Name: Apoptozis sırasında Mitokondrial Kalsiyum Düzeyleri Dinamik değişiklikler izlenmesi Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensor Kullanımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Öğrenin canlı hücrelerde mitokondriyal kalsiyum dinamiklerini ratiometric pericam-mt ile gerçek zamanlı izleme yöntemini. Bu teknik, hücresel metabolizma ve sinyal yolakları hakkında önemli bilgiler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz Atsushi Miyawaki oranlı metrik pericam mt ifade inşa bize sağladığı için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri (DB) hibe GM081685 tarafından da desteklenmiştir.

1. Pericam mt Transfeksiyon ve Hücre hazırlanması. <ol><li> Levha HeLa hücrelerinde standart 6 kuyu kültür plaka yerleştirilen steril cam lamelleri transfeksiyon önce gece. </li><li> DNA / Lipofectamine 2000 kompleksleri üreticisi (Invitrogen) tarafından önerildiği gibi hazırlayın. Biz oranlı metrik pericam-mt ifade vektör 4 mg ve her bir kuyu için 0.5 ml Opti-MEM seyreltilmiş Lipofectamine 2000 10 mcL kullanın. Hücreleri ~% 70 konfluent transfeksiyon önce olmalıdır. </li><li> 1.5 mL antibiyotik olmadan aynı medya ile her bir kuyunun HeLa kültür ortamı (Dulbecco'nun modifiye kartal orta,% 10 FBS, penisilin / streptomisin) değiştirin. </li><li> DNA / Lipofectamine kompleksleri, her iyi transfekte ekleyin. 37 o C,% 5 CO 2 hücre kültürü inkübatör 4 saat inkübe ile sallanan ve hafifçe karıştırın. </li><li> Antibiyotikler ile kültür ortamı ile antibiyotik ücretsiz medya değiştirin. Hücreleri görüntüleme 1-2 gün önce oranlı metrik pericam ifade etmek için izin verin. </li></ol> 2. Mikroskop Kurulum ve Image Acquisition <ol><li> HeLa hücreleri ile bir lamel: 107mm NaCl, 7.2mm KCl, 1.2mm MgCl 2, 1mm CaCl 2, 11.5mm glikoz,% 0.1 sığır serum albümin ve 20mm Hepes 7.2 görüntüleme çözümü ile uygun bir görüntüleme odasının içine yerleştirin. Laboratuvarımız Invitrogen Attofluor hücre odasına kullanır. Ters bir mikroskop aşamada görüntüleme odasının monte edin. </li><li> Faiz oranlı metrik pericam bir 40x (veya üstü) immersiyon yağı hedefi kullanarak ifade bir ya da daha fazla hücre içeren bir alan bulun. Biz oranlı metrik pericam 380 nm dalga photobleaching daha az dirençli olduğunu buldular ve böylece biz uygun hücreleri tanımlamak için bu dalga boyu kullanabilirsiniz. Şekil 1 'de elde edilen görüntüler için, 1.3 sayısal diyafram ile Nikon Superfluor 40X objektif kullanıldı. Yüksek büyütme hedefleri de (60-100x) uygun olacaktır. Krom Teknoloji filtreler D380/30x kullanılan Tahrik olma filtreler (380 + / - 30 nm) ve D495/10 (495 + / - 5 mil), ışın dağıtıcı 505DCXR (505nm longpass) ve emisyon filtresi HQ535/50m (535 + / - - 25nm). Şekil 1 görüntüleri elde etmek için kullanılan mikroskop bir Roper Bilimsel Coolsnap HQ CCD kamera, Ludl MAC6000 hızlı filtre çarkı ve değiştirici, soğutmalı bir MetaFluor veri toplama ve analiz yazılımı ile donatılmış Nikon TE2000 inverted mikroskop oluşur. Bu protokol, uygun filtre ve oranlı metrik görüntü yakalama ve işleme yeteneğine sahip yazılımlar ile herhangi bir standart geniş alan mikroskobu adapte edilebilir. </li><li> 495 ve 380 nm filtreleri kullanarak çift uyarma için yazılımı kurun. Oranlı metrik pericam bağlayıcı Kalsiyum 495 nm'de absorbans artar, böylece oranı, 495 nm/380 nm için ayarlanmış olmalıdır. Oranlı metrik pericam 415 nm 4 kalsiyum uyarma tepe vardır. Çoğu kalsiyum görüntüleme laboratuvarlarda her yerde, çünkü sadece bu protokolde 380 nm filtre kullanmanızı öneririz. 410 nm filtre varsa, 380 nm filtre için tercih edilir. </li><li> Sırayla 495 ve 380 nm alternatif heyecan verici görüntüler elde. Perfüzyon aparatı ile agonist uygulamadan önce en az 30 için başlangıç ​​kalsiyum düzeylerinin görüntüler elde. Her agonist için ek süre işaretleyin. Pozlama süreleri ve satın alma aralıkları agonist stimülasyon yanıt izlenen yarı-hızlı kalsiyum dinamikleri için hala yeterli zaman resolution.For Örneğin izin verirken, photobleaching önlemek için optimize edilmelidir görüntüleri Şekil 1B ve C Çok daha hızlı satın alma oranları her iki saniyede elde edildi ayrıca 6 mümkündür. Staurosporine uygulamadan sonra Uzun vadeli görüntüleme satın almalar arasında uzun bir zaman aralığı (30s) (Şekil 1 D ve E) ile satın alınmıştır. </li></ol> 3. Görüntü İşleme ve Analizi <ol><li> Deney tamamlandıktan sonra elde edilen görüntüler çevrimdışı analiz edilebilir. Kalsiyum düzeyleri değişiklikleri izlemek istediğiniz ilgi alanları (ROI) tanımlayın. Alanında boş bir alan içinde gerekirse arka plan çıkarmak için seçilen bir yatırım getirisi kullanın. Mitokondri oldukça hareketli ve dinamik olduğunu kaydetti ve uzun süre boyunca tek bir mitokondride tahminde olaylar her zaman mümkün değildir olmalıdır. Böylece, bazı hücre tipleri bu organel yüksek motilite dikkate alınarak, ROI seçimi dikkatle izlenmelidir olmalıdır. Ayrıca, Şekil 1, çeşitli uyaranlara heterojen mitokondri yanıt kanıtlandığı gibi. Verileri çevrimdışı analiz etmek ve bir kare-kare bazında yerleştirme RO1 izlemek için bu nedenle önemlidir. Son derece hareketli mitokondri mitokondriyal kalsiyum ölçüm ayrıntılı bir açıklaması başka bir yerde 7 tarif edilmiştir. </li><li> ROI Elde Edilen oranı ölçümleri, Excel ya da benzer graphingsoftware ithal edilebilir. Veriler tek bir hücre ya da tek mitokondri mitokondriyal kalsiyum düzeyleri değişiklikleri temsil eden bir eser olarak sunulan veya fl ortalama olabilirbirkaç ROI uorescence sinyalleri. Ayrıca, Fas ligand 8 apopitozu geçiren lenfositlerin bir nüfusa ortalama mitokondriyal kalsiyum seviyelerini ölçmek için bu tekniği kullandım . </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/2579/2579fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. (A) oranlı metrik-pericam mt hücre içi lokalizasyonu. Bu ilk görüntü oranlı metrik-pericam-mt ifade canlı HeLa hücre gösterir. Ikinci görüntü mitokondri seçici boya MitoTracker Kırmızı CMXRos floresan boyama gösterir. (B) Birleştirilen görüntüyü sarı floresan oranlı metrik-pericam-mt ve MitoTracker floresan co-lokalizasyon göstermektedir. Pseudocolor oranı (495:380 nm), 10 mM ATP ile tedavi mt-oranlı metrik pericam ifade 4 HeLa hücrelerinin görüntüleri bir dizi (C) ilgi bölgesi (ROI) mitokondriyal kalsiyum düzeylerindeki değişikliklerin Niceleme Pseudocolor oranı (495:380 nm) mt ifade eden bir HeLa hücre görüntüleri (B) (D) 10 mM ATP ile tedavi edilir. Serisi belirtilen oranlı metrik pericam 0.5 mcM staurosporine ile tedavi edildi. Bireysel mitokondride kalsiyum yanıt olarak heterojenite belirgin yanı sıra 60 dakika mitokondri önemli parçalanma. Diğerleri kalsiyum seviyesi önemli değişiklikler (sarı ok başı) görünmüyor, ancak bazı mitokondri, kalsiyum (beyaz ok başı) salınım artışlar var. Apoptozis indüksiyonu sonra tek bir HeLa hücre küresel mitokondriyal kalsiyum düzeyleri artar (E) Niceleme 0.5 mcM staurosporine.

<ol><li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).</li>
<li>Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+signalling+and+cell+death%3A+approaches+for+assessing+the+role+of+mitochondrial+Ca2%2B+uptake+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium signalling and cell death: approaches for assessing the role of mitochondrial Ca2+ uptake in apoptosis.</a> Cell Calcium. 40, 553-560 (2006).</li>
<li>Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circularly+permuted+green+fluorescent+proteins+engineered+to+sense+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3197-3202 (2001).</li>
<li>Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+changes+of+mitochondrial+Ca2%2B+revealed+by+specifically+targeted+recombinant+aequorin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin.</a> Nature. 358, 325-327 (1992).</li>
<li>Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+indicators+for+Ca2%2B+based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388, 882-887 (1997).</li>
<li>Shimozono, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+imaging+of+subcellular+Ca2%2B+concentrations+using+a+dual-excitation+ratiometric+indicator+based+on+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">Confocal imaging of subcellular Ca2+ concentrations using a dual-excitation ratiometric indicator based on green fluorescent protein.</a> Sci STKE. , pl4-pl4 (2002).</li>
<li>Wozniak, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+biphasic+calcium+release+from+the+endoplasmic+reticulum+for+Fas-mediated+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Requirement of biphasic calcium release from the endoplasmic reticulum for Fas-mediated apoptosis.</a> J Cell Biol. 175, 709-714 (2006).</li>
<li>Boehning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c+binds+to+inositol+%281%2C4%2C5%29+trisphosphate+receptors%2C+amplifying+calcium-dependent+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c binds to inositol (1,4,5) trisphosphate receptors, amplifying calcium-dependent apoptosis.</a> Nat Cell Biol. 5, 1051-1061 (2003).</li>
<li>Csordas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+interorganelle+contacts+and+local+calcium+dynamics+at+the+ER-mitochondrial+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface.</a> Mol Cell. 39, 121-132 (2010).</li>
<li>Matsuyama, S., Llopis, J., Deveraux, Q. L., Tsien, R. Y., Reed, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+intramitochondrial+and+cytosolic+pH%3A+early+events+that+modulate+caspase+activation+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Changes in intramitochondrial and cytosolic pH: early events that modulate caspase activation during apoptosis.</a> Nat Cell Biol. 2, 318-325 (2000).</li>
<li>Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screen+identifies+Letm1+as+a+mitochondrial+Ca2%2B%2FH%2B+antiporter%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter.</a> Science. 326, 144-147 (2009).</li>
</ol>

Burada mitokondriyal hedefli oranlı metrik pericam kullanarak mitokondriyal kalsiyum ölçmek için çok basit bir yöntem mevcut. Olarak kabul edilebilir sinyal-gürültü oranı ile kolayca HeLa hücreleri bireysel mitokondri görmek mümkündür, hiçbir deconvolution standart widefield optiği kullanarak, Şekil 1A gösterilmiştir. Bu zaman yapışık konfokal mikroskopi veya diğer özel ekipman için gerek kalmayabilir HeLa hücrelerinde, kültür hücreleri gibi, önemli ölçüde düzleştirmek çünkü. Biz poli-lizin kaplı lamelleri 8 yapıştırılır Jurkat hücrelerinde benzer sonuçlar bulduk. Boyalar kullanarak metodolojileri aksine, non-invaziv oranlı metrik pericam (Şekil 1E) gibi genetik olarak kodlanmış olan kalsiyum göstergeleri kullanarak saat mitokondriyal kalsiyum düzeylerinin izlenmesi de mümkündür. Hücre ölümü sırasında mitokondriyal kalsiyum analiz ederken bu özellikle önemlidir. Ayrıca, apoptotik süreci sırasında fisyon / mitokondri parçalanması görselleştirmek için de mümkündür. Şekil 1D ve E görüldüğü gibi, staurosporine tedavi, 20 dakika mitokondri hangi doruklarına seçin alt popülasyonlar kalsiyum yavaş bir artışa neden olur. Kalsiyum düzeyleri tedavi 2 saat sonra tekrar gitmeden önce tekrar mitokondriyal parçalanma ile eş zamanlı aşağı gidin. Bu Fura-2 9 kullanarak ölçülen staurosporine tedavi ile indüklenen sitozolik kalsiyum yavaş dalgaları ile tutarlıdır. Böylece, önemli kinetik bilgiler statik ölçümler istihdam yöntemleri ile mümkün değildir elde edilebilir. Oranları ve kalsiyum konsantrasyonları Şekil 1&#39;de sunulan olmasına rağmen, mutlak kalsiyum düzeyleri 4, 10 hesaplamak için in situ sensörü kalibre etmek mümkündür. Dikkate alınması gereken önemli bir ihtar oranlı metrik pericam pH 4, 10 duyarlı olmasıdır . Hem sitozolik ve mitokondriyal pH seviyeleri apoptozis 11 sırasında dramatik bir biçimde değiştirebilir, bu önemli bir husustur. Izole mitokondri ifade pericam pH Titrasyon göstermek artan [H +] 410 nm eksitasyon, aynı anda hem mitokondriyal kalsiyum ölçmek için kullanılabilir bir özellik tarafından uyarılmış emisyon üzerinde çok az etkisi ile artar, 495 nm&#39;de heyecan pericam emisyon ve pH 12. Böylece, seçici 410 nm eksitasyon emisyon izleme için daha az endişe ile pH olmayan ratiometrically monitör mitokondriyal kalsiyum için bir araç sağlar. Son olarak, burada sunulan protokol, böylece bu tekniği en laboratuarlara erişilebilir hale yaygın kullanılan filtreler ile standart bir epifluorescent mikroskop erişim gerektirir.

<table><tbody><tr><td>Evirilmiş geniş alan floresan kalsiyum görüntüleme mikroskobu</td><td>Nikon Instruments</td><td>MEA53310</td><td>380 nm/495 nm eksitasyon filtreleri ile uygun longpass ve emisyon filtreleri ile donatılmış herhangi bir geniş alan evirilmiş mikroskop, bu protokolü kullanmak üzere kolayca uyarlanabilir.</td></tr><tr><td>Görüntüleme Yazılımı</td><td>Molecular Devices</td><td>Metafluor</td><td></td></tr><tr><td>Attofluor hücre haznesi</td><td>Invitrogen</td><td>A-7816</td><td>Evirilmiş bir mikroskop için perfüzyona izin veren herhangi bir görüntüleme haznesi yeterli olacaktır.</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Bu çalışmalar için çoğu transfeksiyon reaktifi/protokolü uygun olacaktır</td></tr><tr><td>MitoTracker Red CMXRos</td><td>Invitrogen</td><td>M7512</td><td></td></tr></tbody></table>

apoptozis sırasında mitokondrial kalsiyum düzeyleri dinamik değişiklikler izlenmesi genetiği kodlanmış kalsiyum sensor kullanımı

Monitoring Dynamic Changes In Mitochondrial Calcium Levels During Apoptosis Using A Genetically Encoded Calcium Sensor

Çeşitli uyaranlara yanıt olarak hücre içi kalsiyum konsantrasyonu Dinamik değişiklikler, proliferasyon, diferansiyasyon ve apoptosis 1 gibi birçok hücresel süreçleri düzenler. Mitokondri, kalsiyum birikimi apoptozis sırasında serbest pro-apoptotik faktörlerin sitoplazmada 2 içine mitokondri teşvik etmektedir. Bu nedenle, doğrudan canlı hücrelerde apoptozis sırasında in situ mitokondriyal kalsiyum ölçmek için ilgi . Yüksek çözünürlüklü floresan görüntüleme çift uyarma oranlı metrik ve oranlı metrik olmayan sentetik kalsiyum gösterge boya ile yüklü hücreler, hücre içi kalsiyum sinyal çeşitli yönlerini incelemek için güvenilir ve çok yönlü bir araç olduğu kanıtlanmıştır. Sitozolik kalsiyum akıları ölçerek, bu teknikleri kullanarak oldukça basittir. Ancak, rhod-2 ve rhod-FF gibi sentetik kalsiyum göstergeleri kullanarak sağlam hücreler intramitochondrial kalsiyum seviyelerini ölçmek daha zor. Mitokondri hedeflenen Sentetik göstergeleri mitokondriyal kalsiyum tekrarlayan artar yanıtları köreldiğini ve mitokondriyal morfolojisi 3 bozabilir. Ayrıca, sentetik göstergeler, uzun vadeli denemeler için uygunsuz hale getiren birkaç saat içinde mitokondri sızıntısı eğilimindedir. Böylece, mitokondriye hedefleyen yeşil floresan protein (GFP) 4 veya aequorin 5 dayalı genetik olarak kodlanmış olan kalsiyum göstergeleri, mitokondriyal kalsiyum dinamikleri ölçümü önemli ölçüde kolaylaştırmıştır. Burada, farklı uyaranlara tepki olarak mitokondriyal kalsiyum akıları gerçek zamanlı ölçümü için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Seçici mitokondri hedeflenen &#39;oranlı metrik pericam&#39; floresan mikroskopi yöntemi dayanıyor. Oranlı metrik pericam dairesel karılmış sarı floresan protein ve kalmodulin 4 bir füzyon dayalı bir kalsiyum göstergesi. Oranlı metrik pericam kalsiyum bağlayıcı emisyon spektrumu, yaklaşık 515 nm zirveleri, değişmeden kalırken, 415 nm ile 494 nm eksitasyon zirve kaymasına neden olur. Oranlı metrik pericam ~ 1.7 mcM 4 in vitro sabit bir disosiasyon tek bir kalsiyum iyonu bağlar. Oranlı metrik pericam Bu özellikler, mitokondriyal kalsiyum konsantrasyonu hızlı ve uzun vadeli değişimler miktarının izin verir. Ayrıca, bu metodoloji, yaygın olarak kullanılan filtre setleri ile standart bir geniş alan kalsiyum görüntüleme mikroskop adaptasyonu açıklar. Iki ayrı agonistleri purinerjik agonist ATP ve apoptozis indükleyici ilaç staurosporine kullanarak, saat saniye zamansal çözünürlüğe sahip mitokondriyal kalsiyum konsantrasyonu değişiklikleri izlemek için bu yöntem uygun olduğunu göstermektedir. Ayrıca, biz de oranlı metrik pericam apoptozis sırasında mitokondrial fizyon / parçalanma ölçmek için de yararlı olduğunu göstermektedir. Böylece, özellikle de oranlı metrik pericam apoptozis sırasında mitokondriyal kalsiyum dinamikleri sürekli uzun vadeli ölçümü için uygundur.

Bu protokol, mitokondriyal kalsiyum akıları floresan görüntüleme ile gerçek zamanlı ölçümü için bir yöntem açıklanır. Yöntemi seçici mitokondri ifade dairesel permutated bir çift uyarma YFP tabanlı oranlı metrik kalsiyum sensör (oranlı metrik pericam-mt) yararlanır.

Apoptozis sırasında Mitokondrial Kalsiyum Düzeyleri Dinamik değişiklikler izlenmesi Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensor Kullanımı

Çeşitli uyarılara yanıt olarak hücre içi kalsiyum konsantrasyonunda meydana gelen dinamik değişimler; proliferasyon gibi birçok hücresel süreci düzenler, ...

Bu prosedürün genel amacı, canlı hücrelerdeki mitokondriyal kalsiyum konsantrasyonundaki değişimleri izlemektir. Bu işlem, öncelikle hücrelerin mitokondriyal matrikse hedeflenen rasyometrik kalsiyum indikatör proteini peram ile transfekte edilmesi ve ardından transfeksiyondan bir veya iki gün sonra işlem yapılmasıyla gerçekleştirilir. Floresan mikroskobu ve yazılımı, canlı hücre görüntüleme için hazırlanır.Kalsiyum mobilize eden bir agonist eklendikten sonra, rasyometrik peram eksprese eden hücrelerin görüntüleri elde edilir. Prosedürün son adımı, elde edilen görüntülerin kantitatif analizidir. Nihayetinde, rasyometrik bir kalsiyum indikatör proteini eksprese eden canlı hücrelerin floresan mikroskopisi aracılığıyla, mitokondriyal kalsiyum konsantrasyonundaki dinamik değişimleri gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu tekniğin, sentetik kalsiyum indikatörleri kullanılarak kalsiyum seviyelerinin ölçülmesi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, ratiometrik peram'ın genetik olarak kodlanmış olması ve bu sayede mitokondriye veya ilgilenilen diğer herhangi bir organele yönlendirilebilmesidir. Merhaba, ben Dr. Benning'in laboratuvarında doktora sonrası araştırmacı Dr. Ascar; bugün prosedürü uygulamalı olarak göstereceğim. Protokole başlamak için, bir gece önceden HeLa hücrelerini, ertesi günkü transfeksiyon sırasında yaklaşık %70 konfluen olacak bir yoğunlukta, standart altı kuyucuklu bir kültür plağına yerleştirilmiş steril cam lameller üzerine ekiniz. Ertesi gün, transfekte edilecek her bir kuyucuk için 4 µg ratiometrik peram mitokondriyal ekspresyon vektörü ve 0,5 mL Opti-MEM içinde seyreltilmiş 10 µL Lipofectamine 2000 kullanılarak, üreticinin talimatlarına uygun olarak DNA-Lipofectamine 2000 komplekslerini hazırlayın.Ardından, her kuyuktaki D-M-E-M-F-B-S HELOC kültür ortamını 1,5 mililitre antibiyotiksiz aynı ortam ile değiştirin. Kompleksler oluştuktan sonra LIPECTOMY solüsyonunu DNA solüsyonuna ekleyin ve nazikçe karıştırın. DNA Lipectomy solüsyonunu, plak hafifçe sallanarak karıştırılıp transfekte edilecek her kuyuca damla damla ekleyin ve inkübasyonu takiben 37 °C'de, %5 karbondioksit içeren bir hücre kültürü inkübatöründe dört saat boyunca inkübe edin.Besiyerini, antibiyotik içeren D-M-E-M-F-B-S ile değiştirin. Görüntüleme yapmadan önce hücrelerin bir ila iki gün boyunca metric peram ekspres etmesine izin verin. HELOC hücreleri içeren lamelini, bir penset yardımıyla görüntüleme solüsyonu bulunan uygun bir görüntüleme haznesine nazikçe yerleştirin.Görüntüleme haznesini ters bir mikroskop tablasına yerleştirin. Ardından, 40 x veya daha yüksek büyütmeli bir yağ daldırma objektif ve 380 nanometre dalga boyu kullanın. Rasyometrik peram eksprese eden bir veya daha fazla hücre içeren bir ilgi alanı bulmak için, hücrelerin rasyometrik olduğunu tanımlamak amacıyla burada 380 nanometre kullanılır.Peram bu dalga boyunda fotobleşinge karşı daha az dirençlidir. İlgi alanı belirlendikten sonra, yazılımı 495 ve 380 nanometrede çift eksitasyon yapacak şekilde ayarlayın. Ardından, sırasıyla 495 ve 380 nanometrede dönüşümlü olarak eksitasyon yaparak görüntüleri elde edin.Agonist uygulamasından önce, en az 30 saniye boyunca bazal kalsiyum seviyelerinin görüntülerini edinin. Ardından, kalsiyum mobilize edici agonisti bir perfüzyon aparatı aracılığıyla uygulayın ve her bir agonist maruziyet süresi için ekleme zamanını not edin; fotobeyazlamayı önlerken yeterli zamansal çözünürlüğe izin verecek şekilde edinim aralıkları optimize edilmelidir. Deney tamamlandığında, görüntüler çevrimdışı olarak analiz edilebilir.Analize başlamak için, gerekirse arka plan floresansını çıkarmak amacıyla görüntü alanındaki boş bir bölgeden bir ilgi alanı seçin. Ardından, ilgi alanından elde edilen 4 95 3 80 oran ölçümlerini Excel'e veya benzeri bir grafik yazılımına aktarın. Bu görüntü paneli, oranlı peram ve mitokondriyaların hücre altı lokalizasyonunu göstermektedir.Solda, ratiometrik PerCAM eksprese eden HeLa hücrelerinin canlı hücre görüntüsü yer almaktadır. Ortada, mitokondriyaların floresan boyaması ve seçici boya MitoTracker Red CMXRos bulunmaktadır. Ve son olarak sağda, burada gösterilen birleştirilmiş görüntü, mitokondrilerinde ratiometrik PerCAM eksprese eden ve 10 µM ATP ilele işlem görmüş dört HeLa hücresinin 495 ve 380 nm rasyo görüntülerinden oluşan bir pseudorenk serisidir; bu dört hücrenin mitokondriyal kalsiyum seviyelerindeki değişimlerin kantifikasyonu ise, mitokondrilerinde ratiometrik PerCAM eksprese eden bir HeLa hücresinin bu görüntüsünde gösterilmiştir.0.5 µM storsporin uygulamasının 60. dakikasında, tekil mitokondrilerdeki kalsiyum yanıtının heterojenliği ve mitokondrilerin belirgin fragmantasyonu görülmektedir. Beyaz okla gösterilen bazı mitokondrilerde kalsiyumda salınımlı artışlar görülürken, sarı okla gösterilen diğerlerinde kalsiyum seviyesinde belirgin bir değişim görülmemektedir. Bu grafik, 0.5 µM storsporin ile 120 dakika boyunca apoptoz indüksiyonu sonrası tek bir HeLa hücresindeki global mitokondriyal kalsiyum seviyelerindeki değişimi ortaya koymaktadır.Bu videoyu izledikten sonra, seçici olarak mitokondriyal matrikse hedeflenen kalsiyum mediyasyonlu protein R geometrik peram kullanarak, çeşitli uyaranlara yanıt olarak mitokondriyal kalsiyum seviyelerindeki dinamik değişimlerin nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

monitoring-dynamic-changes-mitochondrial-calcium-levels-during

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kaspaz 3 aracılı apopitoz ölümsüzleştirdi N19 oligodendrosit hücre kültürleri Canlı hücre görüntüleme...

İzleme bölünmüş Kaspaz-3 Aktivite ve Potasyum kaynaklı Membran depolarizasyon Canlı hücre Görüntüleme ve Cleaveable EPA-boya Substratlar ölümsüzleştirdi oligodendroglial Hücre Apoptoz

Bu videoda, kültürlenmiş hücrelerde mitokondriyal kalsiyum alımını ölçmek için konfokal mikroskopi görüntülemeye dayalı bir test açıklanmaktadır. Test, geçirgenleştirilmiş kültürlenmiş hücrelerdeki mitokondriyal kalsiyumu ölçmek için kalsiyuma duyarlı floresan boya Rhod-2 /'yi kullanır.

Kültürlenmiş Hücrelerde Mitokondriyal Kalsiyum Alımını Ölçmek için Kalsiyum Akışı Testi

Örnekler arasındaki mitokondriyal membran potansiyelinin karşılaştırılması, hücresel durum hakkında değerli bilgiler verir. Mitokondriyi izole etmek ve floresan kullanarak inhibitörlere ve ayrıştırıcılara yanıtı değerlendirmek için ayrıntılı adımlar açıklanmaktadır. Bu protokolün yöntemi ve faydası, bir hücre kültürü ve hücresel stresin hayvan modeli kullanılarak gösterilmiştir.

İzolasyon ve Kültür Hücrelerinin ve Fare Doku gelen Mitokondri Fonksiyonel Analizi

Endoplazmik retikulum kalsiyum homeostazı çeşitli patolojilerde bozulur.  ER kalsiyum deposundaki bozulmaları tespit etmek için salgılanan bir ER kalsiyum izleme proteini (SERCaMP) raportörü kullanılabilir.   Bu protokol, ER kalsiyum homeostazını in vitro ve in vivo olarak incelemek için bir Gaussia lusiferaz SERCaMP'nin kullanımını açıklar.

Bir kullanılması Endoplazmik retikulum kalsiyum dengesi İzleme<em&gt; Gaussia</em&gt; Lusiferaz SERCaMP

Mitokondri onları sitozolik Ca şekillendirmek için 2+ hücre içinde sinyal sağlayan (2+ Ca) kalsiyum tecrit kendi iç zarı (Δ Ψm) arasında elektrokimyasal potansiyeli kullanabilir. Floresan boyalar ve konfokal mikroskopi kullanılarak canlı hücreler eş zamanlı olarak ölçüm mitokondri Ca 2 + alımı ve ΔΨ m için bir yöntem tarif eder.

Floresan Mikroskopi Canlı hücreler Potansiyel Mitokondriyal Kalsiyum ve Mitokondriyal Membran Eşzamanlı Ölçümü

Ca2 + saklama kapasitesi ve Ca2 +incelemek için bir yöntemi açıklamak için bu protokolü amaçlamaktadır - mitokondrial SH-SY5Y izole mitokondri şişme adım adım hücreleri tetikledi.

Mitokondrial Ca2 + saklama kapasitesi tahlil ve Ca2 +-mitokondrial şişme tahlil tetiklenen

Burada mitokondri zar potansiyel (MMP) belirlemek ve CLIC4 nakavt kaynaklı HN4 hücre apoptosis içinde vitroçalışma rodamine 123 uygulanması için detaylı bir iletişim kuralı mevcut. Ortak floresan mikroskop altında ve confocal lazer tarama floresan mikroskop MMP gerçek zamanlı değişiklik kaydedildi.

Mitokondri zar potansiyeli CLIC4 nakavt kaynaklı HN4 hücre Apoptosis Vitro çalışma tespiti

Burada, iki protokol mitokondrial Ca2 + akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri ölçümü için mevcut. İzole mitokondri için biz bir plaka okuyucu tabanlı Ca2 + alma detaylı tahlil Ca2 + hassas kullanarak boya kalsiyum yeşil-5N. Kültürlü hücreler için Ca2 + boya Rhod-2/AM kullanarak bir confocal mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır.

Mitokondrial kalsiyum akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri analizleri

Bu proktokol, astrositlerde ve nöronlarda in vitro ve in vivo mitokondriyal Ca2+ görüntüleme için bir yöntem sağlamayı amaçlamaktadır.

Genetik Olarak Kodlanmış Ca2+ Göstergeleri (GECI'ler) Kullanarak Astrositlerde ve Nöronlarda Mitokondriyal Ca2+ Alımı Görüntüleme

Bu protokol, virüsle enfekte insan bağırsak organoidlerinde kalsiyum görüntüleme yapmak için bir yaklaşımı açıklar ve analize bir yaklaşım sunar.

Genetik Olarak Kodlanmış Kalsiyum İndikatörleri Kullanılarak Virüsle Enfekte İnsan Bağırsak Organoid Tek Tabakalarının Canlı Kalsiyum Görüntülemesi

Öğrenin canlı hücrelerde mitokondriyal kalsiyum dinamiklerini ratiometric pericam-mt ile gerçek zamanlı izleme yöntemini. Bu teknik, hücresel metabolizma ve sinyal yolakları hakkında önemli bilgiler sağlar.

Apoptozis sırasında Mitokondrial Kalsiyum Düzeyleri Dinamik değişiklikler izlenmesi Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensor Kullanımı (Video) | JoVE Journal

Apoptozis sırasında Mitokondrial Kalsiyum Düzeyleri Dinamik değişiklikler izlenmesi Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensor Kullanımı

Daha fazla video keşfet