Name: DNA Mikroarrayler: Örnek Kalite Kontrol, Dizi Hibridizasyon ve Tarama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-15T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Öğrenin DNA mikroarray deneylerinde RNA kalite kontrolü, hibridizasyon ve tarama adımlarını otomatikleştirilmiş sistemle nasıl gerçekleştirilir. Bu yöntem sinir sistemi gen ekspresyon profillemesi için güvenilir veri sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, James S. McDonnell Vakfı, 21. Yüzyıl Ödülü Programı ED hibe ve bir NIH Müdürü Yenilikçisi Ödülü tarafından desteklenmiştir . GAB California Rejeneratif Tıp Enstitüsü doktora sonrası burs kısmen desteklenmiştir.

1. 2100 Bioanalyzer RNA örnek kalite kontrol analizleri Başlamadan önce, <ol><li> 10 dakika süreyle 70 ° C, merdiven ve örnekleri denatüre. Hemen buz üzerinde soğutun. </li><li> RNaseZAP RNaz içermeyen su ile 1 dakika 10 sn ile araç elektrotlar, temizleyiniz. Elektrotlar kurumaya izin verin. </li><li> Kiti ile sağlanan bir spin filtresinin içine jel matriks 550 ul pipeting jel matris hazırlayın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1.500 RCF santrifüjleyin. Kısım için 65, 4 ul alikotları ve mağaza ° C 1 aya kadar jel süzülür. </li><li> Çip emişli istasyonu hazırlamak için, <ol class="lalpha"><li> 1 ml şırınga klip ve luer kilit adaptörü içine yerleştirin. </li><li> Taban plakası, taban altında vida gevşeme, plaka kaldırma ve vida retightening C konumuna ayarlayın. </li><li> En üst konumda şırınga klibi ayarlayın. </li></ol></li><li> Oda sıcaklığına kadar boya konsantre dengelenmesi. 10 sn vorteksleyin. Süzülmüş jel 65 ul kısım boya 1 ul ekleyin. Vortex ve oda sıcaklığında 10 dakika 13.000 RCF santrifüj. Bir gün içinde kullanın. Numunelerinin çalışılabilmesi için hazır olduğunuzda, </li><li> Emişli istasyonunda bir çip yerleştirin. Bu protokolde, RNA 6000 nano yongaları kullanıyor. Jel yüklemek için, <ol class="lalpha"><li> Pipet 9 ul de siyah bir arka plana karşı beyaz bir "G" ile işaretlenmiş jel boya karışımı. Ucu çok iyi altındaki yerleştiğinden emin olun. </li><li> 1 ml şırınga pistonu yerleştirin. Emişli istasyonu kapatın. Tıklatın kilitleri emin olun. </li><li> Klip tarafından düzenlenen kadar yavaş fakat istikrarlı bir pistonu aşağı doğru bastırın. </li><li> 30 saniye bekleyin. Klibi bırakın. </li><li> Piston kendisi kadar gidelim. Hareket durduktan sonra, birkaç saniye bekleyin ve 1 ml konumuna pistonu geri çekin. Emişli istasyonu açın. </li></ol></li><li> "G" işaretli 2 kuyuların her jel boya karışımı Pipet 9 ul. </li><li> Pipet 5, 12 örnek kuyuların her ve iyi merdiveni marker ul. </li><li> Hazırlanan merdiven merdiven Pipet 1 ul. </li><li> Pipet 1 ul örnek kuyu içine her bir örnek. </li><li> Pipet 1 de her kullanılmayan örnek marker ul. </li><li> Vorteks 2,400 rpm'de 1 dakika için çip. </li><li> Çalıştırmak için çip <ol class="lalpha"><li> 2100 Uzman Yazılım başlayın. </li><li> Çip yerleştirin ve kapağını kapatın. Cihaz on-line ise, bir simge, kapağı açık ya da kapalı ve ne tür çip takılı olmadığını gösterecektir. Doğru bağlantı noktasının seçili olduğundan emin olun. </li><li> 5 dakika içinde buharlaşmasını önlemek için numunelerin yükleme testinin çalıştırın. </li></ol></li></ol> 2. Amplifikasyonu ve etiketleme Mikroarray analizi için hazırlamak için, RNA örnekleri T7 RNA polimeraz 3 dayanan bir tepki, genellikle amplifiye ve etiketlenir. Çift ters transkripsiyon tarafından oluşturulan cDNA mahsur. in vitro transkripsiyon reaksiyonu bir cDNA Crna olarak bilinir oluşturmak için kullanılır. Bu reaksiyon dizisi hibridizasyon için etiketli RNA mikrogram miktarlarda üreten etiketli ribonucleotides varlığı yapılır. Amplifikasyon / etiketleme yöntemleri tercih kullanılacak sonraki mikroarray platformu bağlıdır. Bu bölümde, Agilent Hızlı Amp etiketleme kiti kullanılarak floresan etiketli RNA üretimi açıklar. <ol><li> Pipet 50 ng 1.5 ml tüp RNA 5 mg. Hacmi 8.3 ul geçmemelidir. Gerekirse, vakum santrifüj veya alkol ile yağış RNA örnek konsantre. </li><li> 1.2 T7 astar ul ekleyin. </li><li> 11.5 ul RNaz içermeyen su ile son hacim kazandırın. </li><li> RNA denatüre 65 ° C'de 10 dakika süreyle inkübe edin. Biz tüp üst yoğuşmayı önlemek için sıcak bir kapak ile bir termalcycler kullanmanızı öneririz. </li><li> 10 dakika inkübasyon sıcak, 5X İlk Strand Tampon sırasında 80 ° C 5 dk. Vortex ve aşağı doğru döndürün. Kullanıma hazır olana kadar oda sıcaklığında tutun. </li><li> 10 dakika inkübasyondan sonra, hızlı bir şekilde buz üzerinde denatüre RNA örnekleri soğumasını. </li><li> CDNA ana karışımı hazırlayın. Reaksiyon başına, aşağıdakileri ekleyin: <ol class="lalpha"><li> 4 ul 5X İlk Strand Tampon </li><li> 2 ul 0.1 M DTT </li><li> 1 ul 10 mM dNTP </li><li> 1 ul MMLV-RT enzimi </li><li> 0.5 ul RNaz Out. </li></ol></li><li> Bileşenlerin tersine tüp 4 kez karıştırın. Girdap değil. Tüpün dibinde içeriğini toplamak için aşağı spin. </li><li> Örnek başına 8.5 ul ana karışımı ekleyin. Yukarı ve aşağı pipeting karıştırın. </li><li> 2 saat boyunca inkübe 40 ° C, 10 dakika 65 ° C Isıtılmış bir kapak ile bir termalcycler kullanmanızı öneririz. </li><li> Tüpler 5 dakika buz aktarın. </li><li> Transkripsiyon ana karışımı hazırlayın. Reaksiyon başına, aşağıdakileri ekleyin: <ol class="lalpha"><li> 15.3 ul nükleaz ücretsiz su </li><li> 20 ul4X transkripsiyon tamponu </li><li> 6 ul 0.1 M DTT </li><li> 8 ul UTP'larının </li><li> 6.4 ul% 50 PEG (PEG 40 ° C prewarmed ve tabanda sağlamak için vortekslenmiş olmalıdır) </li><li> 0.5 ul RNaz Out </li><li> 0.6 ul inorganik pyrophosphatase </li><li> 0.8 ul T7 RNA polimeraz </li><li> 2.4 ul Cy3 veya Cy5 CTP </li></ol></li><li> Kısaca örnekler tüpün dibinde içeriğini toplamak için dönerler. </li><li> Transkripsiyon Master Mix örnek başına 60 ul ekleyin. </li><li> 2 saat 40 ° C'de inkübe edin. </li><li> 20 ul RNaz ücretsiz su ekleyin. </li><li> Tüzel kişiliği olmayan nükleotidlerin kaldırmak için etiketli Crna arındırın. Biz Qiagen Kullanıcı RNeasy Mini sütunları kullanmanızı öneririz. </li><li> Sayısal olarak etiketlenir Crna. Biz Mikroarray Ölçüm modunda bir NanoDrop2000 spektrofotometre kullanmanızı öneririz. Örnek türü olarak RNA-40 seçin emin olun. </li><li> Kayıt örnek konsantrasyonu, verim (ses ile çarpılır konsantrasyon olarak hesaplanmıştır) ve spesifik aktivite (Crna konsantrasyonu üzerindeki boya konsantrasyonu rasyon ile çarpılarak 1000 olarak hesaplanmıştır). Mikroarray hibridizasyon için, en az 825 ng ve en az 8 pmol / mg belirli bir faaliyet bir verim elde etmek için gereklidir. </li></ol> 3. Mikroarray hibridizasyon <ol><li> Hibridizasyon istasyonu ve set açın 65 ° C'de en az 2 saat önce hibridizasyon başlar. </li><li> Hibridizasyon örneği hazırlamak için, 1.5 ml tüp aşağıdaki karışımı: <ol class="lalpha"><li> 825 ng Cy3 Crna (bu genellikle "tedavi" örnek) </li><li> 825 ng Cy5 Crna (bu genellikle "referans" örnek) </li><li> 11 ul 10X Engelleme ajan. </li><li> Son bir hacim 52.8 ul RNaz ücretsiz su ekleyin </li><li> 2.2 ul parçalanma tampon ekleyin. </li></ol></li><li> Karıştırmak için düşük hızda karıştırın. </li><li> 60 ° C'de tam 30 dakika boyunca inkübe. Bu dizi hibridizasyon etiketli parçaları oluşturur Crna parçalanma adımdır. Tam olarak tarif inkübe için çok önemlidir. Biz ısıtmalı bir kapak ile bir termalcycler kullanmanızı öneririz. Bu tam olarak doğru ortalama uzunluğu probları oluşturmak için açıklanan inkübe için çok önemlidir. Aşırı veya yetersiz parçalanma, yanlış negatif veya yanlış pozitif sonuçlanacaktır. </li><li> Parçalanma durdurmak için 55 ul 2X Hibridizasyon tamponu ekleyin. Pipetleme kabarcıkları tanıtmak için özel bir özen karıştırın. </li><li> Tüpün dibinde içerik toplamak için maksimum hızda 1 dakika boyunca santrifüjleyin. Kabarcıkları gözlenmesi halinde, bunları kaldırmak için uzun santrifüjlenir. </li><li> Tüp, ışıktan korumalı buz koyun. Mümkün olduğunca çabuk dizi örnek yükleyin. </li><li> Dizi yüklemek için, ilk melezleme odası hazırlamak. Bu protokol ile Agilent 4x44K dizileri Roche-NimbleGen melezleme sistemi ve A4 mikser odaları kullanımı anlatılmaktadır. <ol class="lalpha"><li> Ilk montaj / sökme aracı, barkod tarafında bir mikroarray slayt yerleştirin. </li><li> Bir A4 mikseri açın ve yapıştırıcı maruz. Dizi ve herhangi bir hareketi önlemek için montaj / sökme aracı Holding ucunda başlayarak, slayt A4 mikseri. Bu aracı doğru hizalandığından emin olun. Mikser, tüm dizi slayt boyunca sopa. </li><li> Slayt / karıştırıcı montaj kaldırmak için mikser ucundan çekin. </li><li> Anırma aracını kullanarak, sıkı theslide yapıştırılmış emin olmak için yapışkanlı conta boyunca tüm basın. Yapıştırıcı ve slayt arasında sıkışıp kalmış küçük hava kabarcıkları karanlık bir arka plana karşı görülebilir. Anırma aracı ile bu kabarcıklarını çıkarmak için fazladan zaman ayırın. Dizi şimdi yüklenecek hazırdır. </li></ol></li><li> Hibridizasyon örnek 100 ul yüklemek için pozitif deplasmanlı pipet kullanın. Ucu liman deliğin içinde sıkıca bastırın; sonra hava dizi alanda sıkışıp olmadığını, yavaş ve yumuşak bir şekilde dağıtmak. Geri örnek emmek için deneyin. Tüm örnek reçete edildikten sonra, piston bırakmadan liman delik ucundan tutun. Örnek Dizinin tamamını kaplar ve sıvı havalandırma portu çıkmaya başlar, hızlı bir pipet çıkarın. Sadece piston ucu slayttan sonra bırakın. </li><li> Iki limanlarında yavaşça dab aşırı sıvı. Odanın kendisi örnek çizmezseniz emin olun. </li><li> Cımbız kullanarak etiketleri ile port delikleri örtün. </li><li> Hibridizasyon istasyonu slayt koyun ve mesane delikleri O-ring içinde doğru konumda olduğunu kontrol edin. Bu hibridizasyon sırasında karıştırma uygun sağlayacaktır. </li><li> Slayt kapağı ve istasyon kapağı kapatın. Karıştırma modu B. istasyonu ayarlayın </li><li> 65 ° C'de 17 saat süreyle dizi melezleşme. </li><li> Triton X-102% 0.005 'i son bir konsantrasyonu ekleyerek hazırlayın Tampon 2 yıkayın. ° C gecede 37 tutun. </li></ol> 4. Mikroarray yıkama <ol><li> Tampon 1,% 0.005 'i son bir konsantrasyon Wash Triton X-102 ekleyin. Oda sıcaklığı az tutun.e. </li><li> Hibridizasyon bittiğinde, Yıkama Tampon 1 ile cam tabak "A" doldurun. Çanak montaj / sökme aracı tutun ve bazı manevra de izin vermek için yeterince büyük olmalıdır. Tüm yıkar züccaciye yapılmalıdır. Dizi yüksek bir arka plan ile sonuçlanan leach bileşikler etme eğilimi, plastik tabaklar kaçının. </li><li> "B" bir leke tabağına bir slayt rafı ve bir heyecan bar koyun. Raf kapsar emin olun, Yıkama tampon 1 ile doldurun. , Oda sıcaklığında bir heyecan plaka üzerine yerleştirin. </li><li> Bir heyecan bir heyecan plaka üzerinde boş bir leke tabağına "C" ve yer bar koyun. </li><li> Dizi çıkarın ve montaj / sökme aracı koyun. "A" çanak Batmak tüm montaj. </li><li> A4 karıştırıcı dikkatlice soyulabilir, bir yandan ters taraftan montaj / sökme aracı ve slayt tutarken. Dizi alanda çizmez emin olun. </li><li> Tabak boyama "B" rafa slayt hızla yerleştirin. Şu andan itibaren Cy5 boya ozona duyarlı olduğundan, havaya maruz kalma minimize edilmelidir. Bir seferde 8 dizileri fazla yıkamayın. </li><li> Orta hızda 1 dakika karıştırarak yıkayınız. </li><li> Önceden ısıtılmış Yıkama tampon 2 ile "C" çanak boyama doldurun. Slaytları transferi ve 1 dakika boyunca yıkayın. </li><li> Çok yavaş, slayt bıraktığı damlacıklar en aza indirmek için çanak "C" boyama slayt rafa kaldırın. </li><li> 2 dakika boyunca iplik slayt kurulayın. Uyumlu bir santrifüj mevcut değilse, slayt santrifüj ya da 50 ml konik tüp içinde argon gazı darbe. </li><li> 50 ml konik tüp slaytlar ve argon gazı ile doldurun. Sinyal kaybını önlemek için hemen tarayın. Moleküler Cihazlar GenePix 4000B tarayıcı kullanmanızı tavsiye ederiz. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: İyi kalite toplam RNA örnekleri 2 büyük ribozomal RNA türlerinin karşılık, kalite kontrol için Bioanalyzer çalıştırdığınızda sadece iki ana zirve üretmek gerekir. Bazı RNA bozulması, ilk ribozomal RNA zirve öncesinde bir karalama olarak gösterecektir. Ağır bozulmuş 2 ribozomal RNA zirveleri çok düşük yoğunluklu ya da tanımlanabilir olacak iken, düşük kaliteli RNA, geniş bir tepe ya da düşük tutma zaman zirveleri bir dizi gösterecektir. 2100 Bioanalyzer çıkış örnekler için, bakınız şekil 1. Uzman 2100 yazılımı, RNA kalite kantitatif bir ölçüm olarak, bir RNA Bütünlük sayısı, ya da RIN hesaplar. 9 daha yüksek RIN değerleri ile yüksek kaliteli ses örnekleri, mikroarray uygulamalar için en iyi tabii ki. Ancak, makul kalite mikroarray veri üreten 5.2 gibi düşük RIN değerleri örnekleri kullanmıştır. İyi kaliteli diziler, nispeten düşük PMT değerleri yüksek sinyal üretmek gerekir. Yaptığımız denemelerde, transkript çoğu deneysel ve referans örnek benzer seviyelerde mevcut olması bekleniyor; gen ekspresyonu kitlesel, yaygın değişiklikler muhtemelen herhangi bir biyolojik önemi yoksun olacak. Bu nedenle, dizi, yeşil ya da kırmızı yerine daha sarı görünmelidir. İyi kalite sinyalleri de sinyal histogramlar tam örtüşme böyle bir dinamik aralık olmalıdır. Örnekler için, bakınız şekil 2. <img src="/files/ftp_upload/2546/2546fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 insan beyninde tümör dokusundan izole edilen dört RNA örnekleri örneği . RNA 3.1.1 sunulan protokolü kullanılarak izole edilmiştir. Örnek kalite 3.1.3 'te açıklandığı gibi bir RNA 6000 çipi, 2100 Bioanalyzer kullanılarak ölçüldü. Örnekleri 4 farklı RNA nitelikleri temsil etmektedir: A, çok iyi bir RNA kalitesi (RIN&gt; 9), B, kısmen bozulmuş RNA (RIN 5-6, 28S rRNA için önemli ölçüde daha düşük tepe dikkat edin); C, son derece bozulmuş RNA (RIN &lt; 3); D, neredeyse tamamen bozulmuş RNA (RIN = 2). Biz downstream mikroarray uygulamaları için benzer ya da B (RIN&gt; 5.2) daha iyi niteliklere sahip örnekleri başarıyla kullanılmaktadır. Katı ve açık ok uçları, 18S ve 28S rRNA türler sırasıyla konumu, göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/2546/2546fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 dizisi görüntüleri ve dağılım araziler örnekleri. 4X44K Agilent formatında dört dizileri gösteren, tüm slayt önizleme, B, dizi alanlarından biri olan yüksek çözünürlüklü tarama, sinyallerin ne (kırmızı veya yeşil) baskın olduğuna dikkat, C, görüntü scatter plot B sinyalleri tamamen örtüşen ve artık daha 1x10 -6 özellikleri doyurarak yoğunlukta olduğunu unutmayın.

<ol><li>Diaz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+Decade+Later%3A+What+has+Gene+Expression+Profiling+Told+us+About+Neuronal+Cell+Types%2C+Brain+Function+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">One Decade Later: What has Gene Expression Profiling Told us About Neuronal Cell Types, Brain Function and Disease.</a> Curr Genomics. 10, 318-318 (2009).</li>
<li>Barisone, G. A. Expression profiling in Neuroscience, edited by Ioannis Karamanos. , SPRINGER SCIENCE+BUSINESS MEDIA, LLC. New York. (2010).</li>
<li>Gelder, R. N. V. an <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 1663-1663 (1990).</li>
</ol>

DNA mikrodizilerinin İfade profil iki biyolojik örnekler arasında farklı genlerin tanımlamak için basit bir yaklaşım sağlar. Başarılı ifade profil deneyleri, yüksek kalite RNA örnekleri, sağlam bir etiket ve hibridizasyon gerektirir. Agilent ticari diziler ve etiketleme kitleri Deneyimlerimize göre, makul bir maliyetle yüksek kaliteli veri sağlar. Agilent de kendi hibridizasyon ve tarama makineleri sunarken, biz Roche-NimbleGen ve Moleküler Cihazlar GenePix 4000B mikroarray tarayıcı melezleme sistemi lehine. Roche-NimbleGen hibridizasyon ünitesi eski Maui melezleme sistemi olarak bilinen olduğunu unutmayın. Roche&#39;un yeni şirket satın alınmasından sonra, A4 karıştırıcılar üretilmiyor edilmiştir. Bu yazının yazıldığı an itibariyle hala Kreatech Diagnostics (diğer satıcılar aracılığıyla olabilir <a href="http://www.kreatech.com/">www.kreatech.com</a> , bu web sitesi de uygun bir dizi uyumluluk aracı sunuyor), ancak uzun vadeli stok durumu belirsiz. Diğer hibridizasyon sistemleri (örneğin, Agilent) mevcuttur; Ancak, dizi olduğu için uyumlu karıştırıcı olabilir, biz kalite ve tekrarlanabilirlik için Roche-NimbleGen sistem öneriyoruz.

<table><tbody><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2943CA</td><td>çip hazırlama istasyonu, vorteksleyici, yazılım ve dizüstü bilgisayar içerir</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer elektroforez seti</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2947CA</td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano kiti</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td>boyut merdiveni, marker, jel matrisi, boya, elektrot temizleyiciler, spin filtreler ve nanoçipler içerir</td></tr><tr><td>RNase Zap</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM9780M</td><td></td></tr><tr><td>Quick Amp işaretleme kiti, iki renkli</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-0444</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Gen Ekspresyonu Hibridizasyon Kiti</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-542</td><td>Bloke edici ajan, Fragmentasyon tamponu ve Hibridizasyon tamponu içerir</td></tr><tr><td>Gen Ekspresyonu Yıkama Tamponu Kiti</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-5327</td><td>Yıkama Tamponları 1 ve 2 ile Triton X-102 içerir</td></tr><tr><td>Hibridizasyon İstasyonu</td><td>Roche Group</td><td>05223652001</td><td>4 lamlı model</td></tr><tr><td>Hibridizasyon Sistemi Aksesuar Kiti</td><td>Roche Group</td><td>05327695001</td><td>karıştırma testi için doğrulama düzeneği, yedek O-ringler, sökme aleti, pens ve brayer içerir</td></tr><tr><td>A4 mikser hibridizasyon odaları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tüm İnsan Genomu (4x44) Oligo Mikroarray</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4112F</td><td></td></tr><tr><td>Pozitif deplasmanlı pipet</td><td>Gilson, Inc.</td><td>F148504</td><td></td></tr><tr><td>Pozitif deplasmanlı pipet için kapiler pistonlar</td><td>Gilson, Inc.</td><td>F148415</td><td></td></tr><tr><td>Mikroarray kurutucu</td><td>Nimblegen</td><td>05223636001</td><td></td></tr><tr><td>Mikroarray floresan tarayıcı, Axon GenePix 4000B</td><td>Molecular Devices</td><td>GENEPIX4000B</td><td></td></tr><tr><td>GenePix Pro 6.0 yazılımı</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dna mikroarray&#39;ler: Örnek kalite kontrol, dizi hibridizasyon ve tarama

DNA Microarrays: Sample Quality Control, Array Hybridization and Scanning

Sinir sistemi Mikroarray ifade profil, genel olarak, deneysel olarak test edilmektedir 1 herhangi bir durum farklı gelişim aşamalarında, farklı fizyolojik veya patolojik durumlar, tedaviye yanıt, gen faaliyetlerinin belirlenmesi ve güçlü bir yaklaşım sağlar. Sinir dokularının İfade profil izolasyonu yüksek kalitede RNA, izole edilmiş DNA, RNA ve DNA mikrodizilerinin hibridizasyon amplifikasyonu gerektirir. Bu yazıda, beyin tümörü doku 2, tekrarlanabilir mikroarray deneyler için protokolleri açıklar . Biz hücresi 2100 Bioanalyzer &quot;lab-on-a-chip&quot; teknolojisi ile izole RNA örneklerinde bir kalite kontrol analizleri yaparak başlayacak. Yüksek kaliteli RNA örnekleri herhangi bir mikroarray deneyinin başarısı için kritik öneme sahiptir ve 2100 Bioanalyzer örnek kalitesini hızlı bir şekilde, kantitatif bir ölçüm sağlar. RNA örnekleri sonra amplifiye ve cDNA elde etmek için ters transkripsiyon gerçekleştirerek etiketli etiketli Crna üretmek için etiketli nükleotidlerin varlığı in vitro transkripsiyon izledi. Çift renkli etiketleme kiti kullanılarak, biz Cy3 ve Cy5 ile referans örnek ile deneysel numune etiketi. Her iki örnek daha sonra birleştirilir ve Agilent 4x44 K dizileri için melezleşmiştir olacaktır. Çift renkli diziler, böylece iki RNA örnekleri tek bir mikroarray rekabetçi melezleşmiştir çünkü ifade seviyelerinde küçük değişiklikler için, özellikle de ölçümlerin doğruluğu arttırarak, iki RNA örnekleri arasında doğrudan bir karşılaştırma avantajı sunuyoruz. Diziler ilgili iki dalga boylarında taranmış olacak ve her özellik için Cy3 Cy5 sinyal oranı göreceli bolluk ilgili mRNA doğrudan bir ölçü olarak kullanılır. Bu analiz, farklı test edilen deneysel koşullara yanıt olarak ifade edilir genler belirler.

Biz sinir sistemi ifade profil için DNA mikrodizilerinin kullanımını göstermektedir. Biz, RNA kalite kontrol, örnek etiketleme ve dizi hibridizasyon ve tarama açıklar.

DNA Mikroarray&#39;ler: Örnek Kalite Kontrol, Dizi Hibridizasyon ve Tarama

Sinir sisteminin mikroarray ekspresyon profillemesi, gelişimin farklı aşamalarındaki gen aktivitelerinin belirlenmesi için güçlü bir yaklaşım sunar, ...

Bu prosedürün genel amacı, otomatik bir karıştırıcı düzenek kullanarak bir mikroarray deneyi gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle RNA amplifikasyonu ve işaretlemesinin ardından RNA örneklerinin kalitesinin bioanalyzer ile analiz edilmesiyle gerçekleştirilir. RNA örnekleri mikroarray'lere hibridize edilir.Son olarak, hibridize edilmiş mikro-diziler yıkanır ve taranır. Nihayetinde, çift renkli floresan mikro-dizi görüntülerinin analizi yoluyla RNA transkriptlerinin diferansiyel ekspresyonunu gösteren sonuçlar elde edilir. Mikro-dizi hibridizasyon adımlarının uzmanlık gerektiren ekipmanlar nedeniyle öğrenilmesinin zor olması sebebiyle, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir.Kalite kontrol analizi, yazılı prosedürde belirtildiği şekilde 2, 100 bioanalyzer cihazının ve çip hazırlama istasyonunun hazırlanmasıyla başlar. Ardından, RNA 6, 000 nano kit santrifüj ile birlikte verilen bir spin filtreye 550 µL pipetlenerek jel matrisi filtrelenir. Filtre, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1, 500 RCF'de santrifüj edilir.Ardından, filtre edilen jeli, dört °C'de bir aya kadar saklanabilen 65 µL'lik alikotlara ayırın. Boya konsantresini 10 saniye boyunca vorteksleyin ve 65 µL'lik bir alikota bir µL ekleyin. Karışımı vorteksledikten sonra, örnekleri çalıştırmak için filtre edilmiş jeli oda sıcaklığında 13.000 RCF'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Öncelikle bir çipi hazırlama istasyonuna yerleştirin. Bu demonstrasyonda, RNA 6,000 nano chipps kullanılmıştır. Siyah arka plan üzerinde beyaz G ile işaretlenmiş kuyuya dokuz µL jel boyası karışımı yükleyin.Pipet ucu kuyucuğun en altına yerleştirilmiş haldeyken, şırınga pistonunu bir mililitre konumuna getirin ve hazırlama istasyonunu kapatın. Piston, klips tarafından tutulana kadar yavaş ama istikrarlı bir şekilde aşağıya doğru bastırın.30 saniye sonra klipsi serbest bırakın ve pistonun birkaç saniye yükselmesine izin verin. Piston durduğunda, pistonu tekrar bir mililitre konumuna çekin ve ön hazırlama istasyonunu açın. Dokuz mikrolitre jel boyası yükleyin.İki kuyucuğun her birinde karıştırın. Mark G'yi işaretleyin. Ardından, işaretleyiciden beş µL'yi merdiven kuyucuğuna ve 12 örnek kuyucuğunun her birine ekleyin. Son olarak, denatüre edilmiş merdivenden bir µL'yi merdiven kuyucuğuna ve denatüre edilmiş her bir örnekten bir µL'yi örnek kuyucuklarına yükleyin.Son olarak, kullanılmayan her örneğin kuyucuğuna bir µL marker ekleyin. Yükleme tamamlandıktan sonra, çipi 2.400 RPM'de bir dakika boyunca vorteksleyin. 2.100 expert yazılımını başlattıktan sonra, çipi yerleştirin ve kapağı kapatın.Buharlaşmayı önlemek için doğru portun seçili olduğundan emin olun ve örnekleri yükledikten sonra beş dakika içinde analizle başlayın. RNA amplifikasyonu ve işaretlemesi için uygulanacak yöntemler yazılı protokolde yer almaktadır. İşaretleme tamamlandıktan sonra, bağlanmamış nükleotidleri uzaklaştırmak için cogens r an easy mini kolonlar kullanarak CRNA'yı saflaştırın; ardından işaretli CRNA, NanoDrop 2000 spektrofotometre ile kantifiye edilebilir.Mikrodizilim ölçüm modunda; örnek konsantrasyonunu, verimi ve spesifik aktiviteyi kaydedin. Mikrodizilim hibridizasyonu için, hibridizasyondan en az iki saat önce en az 825 nanogram verim ve mikrogram başına en az sekiz pikomol spesifik aktivite elde edilmesi gereklidir. Hibridizasyon istasyonunu açın ve 65 °C'ye ayarlayın.Bu protokol, Roche nimble gen hibridizasyon sistemi ve dört karıştırıcı haznenin, yazılı protokolde açıklandığı şekilde gerçekleştirilen cRNA fragmentasyonunun ardından Agilent 4x40 4K dizileri ile kullanımını açıklamaktadır; hibridizasyon haznesini hazırlayın. Bir mikroarray lamını, barkod tarafı gelecek şekilde montaj-demontaj aracına yerleştirin. Önce bir A4 karıştırıcıyı açın ve diziyi ile montaj-demontaj aracını sabit tutarak herhangi bir hareketi önlemek için yapıştırıcıyı açığa çıkarın.A dörtlü karıştırıcıyı, en uçtan başlayarak lamın üzerine yerleştirin. Karıştırıcının aletle doğru şekilde hizalandığından emin olun ve karıştırıcıyı dizi boyunca yapıştırın. Lam-karıştırıcı düzeneğini çıkarmak için lamı karıştırıcının ucundan çekin.Yapışkan contanın lama sıkıca yapışmasını sağlamak için braying aracını kullanarak tüm hat boyunca bastırın. Yapışkan ile lam arasında hapsolmuş küçük hava kabarcıkları koyu arka planda görülebilir. Bu kabarcıkları braying aracıyla gidermek için ekstra zaman ayırın.Dizi artık yüklemeye hazırdır. Hibritleme örneğinden 100 µL yüklemek için pozitif yer değiştirme pipeti kullanın. Ucu port deliğinin içine sıkıca itin ve hava kabarcıklarının dizi alanında sıkışmaması için yavaşça ve pürüzsüz bir şekilde boşaltın.Numune tüm diziyi kapladığında ve sıvı havalandırma portundan çıkmaya başladığında, pipeti hızla çekin ancak pistonu sadece serbest bırakın. Uç lamdan uzaklaştığında, numuneyi haznenin kendisinden çekmemeye dikkat ederek her iki porttaki fazla sıvıyı nazikçe kurulayın. Ardından, cımbız kullanarak port deliklerini çıkartmalarla kapatın.Lamı hibridizasyon istasyonuna yerleştirin ve mesane deliklerinin O halkalarının üzerine doğru şekilde konumlandığını kontrol edin. Bu, hibridizasyon sırasında uygun karışımın sağlanmasını sağlayacaktır. Lam kapağını ve istasyon kapağını kapatın.İstasyonu karıştırma modu B'ye ayarlayın ve diziyi 65 °C'de 17 saat boyunca hibridize edin. İşlem tamamlandığında, A olarak etiketlenmiş cam kabı bir numaralı yıkama tamponu ile doldurun; kap, montaj sökme aparatını alabilecek ve belirli bir hareket alanı sağlayacak kadar büyük olmalıdır. Tüm yıkama işlemleri cam malzemelerde gerçekleştirilmelidir, çünkü plastikler bileşik sızdırma eğilimindedir ve bu durum dizide yüksek arka plan gürültüsüne neden olur.Bir boyama kabının içine bir lam rafı ve bir manyetik karıştırıcı çubuk yerleştirin. B olarak etiketlenen bu kabı, rafı örtecek kadar yıkama tamponu one ile doldurun ve kabı oda sıcaklığındaki bir manyetik karıştırıcı üzerine yerleştirin. Ayrıca, C olarak etiketlenen boş bir boyama kabına bir manyetik karıştırıcı çubuk ekleyin ve bunu da bir manyetik karıştırıcı üzerine yerleştirin.Diziyi hibridizasyon istasyonundan çıkarın ve montaj sökme aracına yerleştirin. Montaj sökme aracını ve lamı bir elinizle karşılıklı taraflardan tutarken, tüm düzeneği bir kap içindeki sıvıya daldırın. Dizi alanini çizmemeye dikkat ederek A4 karıştırıcıyı dikkatlice soyup çıkarın.Lamı hızla rafa ve B boyama kabına yerleştirin. SCI beş boyası ozona karşı duyarlı olduğundan havaya maruz kalma minimize edilmelidir. Bir dakika boyunca orta hızda karıştırarak yıkayın. C boyama kabını önceden ısıtılmış yıkama tamponu iki ile doldurun.Lamları aktarın ve bir dakika boyunca yıkayın. Yıkama işleminden sonra, lam üzerinde damlacık kalmasını en aza indirmek için lam rafını boyama kabı C'den çok yavaşça çıkarın. Lamı iki dakika boyunca santrifüjleyerek kurulayın.Ardından lamı 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin ve argon gazı ile doldurun; sinyal kaybını önlemek için Molecular Devices marka GenePix 4,000 B tarayıcı ile hemen tarama yapın. Burada insan beyninden izole edilmiş dört RNA örneği yer almaktadır. Tümör dokusu örnek kalitesi, RNA 6,000 çipi üzerinde 2,100 bioanalyzer kullanılarak değerlendirilmiştir.Dolu ve açık ok uçları sırasıyla 18 s ve 28 S-R-R-N-A türlerinin konumlarını belirtmektedir. RNA bütünlük numarası veya RIN, RNA kalitesinin nicel bir ölçümüdür; yüksek kaliteli Total RNA örnekleri, kalite kontrol amacıyla bir bioanalyzer'da çalıştırıldığında, iki ana ribozomal RNA türüne karşılık gelen yalnızca iki ana pik oluşturmalıdır.Bazı RNA degradasyonları, ilk ribozomal RNA piki öncesinde bir yayılma (smear) şeklinde görülür ve ciddi derecede degrade olmuş örneklerde 28 S-R-R-N-A piki belirgin şekilde daha düşük olur. Düşük kaliteli RNA, düşük tutunma sürelerinde geniş bir pik veya bir dizi pik şeklinde görülür. Bu durumda, iki ribozomal RNA piki ya çok düşük yoğunlukta olur ya da hiç tanımlanamaz.Kaliteli diziler, nispeten düşük PMT değerlerinde yüksek sinyal üretmelidir. Transkriptlerin çoğunun, deneysel ve referans örneklerde benzer seviyelerde bulunması beklenir. Gen ifadesindeki yaygın ve kitlesel değişiklikler muhtemelen herhangi bir biyolojik önem taşımayacaktır.Bu nedenle, dizinin çoğu yeşil veya kırmızıdan ziyade sarı görünmelidir. İyi kaliteli sinyaller ayrıca, dizi görüntüsünün dağılım grafiğinde görüldüğü gibi, sinyal histogramlarının tamamen örtüştüğü bir dinamik aralıkta olmalıdır. Bu videoyu izledikten sonra, otomatik bir hibridizasyon cihazı kullanarak mikro-dizi deneyiyle nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

dna-microarrays-sample-quality-control-array-hybridization

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video için hibridizasyon protokol arşiv formalin sabit malzeme de dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan izole edilebilen DNA sadece 25-100 ng kullanarak tüm insan genom taramaları tüm genom döşeme yol Array CGH, teknik bir gösteri.

Tüm Genom Dizisi Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon Teknik gösteri

Gen mikroarray'ler genom düzeyinde gen ekspresyonu güçlü araçlardır. Bu teknoloji, gelişim biyolojisi ve toksikoloji de dahil olmak üzere biyolojik disiplinlerin çeşitli uygulaması vardır. Bu video zebrafish için kapsamlı bir oligonükleotid mikroarray platformunu kullanarak küresel gen ekspresyon analizi için detaylı bir protokoldür.

Zebra balığı Oligonükleotid Mikroarray Platformu kullanarak Global Gen İfadesi Analizi

Pre-mRNA geçici doğası nedeniyle, izole etmek ve incelemek için zor...

İnsan pre-mRNA üzerinde Haritalama Ribonucleoproteins Hızlı Yüksek verim için Yöntemi (RNPs)

ampliPHOX kolorimetrik algılama teknolojisi mikroarray'ler için floresan tespiti için ucuz bir alternatif olarak sunulmaktadır. AmpliPHOX fotopolimerizasyon dayanarak, sadece birkaç dakika içinde çıplak gözle görülebilen katı polimer lekeler oluşturur. Sonuçlar basit ama güçlü bir yazılım paketi ile görüntülü ve sonra otomatik olarak yorumlanır.

Grip için DNA Mikroarray ampliPHOX Kolorimetrik Algılama

Biz gen-ilaç ve gen-çevre etkileşimleri anlamak için kapsamlı, tarafsız genom ekranlar geliştirdik. Bu mutant koleksiyonlarını tarama yöntemleri sunulmaktadır.

Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar

Özel microRNA mikroarray deneyler basit bir prosedür açıklanmıştır. Adımlar, RNA, etiketleme RNA ve referans DNA izole mikroarray'ler için örnekleri literatürde, mikroarray'ler tarama ve niceleme hibridizasyon sinyalleri analiz içerir.

Özel MicroRNA Mikroarray deneyler gerçekleştirme

Bu video makalede, iki bileşenli bir sistem yanıt düzenleyici gen hedef ve birleştirme bölgelerini belirlemek için bir in vitro mikro-dizi göre bir yöntem açıklanır.

Bakteriyel için iki bileşenli Düzenleme Sistemleri Gen Hedefler belirlemek için DNA afinite-saflaştırılmış Chip (DAP-chip) Yöntem

Genomik kopya sayısı varyantları tespiti için Dizi CGH G-bantlı karyotip analizi yerini aldı. Bu kağıt teknolojisi ve teşhis hizmet laboratuvarında uygulanmasını açıklar.

Genomik Kopya Sayısı Variantların Algılama için dizi Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon (CGH Array)

Bu iletişim kuralı kopya numarası değişimler tüm genom dizi tabanlı Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH) analizi yürütmektedir ilgilenen araştırmacılar için deneysel adımlar ve reaktifler, ekipman ve çözümleme araçları hakkında bilgi sağlar bitkiler.

Dizi tabanlı Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon için bir Platform verimli algılama varyasyonları kopya numarası hızlı nötron kaynaklı Medicago truncatula mutantlar içinde

Bu makalede, yerinde üretilen nükleik asit mikrodizilerinin sentezi ve uygulamalarındaki yeni gelişmeleri sunmakta ve tartışıyoruz. Özellikle, DNA sentezi protokollerinin RNA'ya nasıl genişletilebileceğini ve mikrodizilerin geri alınabilir nükleik asit kitaplıkları oluşturmak için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Yüksek Yoğunluklu DNA ve RNA mikrodizileri - Fotolitografik Sentez, Hibridizasyon ve Büyük Nükleik Asit Kütüphanelerinin Hazırlanması

Öğrenin DNA mikroarray deneylerinde RNA kalite kontrolü, hibridizasyon ve tarama adımlarını otomatikleştirilmiş sistemle nasıl gerçekleştirilir. Bu yöntem sinir sistemi gen ekspresyon profillemesi için güvenilir veri sağlar.

DNA Mikroarray'ler: Örnek Kalite Kontrol, Dizi Hibridizasyon ve Tarama

Daha fazla video keşfet