ELISA yöntemi ile yerli bozulmamış nükleozom Post-translasyonel modifikasyonlar Algılama

Bu prosedürün genel amacı, bir milyon hücreden elde edilen toplam hücresel nükleozomların preparatları içindeki translasyon sonrası modifikasyonların nispi seviyelerini doğru bir şekilde belirlemektir. Bu, önce memeli hücrelerinin yüksek kaliteli homojen kültürlerinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra çekirdekler, bir downs, homojenizatör ve santrifüjleme ile mekanik parçalanma yoluyla hücrelerden izole edilir.

Bir sonraki adım, çekirdeklerde bulunan kromatini sindirerek ve bir dizi hipotonik ekstraksiyon gerçekleştirerek sağlam nükleozomlar elde etmektir. Son olarak, nükleozomlar, belirli translasyon sonrası modifikasyonları tanımlamak için uygun kontrollere sahip bir ELIZA testi kullanılarak sorgulanır. Sonuç olarak, nükleozom örneklerinde bulunan spesifik modifikasyonların nispi seviyelerini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin western blotlama ve kromatin immünopresipitasyon gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, bir dizi nükleozom modifikasyon durumunun küresel bir resminin kolayca belirlenebilmesidir. Yöntem, western blotting'den çok daha hassas ve doğrudur ve genel moleküler biyoloji deneyleri için donatılmış çoğu laboratuvarda gerçekleştirilebilir. Bu yöntem, kök hücre ve epigenetik alanında, büyük farklılaşma ve yeniden programlama olayları meydana geldiğinde ne olacağı gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Prosedüre başlamak için, önce tripler, hücreleri 15 santimetre plaka başına üç mililitre tripsin ile anize eder ve taze inize edilmiş hücreleri okside eder. 20 mililitre buz gibi soğuk PBS bütirat ekleyin. Hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve hücreleri beş dakika boyunca 1000 RPM'de toplamak için tüpü santrifüjleyin, süpernatanı aspire edin ve hücre süspansiyonunu beş dakika boyunca 1000 RPM'de tekrar santrifüjlemek için 10 mililitre buz gibi soğuk PBS bütirat ekleyin.

Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini yazılı protokolde açıklandığı gibi proteaz inhibitörleri ile dört mililitre lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücreleri 20 vuruşla homojenize etmek için buz üzerinde A tipi B havaneli homojenizatöre pipetleyin. Daha sonra homojenatı buz üzerindeki bir santrifüj tüpüne aktarın.

Numuneyi 2000 G'de 10 dakika santrifüjleyin. Dört santigrat derecede. Sitoplazmik materyali ve resüsü içeren süper adlandırılmış olanı çıkarın.

Peleti iki mililitre buz gibi soğuk yıkama tamponu C'de askıya alın Proteaz inhibitörleriyle, yeniden süspanse edilmiş malzemeyi soğuk bir santrifüj tüpünde beş mililitre, %30'luk bir sükroz yastığının üzerine nazikçe katmanlayın. Çekirdek santrifüjünü sallanan bir kovada beş dakika boyunca 2.400 G'de izole etmek için, rotor çekirdekleri yastıktan geçecek ve hücresel kalıntılar arayüzde kalacaktır. Santrifüjlemeden sonra, tüm sıvı hacmini dikkatlice çıkarın ve çekirdekleri proteaz inhibitörleri ile 250 mikrolitre buz soğuk yıkama tamponu C'de yeniden süspanse edin, çekirdekleri 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Nükleozomların izolasyonuna başlamak için, çekirdeğe üç mikrolitre 0.1 molar kalsiyum klorür ekleyin ve sıcaklık dengelenene kadar 37 santigrat derecelik bir ısı bloğuna yerleştirin. Daha sonra 10 mikrolitre mikro kokal nükleaz içine iki birim mikro kokal nükleaz ekleyin, tamponlayın ve 37 santigrat derecede 12 dakika inkübe edin. Bir pipet ucuyla sık sık karıştırın.

İnkübasyondan sonra, altı mikrolitre 0.5 molar sodyum E-D-T-A-P-H sekiz ile reaksiyonu durdurun ve soğuması için buzun üzerine koyun. Daha sonra, santrifüjlemeyi takiben numuneyi dört dakika boyunca 2000 G'de santrifüjleyin, snat'ı atın ve peleti yeniden süspanse edin. 300 mikrolitre 0,2 milimol veya sodyum EDTA'da, numuneyi ara sıra karıştırmak için hafif pipetleme ile bir saat buz üzerinde inkübe edin.

Dört dakika boyunca 3000 G'de bir santrifüjlemenin ardından. Dört santigrat derecede, serbest nükleozomları içeren süpernatanı yeni bir Fuge tüpünde toplayın ve kasıtlı olarak ek nükleozomlar reus buz üzerinde saklayın. Peletleri daha önce olduğu gibi 300 mikrolitre 0.2 milimol veya sodyum EDT içinde askıya alın ve ara sıra hafifçe karıştırarak bir saat buz üzerinde inkübe edin.

İnkübasyondan sonra numuneyi santrifüjleyin. Yine, elde edilen snat'ı buz üzerindeki mikro füj tüpünde kalan numune ile birleştirin. Nükleozom Eliza tahliline başlamak için, üst kuyuda 50 mikrolitre başına 0.1 mikrogramdan başlayarak, azalan beş adet iki katlı seri nükleozom seyreltmesi ve kaplama tamponu ile 96 kuyulu bir Eliza plakası yükleyin, tüm seyreltme serileri üç nüsha halinde yüklenmelidir.

Kaplama tamponlu kuyuları yalnızca kontrol olarak dahil etmeyi unutmayın. Ertesi gün plakayı gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Plakaları oyuk başına 200 mikrolitre ile PBS'de 20 arasında oda sıcaklığında toplam 10 dakika boyunca dört kez yıkamak için bir plaka yıkayıcı kullanın.

Şimdi blokaj çözeltisi kuyucuğu başına 100 mikrolitre ekleyin ve bir döndürücü üzerinde oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, ters çevrilmiş plakayı bir lavabonun üzerinde hızlı bir şekilde sallayarak engelleme tamponunu çıkarın. Daha sonra, seyreltilmiş primer antikoru, PBS'de 20 arasında% 0.05'lik bir çözelti içinde% 5'lik bir PSA çözeltisi içinde, oyuk başına 50 mikrolitrelik bir hacimde ekleyin, çözeltiyi oda sıcaklığında bir döndürücü üzerinde bir saat inkübe edin.

Birincil antikor inkübasyonundan sonra, plakaları plaka yıkayıcıyı kullanmadan önce olduğu gibi yıkayın. Yıkama prosedürü tamamlandıktan sonra, ikincil antikor inkübasyonunu takiben bir döndürücü üzerinde bir saat boyunca bir saat boyunca inkübe edilen oda sıcaklığında% 5 BS, A ve% 0.5 ile PBS içinde seyreltilmiş yaban turpu peroksidaz konjuge ikincil antikorunun kuyusu başına 50 mikrolitre ekleyin. Plakaları daha önce olduğu gibi yıkayın.

Plakayı geliştirmek için plaka yıkayıcıyı kullanma. Her oyuğa 50 mikrolitre TMB Eliza substratı ekleyin ve 10 dakika inkübe edin. Oda sıcaklığında, ELIZA plakasının kuyuları maviye dönecek ve yoğunluk, her birinde bulunan nükleozom modifikasyonlarının miktarı ile orantılıdır.

O zaman reaksiyonu durdur. İki normal sülfürik asit kuyusu başına 50 mikrolitre ekleyerek. Renk kahverengiye dönecek, hava kabarcıklarını dağıtmak için plakayı 1500 RPM'de iki dakika santrifüjleyecektir.

Plaka artık bir renkli metrik plaka okuyucusunda miktar tayini için hazırdır. Son olarak, plakayı 450 nanometrede okuyun ve sonuçları analiz için dışa aktarın. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik geliştirildikten sonra düzgün bir şekilde uygulanırsa iki gün içinde yapılabilir.

Bu teknik, kök hücre araştırmaları alanındaki araştırmacıların, tüm epi proteom düzeyinde farklılaşma ve yeniden programlama olaylarına epigenetik tepkileri keşfetmeleri için kapıyı açtı.