DNA Mikroarray'ler: Örnek Kalite Kontrol, Dizi Hibridizasyon ve Tarama

Bu prosedürün genel amacı, otomatik bir karıştırıcı aparat kullanarak bir mikrodizi deneyi yapmaktır. Bu, önce RNA amplifikasyonu ve etiketlemeyi takiben RNA örneklerinin kalitesinin biyoanalizör ile analiz edilmesiyle gerçekleştirilir. RNA örnekleri mikrodizilere hibritlenir.

Son olarak, hibritleştirilmiş mikrodiziler yıkanır ve taranır. Sonuç olarak, çift renkli floresan mikrodizi görüntülerinin analizi yoluyla RNA transkriptlerinin diferansiyel ekspresyonunu gösteren sonuçlar elde edilir. Bu yöntemin görsel gösterimi, özel ekipman nedeniyle mikrodizi hibridizasyon adımlarının öğrenilmesi zor olduğu için kritik

Kalite kontrol analizi, yazılı prosedürde belirtildiği gibi 2.100 biyoanalizör cihazı ve talaş hazırlama istasyonunun hazırlanması ile başlar. Jel matrisi daha sonra 550 mikrolitrelik pipetlenerek RNA 6.000 nano kit santrifüjü ile sağlanan bir spin filtreye süzülür. Filtre, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1.500 RCF'de.

Daha sonra filtrelenmiş jeli, bir aya kadar dört santigrat derecede saklanabilen 65 mikrolitrelik alikotlara ayırın. Boya konsantresini 10 saniye boyunca girdaplayın ve 65 mikrolitrelik bir alikot'a bir mikrolitre ekleyin. Numuneleri çalıştırmak için karışım santrifüjünü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 13.000 RCF'de girdapladıktan sonra filtrelenmiş bir jel.

İlk olarak, doldurma istasyonuna bir çip yerleştirin. Bu gösteride, RNA 6.000 nano yonga kullanılmıştır. Siyah arka plana karşı beyaz bir G ile işaretlenmiş kuyuya dokuz mikrolitre jel boya karışımı yükleyin.

Pipet ucu kuyunun en altına yerleştirilmişken. Şırınga pistonunu bir mililitreye yerleştirin ve doldurma istasyonunu kapatın. Pistonu klips tarafından tutulana kadar yavaş ama sabit bir şekilde aşağı bastırın.

30 saniye sonra klipsi serbest bırakın ve pistonun birkaç saniye yükselmesine izin verin. Piston durduktan sonra, pistonu tekrar bir mililitre konumuna çekin ve doldurma istasyonunu açın. Jel kalıbından dokuz mikrolitre yükleyin.

İki kuyucuğun her birinde karıştırın. Mark G.Daha sonra işaretleyiciden beş mikrolitreyi merdiven kuyusuna ve 12 numune kuyusunun her birine yerleştirin. Bir sonraki yük, merdiven kuyusundaki denatüre merdivenin bir mikrolitresi ve her denatüre edilmiş numunenin bir mikrolitresi numune kuyucuklarına.

Son olarak, kullanılmayan her numuneye bir mikrolitre işaretleyici ekleyin. Bir kez yüklendikten sonra, çipi 2.400 RPM'de bir dakika boyunca vorteksleyin. 2.100 uzman yazılımı başlattıktan sonra çipi konumlandırın ve kapağı kapatın.

Doğru portun seçildiğinden emin olun ve buharlaşmayı önlemek için numuneleri yükledikten sonra beş dakika içinde testi çalıştırın. RNA amplifikasyonu ve etiketleme yöntemleri yazılı protokolde bulunabilir. Etiketlendikten sonra, dahil edilmemiş nükleotidleri çıkarmak için CRNA'yı saflaştırın Kolay bir mini sütun olan kojenler kullanılarak, etiketli CRNA daha sonra bir NanoDrop 2000 spektrum fotometresi ile ölçülebilir.

Mikrodizi ölçüm modunda, kayıt, numune konsantrasyonu, verim ve spesifik aktivite. Mikrodizi hibridizasyonuna göre, mikrodizi hibridizasyonundan en az iki saat önce en az 825 nanogramlık bir verim ve mikrogram başına en az sekiz pikomollük bir spesifik aktivite elde etmek gerekir. Hibridizasyon istasyonunu açın ve 65 santigrat dereceye ayarlayın.

Bu protokol, Roche çevik gen hibridizasyon sistemi ile Agilent dörtlü 40 adet 4K dizisinin kullanımını ve yazılı protokolde anlatıldığı gibi gerçekleştirilen CRNA parçalanmasını takiben dört karıştırıcı odasını hazırlar ve hibridizasyon odasını hazırlar. Montaj sökme aleti barkod tarafına bir mikrodizi sürgü yerleştirin. Önce bir A dört karıştırıcı açın ve herhangi bir hareketi önlemek için diziyi ve montaj sökme aletini tutan yapıştırıcıyı açığa çıkarın.

A dört karıştırıcıyı en uçtan başlayarak slaydın üzerine yerleştirin. Alete doğru şekilde hizalandığından emin olun ve mikseri dizi boyunca yapıştırın. Sürgülü karıştırıcı tertibatını çıkarmak için karıştırıcının ucundan kaydırarak çekin.

Braying aletini kullanarak, sürgüye sıkıca yapıştığından emin olmak için yapışkan contanın her yerine bastırın. Yapışkan ve slayt arasında sıkışan küçük hava kabarcıkları koyu arka planda görülebilir. Braying aletiyle bu baloncukları çıkarmak için fazladan zaman ayırın.

Dizi artık yüklenmeye hazırdır. 100 mikrolitre hibridizasyon numunesi yüklemek için pozitif yer değiştirmeli bir perpet kullanın. Ucu lombozun içine sıkıca itin ve havanın dizi alanında sıkışmaması için yavaş ve yumuşak bir şekilde dağıtın.

Numune tüm diziyi kapladığında ve havalandırma portundan sıvı çıkmaya başladığında, pipeti hızlı bir şekilde çıkarın, yalnızca pistonu serbest bırakın. Uç slayttan uzaklaştığında, fazla sıvıyı her iki porta da hafifçe vurun, numuneyi haznenin kendisinden çekmemeye dikkat edin. Daha sonra cımbız kullanarak lombozları çıkartmalarla kapatın.

Sürgüyü hibridizasyon istasyonuna yerleştirin ve mesane deliklerinin O halkaları üzerine doğru şekilde yerleştirildiğini kontrol edin. Bu, hibridizasyon sırasında uygun karıştırmayı sağlayacaktır. Sürgülü kapağı ve istasyon kapağını kapatın.

İstasyonu karıştırma modu B'ye ayarlayın ve diziyi 17 saat boyunca 65 santigrat derecede hibritleyin. Bir yıkama tamponu ile A etiketli dolgu cam kabı bittiğinde, çanak montaj sökme aletini tutacak ve aynı zamanda biraz manevraya izin verecek kadar büyük olmalıdır. Plastik, bileşikleri sızma eğiliminde olduğundan ve dizide yüksek arka plana neden olduğundan, tüm yıkamalar cam eşyalarda yapılmalıdır.

Bir boyama kabına bir sürgülü raf ve bir karıştırma çubuğu koyun. B etiketli, kabı rafı kaplayan bir yıkama tamponu ile doldurun ve kabı oda sıcaklığında bir karıştırma plakasına yerleştirin. Ayrıca, C etiketli boş bir boyama kabına bir karıştırma çubuğu ekleyin ve bir karıştırma plakasına yerleştirin.

Diziyi hibridizasyon istasyonundan çıkarın ve montaj sökme aletine yerleştirin. Montaj sökme aletini ve karşı taraflardan sürgüyü bir elinizle tutarken tüm tertibatı bir tabağa daldırın. Dizi alanını çizmemeye dikkat ederek A four mikserini dikkatlice soyun.

Slaytı hızlı bir şekilde rafa ve boyama kabına yerleştirin B. SCI beş boya ozona duyarlı olduğundan havaya maruz kalma en aza indirilmelidir. Silme işlemini orta hızda karıştırarak bir dakika yıkayın. Boyama kabını C ön sıcak yıkama tamponu iki ile doldurun.

Slaytları aktarın ve bir dakika boyunca yıkayın. Çok yavaş yıkadıktan sonra, slayt üzerinde kalan damlacıkları en aza indirmek için sürgülü rafı boyama kabı C'den çıkarın. Slaytı iki dakika döndürerek kurutun.

Daha sonra slaytı 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin ve gösterilen sinyal kaybını önlemek için moleküler cihazlardan 4.000 B tarayıcı gen kazmasını kullanarak hemen argon gazı taraması ile doldurun. İşte insan beyninden izole edilen dört RNA örneğinin örnekleri. Tümör dokusu örnek kalitesi, bir RNA 6.000 çip üzerinde 2.100 biyoanalizör kullanılarak değerlendirildi.

Düz ve açık ok uçları sırasıyla 18 s ve 28 S-R-R-N-A türünün konumunu gösterir. RNA bütünlük sayısı veya RIN, RNA kalitesinin, iyi kalite Toplamının nicel bir ölçümüdür. RNA örnekleri, iki ana ribozomal RNA türüne karşılık gelen kalite kontrol için bir biyoanalizörde çalıştırıldığında yalnızca iki ana tepe noktası üretmelidir.

Bazı RNA bozunması, ilk ribozomal RNA zirvesinden önce bir yayma olarak ve 28 S-R-R-N-A için önemli ölçüde daha düşük bir tepe olarak ciddi şekilde bozulacaktır. Düşük kaliteli RNA, düşük tutma sürelerinde geniş bir tepe noktası veya bir dizi tepe noktası gösterecektir. İki ribozomal RNA zirvesi çok düşük bir yoğunlukta olacak veya hiç tanımlanamayacak şekilde olacaktır.

Kaliteli diziler, nispeten düşük PMT değerlerinde yüksek sinyal üretmelidir. Transkriptlerin çoğunun deneysel ve referans örneklemde benzer seviyelerde bulunması beklenmektedir. Gen ekspresyonundaki büyük yaygın değişiklikler muhtemelen herhangi bir biyolojik öneme sahip olmayacaktır.

Bu nedenle, dizinin çoğu yeşil veya kırmızı yerine sarı görünmelidir. İyi kaliteli sinyaller ayrıca, dizi görüntüsünün dağılım grafiğinde görüldüğü gibi sinyal histogramlarının tamamen örtüşeceği dinamik bir aralıkta olmalıdır. Bu videoyu izledikten sonra, otomatik bir hibridizasyon aparatı kullanarak bir mikrodizi deneyinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.