayca ayırt edilebilir ve alttaki agarı istila eden koloni bölgesi de belirgindir. Açık oklar temsili asai'yi, dolu oklar temsili oval, vejetatif hücreleri gösterir, dolu ok ucu, uzun hücre zincirlerini ve si'yi gösterir. Bu görüntü, SH 1 0 2 0 ve W 3 0 3.Background maya laboratuvar türünün ince bir kesitinden alınan bir elektron mikrografı örneğidir.

Koloni, kesitlemeden önce YNA besiyerinde altı gün boyunca inkübe edildi. Görüntü, yüksek sıklıkta sporlu hücreler içeren koloninin bir bölgesini göstermektedir. Bir ok, spor duvarının iki katmanlı yapısını gösterir.

A bölümünde, B bölümündeki görüntünün üzerine bindirilmiş 15 dikdörtgenden oluşan bir ızgara ile dört günlük bir koloninin bir bölümünü gösteriyoruz.Her dikdörtgendeki sporla ilgili hücrelerin sıklığı, A bölümünde gösterilen 15 dikdörtgene karşılık gelen 15 çubukla aşılanır.Veriler, dört bağımsız dört günlük koloninin ortalama ve standart hatasıdır. Dört bağımsız sekiz günlük koloni için ortalamalar ve standart hatalar gösterilmiştir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik bir tam gün ve birkaç bir ila üç saatlik gün ile iki hafta içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü denerken, blokların kurumaması için solüsyonları hemen eklemeyi unutmamak önemlidir Bu prosedürü takip edin.

İmmünoelektron mikroskobu gibi diğer yöntemler, geliştirildikten sonra belirli proteinleri eksprese eden hücrelerin dağılımını belirlemek için kullanılabilir. Bu teknik, sadece sporülat hücrelerinin modellenmesine değil, aynı zamanda croce CCI kolonilerindeki psödo-hifal hücrelerin modellenmesine de bakmamızı sağladı. Bu videoyu izledikten sonra, bölümlere ayırmak için maya kolonilerinin nasıl yerleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Bu protokolde kullanılan mikroskopi reaktiflerinin çoğunun son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Lütfen çeker ocak kullanmayı, koruyucu giysi giymeyi ve reaktifleri uygun şekilde atmayı unutmayın. Tamam, bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler. Deneylerinizde iyi şanslar.