Name: ELISA yöntemi ile yerli bozulmamış nükleozom Post-translasyonel modifikasyonlar Algılama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Öğrenin, NU-ELISA yöntemiyle nükleozom post-translasyonel modifikasyonlarını tespit etmeyi. Bu hassas teknik, epigenetik ve kök hücre araştırmalarında kromatin durumlarını değerlendirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

NU-ELISA yöntemi geliştirilmesi, Ulusal Sağlık Enstitüsü, hibe RO1AG023687 tarafından desteklenen oldu.

1. Memeli Hücresi Kültürü NU-ELISA kültürde yetişen herhangi bir memeli hücre tipi yapılabilir. Biz, böylece birkaç farklı antikorları (Abs) deneyleri izin nükleozom aynı yüklü birkaç ELISA plakaları hazırlamak için yeterli miktarda izole edilebilir, böylece hücrelerin büyük gruplar orta hazırlamak için tercih ediyor. Aşağıdaki kültürü ölçekleri yeterli malzeme sağlar: Fare embyronic kök hücreler, hücre bir ya da iki adet 15 cm tabak besleyici hücreler olmadan büyür. Fibroblastlar için 5 ila 10 15 cm tabak, izdiham büyür. 2. Çekirdeklerin izolasyonu Not: olarak belirtilen hariç tüm adımları önceden soğutulmuş tamponlar ile buz üzerinde. <ol><li> Hücreleri Trypsinize, plaka başına 3 ml tripsin ile birleşir ve buz gibi soğuk PBS / butirat 20 ml ekleyin. 1000 rpm'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> 10 ml PBS / butirat hücrelerinin yeniden süspanse edin ve 5 dakika boyunca 1000 rpm'de santrifüj. </li><li> Proteaz inhibitörleri (Sigma-Aldrich P-8340) ile 4 ml lizis tamponu yeniden süspanse edin. B tipi havaneli ile buz üzerinde 20 vuruş homojenize Dounce. </li><li> 4 10 dakika 2000g santrifüjleyin ° C (Süpernatant sitoplazma içerir, bu protokol için gerekli değildir, ancak istenirse, diğer kullanımlar için kaydedilebilir). </li><li> 2 ml buz yıkama tamponu C pelet (proteaz inhibitörleri ile) tekrar </li><li> Katman 5 ml% 30 sukroz minder üzerinde yeniden süspanse malzeme, daha sonra 5 dakika sallanan bir kova rotor 2400g santrifüjlenir. Çekirdekler, yastık yoluyla göç, ve enkaz arayüzü kalır. </li><li> Dikkatle çıkarın ve tüm sıvı hacmi 250 ul buz soğuk yıkama tamponu C + proteaz inhibitörleri çekirdekleri tekrar süspansiyon. </li></ol> 3. Yerinde Micrococcal Nükleazlar (MNase) Sindirim tarafından nükleozom izolasyonu Biz kromatin süpernatantı ücretsiz bozulmamış nükleozom sürücü hipotonik bir tedavi takip MNase ile onları beslerken çekirdeklerin içinde in situ sindirilir bir yordamı kullanın. <ol><li> 3 ul 0.1 M CaCl 2 örnek ekleyin. 37 ° C ısıya blok koyun. 37 ° C sıcaklık varsaymak izin verin. </li><li> 2 adet MNase (2 units/10μl MNase tampon içinde çözünmüş Micrococcal Nükleazlar, Sigma-Aldrich), daha sonra 37 inkübe ° C 12 dakika, bir pipetlemeyin ucunu kullanarak sık karıştırma. </li><li> Reaksiyonu durdurmak için 0.5 M Na-EDTA, pH 8.0 ul 6 ekleyin. Buz koyun. </li><li> Süpernatant atmak için 2000g, 4 dakika santrifüjleyin. 300 ul 0.2 mM Na-EDTA pelletini tekrar. 1 saat buz üzerinde zaman zaman nazik pipeting saklayın. (Bu hipotonik koşulları çekirdekleri ücretsiz nükleozom kurtarmak). </li><li> 4 dakika süreyle 3000 g santrifüjleyin 4 ° C Buz üzerinde, ücretsiz nükleozom içeren süpernatant kaydedin. </li><li> 300 ul 0.2 mM Na-EDTA ile tekrar pelletini tekrar. 1 saat buz üzerinde zaman zaman nazik pipeting saklayın. </li><li> 4 4min için 3000g santrifüjleyin ° C Süpernatantı saklayın ve 5. adımdan itibaren ilk süpernatant ile birleşir. -80 ° C'ye çıkan mononucleosome hazırlıkları aliquoted ve saklanabilir </li></ol> Not: kromatin miktarı kabaca 10 ul örnek 260 nm'de absorbans ölçümü ile quantitated 990 ul su eklenir. A 260 = 10 (1 / 100 dilüsyon için ayarladıktan sonra) kromatin 1mg/ml karşılık gelir. Ayrıca kendi DNA içeriği, ağırlıklı olarak uzunluğu 146 bp DNA içermelidir MNase sindirimler kalite ve ölçüde izlemek için, yukarıdaki prosedürü sırasında, küçük örnekler muhafaza edilmesi ve daha sonra analiz. Laddering eksik MNase sindirim göstergesidir. Not: Şekil 1 nükleer izolasyon ve MNase sindirimler adımları diyagramlanabilmiştir özetini içerir. 4. Nucleosome-ELISA (NU ELISA) Biz 96 ELISA microtiter plakalar üzerinde immobilize edilmiştir yerli bozulmamış nuclesosomes içeren kesirler PTMS algılar. Her bir örnek için, 2 kat dilüsyonlarının bir dizi yapmak ve bu üç nüsha olarak kuyu üzerine kaplanmıştır. <ol><li> 4 ° C 50 ul / kuyu kaplama tampon içinde seyreltilmiş nükleozom. Gecede Coat MaxiSorp plakalar Nükleozom Önerilen seri iki yönlü dilüsyonları sadece alt kaplama tampon (0 mg kromatin), 0.1 mg, 0.05 mg, 0.025 mikrogram, 0.0125 mg, 0.00625 mg, mcg 0,00313 0,00156 mg ekleyerek üst satırdan alt satıra hazırlanan satır. (Not: Bu adım için plakası örtüleri ihtiyaç vardır.) </li><li> Sabah, bir tabak yıkama ile toplam 10 dakika oda sıcaklığında (RT) 200 ul / iyi PBS/0.5% Tween-20 ile plakalar 4 kez yıkayın. </li><li> Blok 1 saat RT 100 ul / Tween-20 /% 5% PBS/0.05 BSA. </li><li> Briskly ters plaka sallayarak engelleme tamponu çıkarınlavabonun üzerinde. Kapak ve -20 ° C'de plakaları mağaza, ya da doğrudan bir sonraki adıma gidin. </li><li> 1 ° Abs PBS/0.05% rotator 1 saat oda sıcaklığında inkübe Tween-20 /% 5 BSA, 50 / ml iyi seyreltilmiş 1:1000 bir ses (ya da gerektiği gibi) ekleyin. </li><li> RT 200 ul / iyi PBS/0.5% Tween-20 ve toplam 10 dakika için bir tabak yıkama plakalar 4 kez yıkayın. </li><li> At turp peroksidaz (HRP) konjuge 2 ° Abs PBS/0.05% rotator bir saat için RT Tween-20 /% 5 BSA (ya da gerektiği gibi) 1:5000 sulandırılmış ekleyin. </li><li> 200 ul / PBS/0.5% Tween-20 ile plakalar 4 kez yıkayın. Her yıkama bir tabak yıkayıcı RT ve 10 dakika olmak üzere toplam. </li><li> RT 10 dakika için her bir kuyunun 50 ul TMB substrat ekleyerek plakalar geliştirin. 50 ul / kuyu 4 SO H 2 2N, ekleyerek reaksiyon durdurun ve plakaları 450 nm okuyun. (İpucu: absorbans okuma önce kuyularda herhangi bir hava kabarcığı dağıtmak için bir tabak rotor kullanarak 2 dakika süreyle 1500 rpm'de Santrifüj). </li><li> Nicel ve istatistiksel analizler için tablo dosyaları okuma ihracat. </li></ol> Reaktifler <table border="1"><tbody><tr><td> PBS / butirat </td></tr><tr><td> 135 mM NaCl </td></tr><tr><td> 2.5 mM KCl </td></tr><tr><td> 8 mM Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> 1.5 mM KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 10 mM Na-butirat </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Lizis Tampon </td></tr><tr><td> 250 mM sakkaroz </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl, pH 7.4 </td></tr><tr><td> 10 mM Na-butirat </td></tr><tr><td> 4 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> % 0.1 Triton X-100 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> C yıkama tamponu </td></tr><tr><td> 250 mM sakkaroz </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl, pH 7.4 </td></tr><tr><td> 10 mM Na-butirat </td></tr><tr><td> 4 mM MgCl 2 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Sakkaroz Yastık </td></tr><tr><td> % 30 (w / v) yıkama tamponu C sakaroz </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Microccocal Nükleazlar Tampon </td></tr><tr><td> 5 mM Napo 4 Tampon, pH 7.0 </td></tr><tr><td> 0.025 mM CaCl 2 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Kaplama tampon </td></tr><tr><td> Çözüm A + 80ml 170ml Çözüm B + 250ml dH 2 O </td></tr><tr><td> Çözüm: 0.2 M Na 2 CO 3 </td></tr><tr><td> Çözelti B: 0.2 M NaHCO 3 </td></tr></tbody></table> 5. Temsilcisi Sonuçlar NU-ELISA yöntemi, kromatin mononucleosomes şeklinde hazırlanmış olan yüklenebilir hazırlanan birkaç aynı plakaları bir dizi kullanma. Biz genellikle, her biri farklı anti-PTM özel antikorlar (Abs) probed böylece aynı yüklü levhalar bir dizi hazırlıyoruz. Biz de her zaman değişiklik devlet toplam kromatin yükleme kontrolü dikkate alınmaksızın histon algılar Ab probed bir tabak hazırlayın. Bu kontrol, daha sonra kantitatif farklı örneklerinden hazırlanan nükleozom PTM içerik karşılaştırmak için şarttır. , Biz bu yaklaşımı kullanarak ham absorbans değerleri düzeltmenize, belirli bir kromatin örneklem içinde PTMS düzeylerini ölçmek için: Öncelikle, biz hiçbir kromatin (arka plan genellikle ihmal edilebilir) içeren kontrol kuyulardan elde edilen değerler kullanılarak herhangi bir arka plan sinyali çıkarın. Daha sonra Ab değişiklik devletin bağımsız nükleozom algılar bir test aynı yüklü plaka elde NU-ELISA sonuçlarına PTM özel sinyaller standartlaştırmak. (Bunun için histon H2A veya H2B için spesifik poliklonal Abs kullandık). Daha sonra, kromatin her seyreltme ve sapmaların belirlemek ve ELISA testinin doğrusal kısmını elde edilen verileri kullanabilir. NU-ELISA matematiksel ve istatistiksel analizler ayrıntılı örnekler, daha önce 4 bildirilmiştir <img src="/files/ftp_upload/2593/2593fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. NU-ELISA adımları şematik diagam. A. Memeli Hücreleri hasat; B. Çekirdekler Dounce saat hücreleri ayrılıromogenization, C. hücreler santrifüj sonra% 30 w / v sakaroz yastık, D. üst yüklenen bozulur, çekirdeklerin pelet yatırılır, E, F. Kromatin MNase tarafından ağırlıklı olarak mononucleomes in situ sindirilir, G, H ben Çözünür mononucleosomes hipotonik tedavi ve artık nükleer malzeme tekrarlanan santrifüj tarafından ayıklanır. J. Mononucleosomes farklı örnekleri (etiketli samp Bu durumda 1 ve 2) aynı yüklü levhalar seri mikrotiter kuyuları kaplı ve sorgulandı. toplam kromatin yükleme belirlemek için PTM özel Abs ve PTM bağımsız Abs. K. diferansiyel sinyal algılama düzeyleri, onların PTM içeriği farklı iki örnek tasviri, henüz anti-H2B immünoreaktivite tarafından değerlendirilecek benzer genel kromatin içeriğe sahip .

<ol><li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389, 251-260 (1997).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293, 1074-1080 (2001).</li>
<li>Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation+and+an+epigenetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation and an epigenetic code.</a> Bioessays. 22, 836-845 (2000).</li>
<li>Dai, B., Rasmussen, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epiproteomic+signatures+distinguish+embryonic+stem+cells+from+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Global epiproteomic signatures distinguish embryonic stem cells from differentiated cells.</a> Stem Cells. 25, 2567-2574 (2007).</li>
<li>Tanasijevic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+accumulation+of+epigen+etic+heterogeneity+during+human+ES+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Progressive accumulation of epigen etic heterogeneity during human ES cell culture.</a> Epigenetics. 4, 330-338 (2009).</li>
<li>Thomas, J. O. Isolation and fractionation of chromatin and linker histones. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThomas%2C+JO+%22Chromatin%3A+a+practical+approach%22">Chromatin: a practical approach</a>. Gould, H. , Oxford University Press. Oxford. 12-14 (1998).</li>
<li>Thorne, A. W., Cary, P. D., Crane-Robinson, C. Extraction and separation of core histones and non-histone chromosomal proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThorne%2C+AW+%22Chromatin%3A+a+practical+approach%22">Chromatin: a practical approach</a>. Gould, H. , Oxford University Press. Oxford. 38-39 (1998).</li>
</ol>

NU-ELISA belirli bir hücre tipi içinde nucleosome PTMS küresel durumunu tespit etmek için bir yöntem sağlar. NU-ELISA çalışmaları küresel nucleosome değişiklik durumları birbirinden farklı hücre tipleri 4 karşılaştırmalar farklı olduğunu göstermiştir. Buna ek olarak, hücreler gibi epigenetik düzenleyici ajanlara maruz kaldığında NU-ELISA PTM profilleri değiştirmek trichostatin-A veya fare embyronic kök hücreler 4 farklılaşmış. Bu yöntem aynı zamanda insan ES hücrelerinin 5 kromatin çalışmada başarıyla uygulanmaktadır . NU-ELISA, bugünkü şekliyle, sadece hücresel Epigenom toplamı içinde PTMS kompozit imza algılayabilir dikkat etmek önemlidir. Bu, belirli genetik lokusların genelinde belirli bir PTM dağılımını belirlemek genom kromatin immunoprecipitation, belirgin farklıdır. NU-ELISA prosedürleri ilk adımları memeli çekirdekleri 6,7 mononucleosomes izole etmek için daha önceki yöntemlerden uyarlanmıştır . Bu uyarlanmış yöntemler, memeli hücreleri yüksek kaliteli sağlam mononucleosomes elde etmek için bir çare bir yol sağlar ve ortaya çıkan kesirler kromatin içeriği kapsamlı, ancak büyük bir ek nükleer malzeme içerir. Özel Abs kullanılan olduğundan, olmayan nucleosomal malzeme kirlenmesine neden olan, daha büyük bir saflık gerektiren kitle-spec yaklaşımların aksine, NU-ELISA testinin iyi tolere edilir. Ancak, NU-ELISA batı western ve nucleosomal PTMS tespiti için kitle spec iyi alternatifler sunan, böylece 4 blot daha duyarlı ve kantitatif.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar </th></tr><tr><td> Micrococcal Nucleae </td><td> Sigma </td><td> N3755 </td><td> -20 ° C&#39;de saklanan 2 U/10μl tampon hacimde yapın </td></tr><tr><td> Nunc MaxiSorp microtiter Tabaklar </td><td> Balıkçı </td><td> 12-565-135 </td><td> Yapıştırıcı plakası örtüleri de Fisher üzerinden sipariş edilebilir </td></tr><tr><td> Otomatik Plaka Yıkama </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1-Adım TMB-ELISA substrat </td><td> Delmek </td><td> 34028 </td><td> Mağaza, 4 ° C Kullanmadan önce RT öncesi sıcak ya da kâğıt üzerindeki teknik özellikler </td></tr><tr><td> Microtiter Levha Reader </td><td> Bio-Rad mikroplaka okuyucu (model: 680) </td><td></td><td> En kolorimetrik plaka okuyucu modelleri uygundur. </td></tr></tbody></table>

elisa yöntemi ile yerli bozulmamış nükleozom post-translasyonel modifikasyonlar algılama

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

Ökaryotlar genomu DNA ve proteinler içeren kromatin olarak var. Kromatin temel birimi, iki histon H2A, H2B, H3, H4 1 ile ilişkili DNA 146 baz çifti içeren nucleosome . Histon, N-terminal kuyruklarını lisin ve arjinin zengin ve post-transkripsiyonel asetilasyon, metilasyon ve diğer post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS) tarafından modifiye edilmiştir. Nükleozom PTM yapılandırma dolayısıyla doğa 2,3 epigenetik gen regülasyonu bir mod, ilişkili DNA transkripsiyonel aktivitesini etkileyebilir. Biz nucleosome ELISA (NU-ELISA) hücrelerden çıkarılan nükleozom küresel PTM imzaları belirlemek için kantitatif olarak adlandırılan bir yöntem geliştirdi. NU-ELISA blot batı daha duyarlı ve kantitatif ve özel hücre tipleri epiproteomic durumunu sorgulamak için yararlıdır. Bu video dergi makalesi, NU-ELISA analizi gerçekleştirmek için ayrıntılı yordamlar gösterir.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA), post-translasyonel modifikasyonlar, doğal, bozulmamış nükleozom hazırlıkları küresel kalıplarını tespit etmek için hassas ve kantitatif bir yöntemdir. Bu değişiklikler özel histon amino asit artıkları metilasyonla, asetilasyon, fosforilasyon, ve dolayısıyla NU-ELISA belirli hücre tiplerinin genel kromatin modifikasyon devletlerin küresel bir proteomik tahlil sağlar.

ELISA yöntemi ile yerli bozulmamış nükleozom Post-translasyonel modifikasyonlar Algılama

Ökaryotların genomu, hem DNA hem de proteinler içeren kromatin yapısında bulunur. Kromatinin temel birimi, 146 ... içeren nükleozomdur.

Bu prosedürün genel amacı, bir milyon hücreden elde edilen toplam hücresel nükleozom preparasyonlarındaki post-translasyonel modifikasyonların göreceli seviyelerini doğru bir şekilde belirlemektir. Bu işlem, öncelikle yüksek kaliteli homojen memeli hücresi kültürleri hazırlanarak gerçekleştirilir. Ardından, bir Dounce homogenizatörü ile mekanik parçalama ve santrifüjasyon yoluyla hücrelerden çekirdekler izole edilir.Bir sonraki adım, çekirdeklerde bulunan kromatini sindirerek ve bir dizi hipotonik ekstraksiyon gerçekleştirerek sağlam nükleozomlar elde etmektir. Son olarak, spesifik translasyon sonrası modifikasyonları belirlemek için uygun kontrollerle birlikte bir ELISA testi kullanılarak nükleozomlar analiz edilir. Nihayetinde, nükleozom örneklerinde bulunan spesifik modifikasyonların göreceli seviyelerini gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu tekniğin western blotting ve kromatin immünopresipitasyonu gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, birçok nükleozom modifikasyon durumunun genel bir tablosunun kolayca belirlenebilmesidir. Yöntem, western blotting'den çok daha hassas ve doğrudur ve genel moleküler biyoloji deneyleri için donanımlı çoğu laboratuvarda uygulanabilir. Bu yöntem, temel diferansiyasyon ve yeniden programlama olayları meydana geldiğinde neler olduğu gibi, kök hücre ve epigenetik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Prosedüre başlamak için, önce hücreleri her 15 cm'lik plak için üç mililitre tripsin kullanarak taze tripsinize edin. 20 mililitre buz gibi soğuk PBS bütirat ekleyin. Hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve hücreleri toplamak için tübü 1000 RPM'de beş dakika boyunca santrifüjleyin, süpernatantı aspire edin ve yıkama için 10 mililitre buz gibi soğuk PBS bütirat ekleyip hücre süspansiyonunu tekrar 1000 RPM'de beş dakika santrifüjleyin.Süpernatantı uzaklaştırın ve hücre peletini, yazılı protokolde açıklandığı gibi proteaz inhibitörleri içeren dört mililitre lizis tamponu içinde yeniden süspanse edin. Ardından, hücreleri buz üzerinde B tipi havanlı bir homojenizatöre pipetleyin ve 20 darbe ile homojenize edin. Daha sonra homojenatı buz üzerinde bir santrifüj tüpüne aktarın.Numuneyi 2000 G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Dört santigrat derecede. Sitoplazmik materyali içeren süpernatantı uzaklaştırın ve resüspansiyon yapın.Pelleti, proteaz inhibitörleri içeren iki mililitre buz gibi soğuk yıkama tamponu C içinde süspande edin; resüspande edilen materyali, soğuk bir santrifüj tüpündeki beş mililitre %30 sükroz yastığının üzerine nazikçe katmanlandırın. Çekirdekleri izole etmek için, salıncak kovalı bir rotorda 2.400 G'de beş dakika santrifüjleyin; çekirdekler yastık boyunca göç edecek ve hücresel debris ara yüzeyde kalacaktır. Santrifüjden sonra, tüm sıvı hacmini dikkatlice uzaklaştırın ve çekirdekleri proteaz inhibitörleri içeren 250 mikrolitre buz gibi soğuk yıkama tamponu C içinde yeniden süspande ederek çekirdekleri 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.Nükleozomların izolasyonuna başlamak için, çekirdeklere üç µL 0.1 molar kalsiyum klorür ekleyin ve sıcaklık dengelenene kadar 37 °C'lik bir ısı bloğuna yerleştirin. Ardından, 10 µL mikrokokal nükleaz tamponu içindeki iki ünite mikrokokal nükleaz ekleyin ve 37 °C'de 12 dakika boyunca inkübe edin. Bir pipet ucuyla sık sık karıştırın.İnkübasyon sonrası, reaksiyonu altı mikrolitre 0.5 molar sodyum EDTA-pH 8 ile durdurun ve soğuması için buza yerleştirin. Ardından, örneği 2000 G'de dört dakika boyunca santrifüjleyin; santrifüj işleminin ardından üst fazı atın ve peleti resüspande edin. Örneği 300 mikrolitre 0.2 milimolar sodyum EDTA içinde, karıştırmak için ara ara nazikçe pipetleyerek bir saat boyunca buz üzerinde inkübe edin.4 °C'de dört dakika boyunca 3000 G'de santrifüjlemeden sonra, serbest nükleozomları içeren süpernatantı yeni bir santrifüj tüpüne toplayın ve ek nükleozom yeniden kullanımı için buz üzerinde saklayın. Peleti, daha önce olduğu gibi 300 µL 0.2 mM sodyum EDT içinde süspanse edin ve ara ara nazikçe karıştırarak bir saat boyunca buz üzerinde inkübe edin.İnkübasyonun ardından örneği santrifüj edin. Oluşan süpernatantı, buz üzerindeki mikro santrifüj tüpünde kalan örnekle tekrar birleştirin. Nükleozom ELISA testi için, en üst kuyucukta 50 µL başına 0,1 µg ile başlayan, nükleozomlar ve kaplama tamponu ile hazırlanmış beşli, iki katlı seri dilüsyon dizisini 96 kuyucuklu bir ELISA plakasına yükleyin; tüm dilüsyon serileri üç paralel (triplicate) şeklinde yüklenmelidir.Kontrol olarak sadece kaplama tamponu içeren kuyucuklar eklemeyi unutmayın. Plakayı dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin. Oda sıcaklığında, kuyucuk başına 200 microliters %0,5 PBS ile plakaları toplam 10 dakika sürecek şekilde dört kez yıkamak için bir plaka yıkayıcı kullanın.Şimdi her kuyucuğa 100 µL bloklama çözeltisi ekleyin ve bir rotatör üzerinde oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. İnkübasyon sonrası, plakayı ters çevirip lavabo üzerinde sertçe sallayarak bloklama tamponunu uzaklaştırın. Ardından, her kuyucuğa 50 µL hacminde, %0,05 Tween 20 içeren PBS içinde %5 PSA çözeltisinde seyreltilmiş primer antikoru ekleyin ve çözeltiyi bir rotatör üzerinde oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.Birincil antikor inkübasyonunun ardından, plakaları daha önce olduğu gibi plaka yıkayıcıyı kullanarak yıkayın. Yıkama işlemi tamamlandığında, her kuyucuğa %5 BS, A ve %0,5 20 içeren PBS içinde seyreltilmiş 50 µL horseradish peroksidaz konjuge ikincil antikor ekleyin ve bir rotator üzerinde oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. İkincil antikor inkübasyonunu takiben plakaları daha önce olduğu gibi yıkayın.Plakayı geliştirmek için plaka yıkayıcı kullanın. Her kuyucuğa 50 µL TMB Eliza substratı ekleyin ve 10 dakika boyunca inkübe edin. Oda sıcaklığında, ELIZA plağındaki kuyucuklar maviye dönecek ve renk yoğunluğu, her birindeki nükleozom modifikasyonlarının miktarı ile orantılı olacaktır.Ardından, kuyuk başına 50 µL iki normal sülfürik asit ekleyerek reaksiyonu durdurun. Renk kahverengiye dönecektir; hava kabarcıklarını gidermek için plakayı 1500 RPM'de iki dakika boyunca santrifüjleyin.Plaka artık bir kolorimetrik plaka okuyucu ile nicelleştirme için hazırdır. Son olarak, plakayı 450 nanometrede okuyun ve analiz için sonuçları dışa aktarın. Bu teknik uzmanlaşıldığında ve geliştirildikten sonra uygun şekilde yürütülürse iki günde tamamlanabilir.Bu teknik, kök hücre araştırmaları alanındaki araştırmacıların, diferansiyasyon ve yeniden programlama olaylarına verilen epigenetik yanıtları tüm epi proteom düzeyinde incelemelerinin önünü açmıştır.

detection-post-translational-modifications-on-native-intact

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Ubikitinasyon üç enzimlerin kümesi tarafından yürütülen bir anahtar posttranslasyonel modifikasyonu. Bu değişiklik ilgili genler Mutasyonlar birçok farklı insan hastalıkları ile ilişkilidir. Burada, kültür hücrelerinde protein ubikuitinasyon tespit protokolleri...

Protein Ubikitinasyon Tespiti

Yerli birleştirerek ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile kromatin imunopresipitasyon çapraz bağlanmasıyla, ChroP yaklaşım histon modifikasyonları, çeşitleri ve fonksiyonel olarak farklı kromatin etki de synergizing olmayan histonic proteinlerin kompozit proteomik mimarisini incelemek için olanak sağlar.

ChroP Yaklaşım Kromatin Odağı özgü Proteomic Manzaralar teşrih Chip ve Kütle Spektrometre birleştirir

Burada, ATP'ye bağımlı nükleozom kaymasını katalize etme, 2) nükleozom substratlarıyla etkileşime girme ve 3) ATP'yi nükleozom veya DNA'ya bağımlı bir şekilde hidrolize etme yetenekleri için ATP'ye bağımlı kromatin yeniden modelleme enzimlerini karakterize etmek için kullanılabilecek biyokimyasal tahlilleri açıklıyoruz.

ATP-bağımlı Kromatin Tadilat Enzimler Faaliyetlerinin Analizi için biyokimyasal Tahliller

Bu protokol, kütle spektrometrisi (MS) ile histon post-translasyonel modifikasyonları karakterize etmek için tamamen entegre bir iş akışı özetlenmektedir. iş akışı nano-akış sıvı kromatografi ve veri analizi için talimatları kullanarak hücre kültürlerinde veya dokular, histon türetilmesi ve sindirim, MS analizi gelen histon arınma içerir. 3 gün - protokol 2 içinde tamamlanması için tasarlanmıştır.

Histon Ekstraksiyon Gönderen Data Analizi: Aşağıdan yukarıya Kütle Spektrometre kullanarak histon post-translasyonel modifikasyonlar Analizi için komple iş akışı

Bu protokol farklı şekilde izotop işaretli kardeş histon içeren nükleozom sulandırılması açıklar. Aynı zamanda, asimetrik translasyon sonrası modifiye edilmiş nükleozom bir premodified histon kopya kullandıktan sonra oluşturulabilir. Bu preparatlar kolaylıkla yüksek çözünürlüklü NMR spektroskopisi kullanarak, her iki kız kardeş histonlar üzerinde eş zamanlı olarak, değişiklik çapraz-karışma mekanizmaları incelemek için kullanılabilir.

Farklı Olarak izotopla işaretli Kardeş histonlarla nükleozomlann Sulandırma

Biz yalıtmak ve nöral progenitör hücreler embriyonik ve postnatal beyin dokusundan Kromatin immunoprecipitation (ChIP) Histon 3 lizin 79 dimethylation (H3K79me2) - içinde yer alan bir Histon işareti için kültür için etkili ve tekrarlanabilir bir yöntem mevcut Histon 3 küresel etki alanı.

Yalıtım ve sinirsel ataları Kromatin-Immunoprecipitation Histon 3 lizin 79 Dimethylation Mark tarafından takip tarımı

Birden çok araştıran, endojen translasyonel modifikasyonlar hedef protein için son derece zor olabilir. Burada açıklanan teknikleri belirli PTM hedeflemede, benzeşim matrisler bir hedef için asetilasyon, ubiquitination, SUMOylation 2/3 ve tirozin fosforilasyon değişiklikleri algılamak için geliştirilen bir en iyi duruma getirilmiş lizis tampon ve filtre sistemi kullanmak protein tek ve akıcı bir sistem kullanarak.

Bir endojen translasyonel modifikasyon profil hedef proteinler için tanımlamak için bir kapsamlı Immunoprecipitation zenginleştirme sistemi kullanan

Ubiquitination hücresel süreçlerde önemli roller oynar ve sıkıca deubiquitination tarafından koordine edilen bir post-translational modifikasyon olduğunu. Her iki reaksiyon kusurları insan patolojileri altında yatan. Biz arıtılmış bileşenleri kullanarak in vitro mayası ve deubiquitination reaksiyonu yürütmek için protokoller sunuyoruz.

Nükliosomal Histones in vitro Ubiquitination ve Deubiquitination bulguları

Mevcut protokol, topoizomeraz inhibitörleri ve formaldehit tarafından indüklenen ubikitilasyon, SUMOylation ve ADP-ribozilasyon dahil olmak üzere DNA-protein çapraz bağlarını (DPC'ler) ve bunların translasyon sonrası modifikasyonlarını (PTM'ler) tespit etmek ve ölçmek için değiştirilmiş bir yöntemi vurgulamaktadır, böylece DPC'lerin ve PTM'lerinin oluşumu ve onarımının incelenmesine izin verir.

DNA-Protein Çapraz Bağlarının Kantitatif Tespiti ve Translasyon Sonrası Modifikasyonları

Histon modifikasyonlarının yüksek güvenilirlikli ve yüksek oranda tekrarlanabilir "aşağıdan yukarıya" analizi ve temel parametrelere (alıkonma süresi [RT], çarpışma kesiti [CCS] ve doğru kütle-yük [m/z] oranı) dayalı tanımlama için sıvı kromatografisi, sıkışmış iyon hareketlilik spektrometrisi ve uçuş zamanı kütle spektrometrisine (LC-TIMS-ToF MS/MS) dayalı analitik bir iş akışı.

Sıvı Kromatografisi, Sıkışmış İyon Hareketlilik Spektrometrisi ve Uçuş Süresi Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Histon Modifikasyon Taraması

İnsan Spindlin Aile Üyesi 4'te (SPIN4) genetik varyantlar, yeni bir gelişimsel bozukluk olan kemik aşırı büyümesi olan hastalarda yakın zamanda tespit edilmiştir. Nükleozomlar bağlamında modifiye histonların SPIN4 bağlanma substratları olarak biyokimyasal tanımlanmasını tanımlayan bir protokol ve yeni sonuçlar sunulmaktadır.

Değiştirilmiş histonların, peptit dizileri ve doğal nükleozom pulldown ile insan spindlin aile üyesi 4'ün (SPIN4) bağlanma substratları olarak tanımlanması

Öğrenin, NU-ELISA yöntemiyle nükleozom post-translasyonel modifikasyonlarını tespit etmeyi. Bu hassas teknik, epigenetik ve kök hücre araştırmalarında kromatin durumlarını değerlendirmeye yardımcı olur.

ELISA yöntemi ile yerli bozulmamış nükleozom Post-translasyonel modifikasyonlar Algılama

Daha fazla video keşfet