Apoptozis sırasında Mitokondrial Kalsiyum Düzeyleri Dinamik değişiklikler izlenmesi Genetiği Kodlanmış Kalsiyum Sensor Kullanımı
April 1st, 2011
Bu protokol, mitokondriyal kalsiyum akıları floresan görüntüleme ile gerçek zamanlı ölçümü için bir yöntem açıklanır. Yöntemi seçici mitokondri ifade dairesel permutated bir çift uyarma YFP tabanlı oranlı metrik kalsiyum sensör (oranlı metrik pericam-mt) yararlanır.
Bu prosedürün genel amacı, canlı hücrelerdeki mitokondriyal kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikleri izlemektir. Bu, transfeksiyondan bir veya iki gün sonra mitokondriyal matrisi hedef alan kalsiyum indikatör protein oranı metrik peram ile hücrelerin ilk kez kesilmesiyle gerçekleştirilir. Floresan mikroskobu ve yazılımı, canlı hücre görüntüleme için ayarlanmıştır.
Oran metrik peram eksprese eden hücrelerin görüntüleri daha sonra bir kalsiyum mobilize edici agonistin eklenmesiyle elde edilir. Prosedürün son adımı, elde edilen görüntülerin nicel analizidir. Sonuç olarak, bir oran metrik kalsiyum indikatör proteini eksprese eden canlı hücrelerin floresan mikroskobu yoluyla mitokondriyal kalsiyum konsantrasyonunda dinamik değişiklikler gösteren sonuçlar elde edilebilir.
Bu tekniğin, sentetik kalsiyum indikatörleri kullanılarak kalsiyum seviyelerinin ölçülmesi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, metrik peram oranının genetik olarak kodlanması ve bu nedenle mitokondri veya diğer herhangi bir organı hedef alabilmesidir. Merhaba, ben Dr.Ascar, Dr.Benning'in laboratuvarında doktora sonrası araştırmacıyım ve bugün prosedürü göstereceğim Protokol plakası helo hücrelerine bir gece önce başlamak için, ertesi gün transfeksiyon için yaklaşık% 70 akıcı olacak bir yoğunlukta standart altı kuyulu kültür plakasına yerleştirilmiş steril cam örtü fişleri üzerinde transfeksiyon. Ertesi gün, üreticinin talimatlarına göre dört mikrogram metrik peram mitokondriyal ekspresyon vektörü ve transfekte edilecek her bir kuyucuk için optimum 0.5 mililitre seyreltilmiş 10 mikrolitre lipektomi 2000 kompleksi hazırlayın.
Daha sonra, her bir oyuktaki D-M-E-M-F-B-S HELOC kültür ortamını antibiyotiksiz aynı ortamdan 1,5 mililitre ile değiştirin. LIPECTOMY solüsyonunu DNA solüsyonuna ekleyin ve kompleksler oluştuktan sonra hafifçe karıştırın. DNA Lipektomi solüsyonunu, plakayı hafifçe sallayarak karıştırılacak her bir oyuğa damla damla ekleyin ve inkübasyonu takiben 37 santigrat derecede,% 5 karbondioksit olan bir hücre kültürü inkübatöründe dört saat inkübe edin.
Ortamı antibiyotik içeren D-M-E-M-F-B-S ile değiştirin. Forseps kullanarak görüntülemeden önce hücrelerin bir ila iki gün boyunca metrik peram ifade etmesine izin verin. HELOC hücrelerini içeren bir lameti görüntüleme solüsyonu ile uygun bir görüntüleme odasına nazikçe yerleştirin.
Görüntüleme odasını ters çevrilmiş bir mikroskop aşamasına monte edin. Ardından, 40 x veya daha yüksek bir yağa daldırma hedefi ve 380 nanometre dalga boyu kullanın. Oran metriğini ifade eden bir veya daha fazla hücre içeren bir ilgi alanını bulmak için, hücreleri oran metriği olarak tanımlamak için burada 380 nanometre kullanılır.
Peram bu dalga boyunda foto ağartmaya karşı daha az dirençlidir. Bir ilgi alanı belirlendikten sonra, yazılımı 495 ve 380 nanometrede çift uyarma için ayarlayın. Ardından, alternatif olarak 495 ve 380 nanometrede heyecan verici görüntüler elde edin.
Agonist uygulanmadan önce en az 30 saniye boyunca temel kalsiyum seviyelerinin görüntülerini elde edin. Daha sonra, kalsiyum mobilize edici agonisti bir füzyon aparatı aracılığıyla uygulayın, her bir agonist için ekleme süresine, maruz kalma sürelerine ve edinme aralıklarına, yeterli zamansal çözünürlüğe izin verirken foto ağartmayı önlemek için optimize edilmelidir. Deney tamamlandıktan sonra, görüntüler çevrimdışı olarak analiz edilebilir.
Analize başlamak için, gerekirse arka plan floresansını çıkarmak için alanın boş bir alanı içinde bir ilgi alanı seçin. Ardından, 4 95 3 80 oran ölçümlerini ilgilenilen bölgeden Excel'e veya benzer bir grafik yazılımına aktarın. Bu görüntü paneli, oran metrik peram ve mitokondrinin hücre altı lokalizasyonunu göstermektedir.
Solda, oran metrik peramını ifade eden helo hücrelerinin canlı bir hücre görüntüsü var. Ortada mitokondrinin floresan boyaması ve seçici boya MIT izleyici kırmızı CMX Ross var. Ve son olarak sağda, burada gösterilen birleştirilmiş görüntü, 10 mikromolar A TP ile muamele edilen mitokondride metrik peram oranını ifade eden dört helo hücresinin bir dizi sahte renkli 4 95, 3 80 nanometre oranlı görüntüsüdür ve önceki dört hücrenin mitokondriyal kalsiyum seviyelerindeki değişikliklerin nicelleştirilmesi, mitokondrideki bir hela hücresi ifade eden oran metrik peramının bu görüntüsünde gösterilmiştir.
Bireysel mitokondrideki kalsiyum yanıtının heterojenliği ve mitokondrinin önemli parçalanması, 60 dakikalık 0.5 mikromolar stor sporin tedavisi ile belirgindir. Bazı mitokondriler, beyaz okla gösterilen kalsiyumda salınım artışlarına sahipken, diğerleri sarı okla gösterilen kalsiyum seviyesinde önemli değişiklikler göstermez. Bu grafik, 0.5 mikromolar stor sporin ile 120 dakika boyunca apoptoz indüksiyonundan sonra tek bir helo hücresinde küresel mitokondriyal kalsiyum seviyelerindeki değişimi ortaya koymaktadır.
Bu videoyu izledikten sonra, seçici olarak mitokondriyal matrisi hedef alan kalsiyum ilaçlı protein R geometrik peram kullanılarak çeşitli tli'ye yanıt olarak mitokondriyal kalsiyum seviyelerindeki dinamik değişikliklerin nasıl ölçüleceğini iyi anlamalısınız.
Genel Bakış
Bu protokol, genetik olarak kodlanan bir kalsiyum göstergeci olan ratiometrik pericam-mt kullanarak mitokondriyal kalsiyum akışlarının gerçek zamanlı ölçümü için bir yöntem tanımlar. Bu teknik, canlı hücrelerde kalsiyum seviyelerinin dinamik olarak izlenmesine olanak tanır ve mitokondriyal fonksiyon hakkında bilgiler sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Floresan Görüntüleme
Arka Plan
- Mitokondriyal kalsiyum seviyeleri hücresel metabolizma ve sinyalleşme için kritik öneme sahiptir.
- Kalsiyum seviyelerini ölçmek için geleneksel yöntemler genellikle sentetik göstergelere dayanır.
- Genetik olarak kodlanan göstergeler özgüllük ve hedefleme konusunda avantajlar sunar.
- Bu çalışma, mitokondriyal kalsiyum dinamiklerinin gelişmiş görüntülemesinden yararlanmak için ratiometrik pericam-mt kullanır.
Çalışmanın Amacı
- Canlı hücrelerde mitokondriyal kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikleri izlemek.
- Mitokondriyal hedeflemeli genetik olarak kodlanan bir kalsiyum göstergecisinin kullanımını göstermek.
- Mitokondriyal kalsiyum akışlarını görüntülemek ve analiz etmek için detaylı bir protokol sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Ratiometrik pericam-mt ile hücrelerin transfeksiyonu.
- Floresan mikroskopi kullanarak canlı hücre görüntüleme.
- Kalsiyum ölçümü için çift dalga boyunda sıralı uyarım.
- Kalsiyum dinamiklerini değerlendirmek için floresan görüntülerin nicel analizi.
Ana Sonuçlar
- Mitokondriyal kalsiyum seviyelerindeki dinamik değişiklikler başarıyla ölçüldü.
- Bireysel mitokondri arasında kalsiyum yanıtlarında heterojenlik gözlendi.
- Belirli işlemler altında mitokondri fragmantasyonunun önemli olduğu belirlendi.
- Sonuçlar, gerçek zamanlı görüntüleme için ratiometrik pericam-mt'nin etkinliğini gösterdi.
Sonuçlar
- Protokol, mitokondriyal kalsiyum dinamiklerini incelemek için güvenilir bir yöntem sunar.
- Ratiometrik pericam-mt gibi genetik olarak kodlanan göstergeler görüntüleme yeteneklerini artırır.
- Bu teknik, mitokondriyal fonksiyonu araştırmak için çeşitli deneysel koşullara uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Monitoring mitochondrial calcium dynamics provides critical mechanistic insights into apoptosis pathways, enabling target validation in cell death mechanisms. This genetically encoded sensor approach supports predictive confidence in preclinical models by quantifying organelle-specific calcium fluxes with temporal resolution. The method facilitates early de-risking of therapeutic hypotheses involving mitochondrial dysfunction in disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of mitochondrial calcium as a regulator of apoptotic pathways for target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides organelle-specific readouts that reduce ambiguity in mechanistic studies of cell death.
- Predictive Value: Supports functional validation of targets involved in calcium-mediated apoptosis through real-time flux measurements.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative ratiometric data enabling dose-response analysis of compounds affecting mitochondrial calcium.
- Operational Value: Compatible with standard wide-field microscopy, allowing integration into existing imaging platforms without specialized equipment.
- Scalability Value: Enables longitudinal tracking of calcium dynamics and mitochondrial morphology in live cells over hours.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links mitochondrial calcium changes to apoptotic outcomes, supporting biomarker relevance in disease models.
- Operational Value: Demonstrates utility with both ATP (physiological agonist) and staurosporine (apoptosis inducer), broadening applicability across experimental conditions.
- Translational Continuity: Facilitates progression from mechanism discovery to preclinical validation by providing dynamic, physiologically relevant readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through mechanistic de-risking to preclinical assessment by providing dynamic, quantifiable data on mitochondrial function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of calcium-dependent apoptotic pathways through real-time mitochondrial flux measurements.
- Screening: Enables assay-ready systems with standardized, reproducible calcium readouts for compound screening campaigns.
- Analytics: Delivers quantitative ratiometric outputs (495nm/380nm excitation ratio) that allow statistical comparison of calcium dynamics across conditions.
- Translational Research: Connects mitochondrial calcium changes to apoptotic phenotypes, supporting continuity from mechanism to phenotypic outcome.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging capability for studying mitochondrial dysfunction across multiple disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in apoptosis pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility through genetically encoded, organelle-targeted indicators that avoid dye leakage and artifacts.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, quantitative insights into mitochondrial mechanisms of compound action.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on mitochondrial calcium modulation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology for transfection and live-cell imaging.
- Dependent on fluorescence microscopy with dual-excitation capability (380nm and 495nm) and standard filter sets.
- Necessitates standardization of image acquisition protocols and region-of-interest analysis across teams.
- Adaptation considerations include mitochondrial targeting efficiency and potential overexpression artifacts in different cell models.
- Practical limitations include photobleaching risks during long-term imaging and need for optimization of agonist exposure intervals.
