Histon Ekstraksiyon Gönderen Data Analizi: Aşağıdan yukarıya Kütle Spektrometre kullanarak histon post-translasyonel modifikasyonlar Analizi için komple iş akışı

Bu protokolün genel amacı, gen ifadesinin düzenlenmesi ve kromozom kondansasyonu gibi kromatin biyolojisinde temel roller oynayan histon translasyon sonrası modifikasyonlarının göreceli bolluğunu değerlendirmek için basit bir prosedür sağlamaktır. Bu yöntem, kromatin biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, belirli hücrelerin veya dokuların stimülasyonu veya tedavisi üzerine hangi histon modifikasyonlarının göreceli bolluğunun değiştiği gibi.

Bu tekniğin temel avantajı, kütle spektrometrisi tabanlı proteomik kullanarak, tek bir analizde bilinen proteinlerdeki bilinen PTM'lerin çoğunu eş zamanlı olarak nicelendirebilmemizdir. Histon modifikasyon analizi, ilaç tedavisi veya stres sonrası bireylerin veya model sistemlerin epigenetik değişikliklerini ve kromatin işleyişini tahmin etmek dahil olmak üzere çok sayıda uygulama alanına sahiptir. Simone'ye ek olarak, laboratuvarımdan diğer iki üye de bu protokolün prosedürlerini uygulamalı olarak gösterecektir.

Araştırma uzmanı Natarajan Bhanu ve lisansüstü öğrencisi Kelly Karch. Bu iş akışında gösterildiği gibi, bu protokol; hücre kültürlerinden veya dokulardan histon saflaştırmayı, histon türevlendirmeyi, sindirimi ve tuzdan arındırmayı ve nanoflow sıvı kromatografisi kullanılarak yapılan kütle spektrometrisi analizini içeren 10 adımlık bir prosedürdür. Bu videoda yalnızca seçili prosedürler gösterilecektir.

Sağlam hücrelerden çekirdek izole etme prosedürüne başlamak için, daha önce hasat edilmiş ve negatif 80 santigrat derece Celsius'ta saklanmış hücreleri buz üzerinde çözdürün. Ve protokol metninde açıklandığı gibi çekirdek izolasyon tamponunu veya NIB'yi hazırlayın. NIB hacminin beşte birini çıkarın ve nihai konsantrasyonu 0.2% olacak şekilde NP-40 Alternative ekleyin. Kalan beşte dört hacim yıkamalar için kullanılacaktır.

Hücre peletini, hücre peleti hacmi ile tampon hacmi arasında 1:10 oranını kullanarak NP-40 Alternative içermeyen NIB ile yıkayın. 700 RCF'de beş dakika santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın. Hücre peletini buz üzerine yerleştirip, hücre peleti hacmi ile tampon hacmi arasında 1:10 oranında %0,2 NP-40 Alternative içeren NIB ekleyerek lize edin.

Hücreleri nazikçe pipetleyerek homojenize edin. Hücrelerin liz olması ve çekirdeklerin serbest kalması için homojenize edilmiş hücreleri buz üzerinde beş ila 10 dakika inkübe edin. Dört derece Celsius'ta, 1000 RCF'de beş ila 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Çökelek esas olarak hücre çekirdeklerini içerirken, süpernatan esas olarak sitoplazmik bileşenleri içerecektir. İstenirse sitoplazmik fraksiyon saklanabilir. Çökelek hacmine karşı 1:10 tampon hacmi oranını kullanarak, çekirdek çökeleğini NP-40 Alternatifi içermeyen NIB ile nazikçe yeniden süspanse ederek yıkayın.

4 °C'de beş dakika boyunca 1000 RCF'de santrifüjleyin ve süpernatanı uzaklaştırın. NP-40 Alternatifi çekirdek peletinden tamamen uzaklaştırıldıktan sonra, çekirdek hacmi ile sülfürik asit hacmi 1:5 oranında olacak şekilde buz gibi 0,2 molar sülfürik asit ekleyin. Çekirdekleri, nazikçe pipetleyerek sülfürik asit içinde yeniden süspande edin.

Numuneyi sabit rotasyonla veya hafifçe çalkalayarak, dört derece Celsius'te iki ila dört saat boyunca inkübe edin. Ardından, numuneyi dört derece Celsius'te 3400 RCF'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Çözünmeyen maddeleri uzaklaştırmak için işlemi tekrar santrifüjleyip süpernatanı yeni bir tüpe aktarın.

Histonları çöktürmek için, toplanan süpernatanta 1:3 hacim oranında soğutulmuş, %100 trikloroasetik asit veya TCA ekleyin. Numunenin bulanıklaşması, histonların varlığını gösterir. Tüpü birkaç kez tersyüz ederek karıştırın.

Karışımı buz üzerinde en az bir saat inkübe edin. 3400 RCF'de beş dakika santrifüjleyin. Santrifüjleme sonrası histonlar tüpün kenarlarına yapışacak ve aynı zamanda dibe çökecektir.

Tüpün en altında, çoğunlukla histon dışı proteinler ve diğer biyomolekülleri içeren beyaz, çözünmeyen bir pelet de oluşacaktır. Tüpün kenarlarını veya dipteki peleti kazımadan, süpernatanla dikkatlice aspirasyon yaparak uzaklaştırın. Cam bir Pasteur pipeti kullanarak, kenarları ve tabanı kaplayan çökmüş proteinlerin üzerini örtecek şekilde tüpü %100 buz gibi soğuk aseton ve %0,1 hidroklorik asit ile durulayın.

3400 RCF'de iki dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı, kenarları veya peleti kazımadan dikkatlice aspire edin. Tüpü %100 buz gibi soğuk asetonla durulayın, tekrar santrifüjleyin ve kenarları veya peleti kazımadan süpernatanı uzaklaştırın.

Ardından, protokol metninde açıklandığı şekilde histon kantifikasyonu ve saflık analizi gerçekleştirilir. Histon türevlendirmesi öncesinde, isteğe bağlı olarak ters fazlı HPLC ile histon varyantlarının fraksiyonasyonu da yapılabilir. Bu prosedüre, histon örneklerini 40 µL 50 mM amonyum bikarbonatta (pH 8.0) çözerek başlayın.

Aspirasyon yapmadan bir P10 pipet ucunu numuneye daldırarak ve pipet ucunu bir pH indikatör şeridine değdirerek pH değerini kontrol edin. pH değerini 8,0'a ayarlamak için amonyum hidroksit ve formik asit kullanın. Bu aşamadan itibaren, propionik anhidrit kullanımını içeren tüm adımlar bir çeker ocakta gerçekleştirilmelidir.

Propionik anhidritin reaktivitesini korumak için aynı anda en fazla üç ila dört numune işleyin. Propionik anhidriti asetnitril ile 1:3 hacim oranında karıştırarak taze propionilasyon reaktifi hazırlayın. Propionilasyon reaktifini her bir numuneye 1:4 hacim oranında ekleyin.

Çözeltinin pH değerini yeniden 8,0'a getirmek için hızlıca amonyum hidroksit ekleyin. Genellikle, pH 8,0'ı yeniden sağlamak için örneğe 1:5 hacim oranında amonyum hidroksit eklemek uygundur. Vortex kullanarak hemen karıştırın.

pH değerini kontrol edin. Numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. Tüm numunelerin propionilasyonu tamamlandıktan sonra, numuneleri bir vakum konsantratöründe 10 ila 20 microliters hacme kadar kurutun.

Numuneleri, nihai hacim 40 µL olana kadar ddH2O ile yeniden süspande edin veya seyreltin. Tuzlar, sıvı kromatografisini ve kütle spektrometresini engellediği için numuneler analizden önce tuzdan arındırılmalıdır. Bu videoda sadece stage-tip'lerin hazırlanışı gösterilecektir.

Bir katı faz ekstraksiyon diskinden C18 materyali şeklinde bir disk çıkarmak için P1000 pipet ucu kullanın. Mini-diski P1000 ucundan dışarı iterek bir P100 veya P200 pipet ucunun tabanına yerleştirmek için kuvars kılcal boru kullanın. Diskin ucun tabanına sıkıca yerleştiğinden emin olun.

25 µg'dan fazla örnek tuzsuzlaştırma işlemi yapılacaksa, aynı P100 veya P200 uç içerisinde iki adet C18 mini-disk kullanın. Stage-tip'leri 1,5 veya 2 mL'lik mikrosantrifüj tüplerinde sabit tutmak için bir santrifüj adaptörü kullanın. C18 materyali aktive etmek ve potansiyel kontaminanları uzaklaştırmak için reçineyi 50 µL %100 acetonitrile ile yıkayarak temizleyin.

Numune tuzsuzlaştırma işlemi daha sonra protokol metninde açıklandığı şekilde gerçekleştirilir. Histon peptidleri çeşitli izobarik formlarda bulunur. Histon analizlerinde yaygın olarak karşılaşılan iki örnek gösterilmiştir.

Yukarıda gösterilen öncül kütlelerinin ve ilgili izotoplarının çıkarılmış iyon kromatogramları birbirinin aynıdır. Ancak, aşağıda gösterilen ürün iyonlarının çıkarılmış iyon kromatogramı, iki izobarik formun ayırt edilmesine olanak tanır. İki türün göreceli bolluğunu tahmin etmek için yalnızca kırmızıyla vurgulanan özgün fragman iyonlar kullanılmalıdır.

Retinoik asit stimülasyonu uygulanmış ve uygulanmamış insan embriyonik kök hücrelerinden ekstrakte edilen histonlar analiz edildi. İki histon H3 peptidinin bağıl kantifikasyonu, diferansiyasyon için stimüle edilmiş insan embriyonik kök hücrelerinde asetilasyonun belirgin şekilde azaldığını ortaya koydu. Bu durum, diferansiyasyon geçiren hücrelere kıyasla embriyonik kök hücrelerde daha yüksek asetilasyon olduğunu belirten önceki raporlarla tutarlıdır.

Bu teknik bir kez kavrandığında, uygun şekilde uygulandığı takdirde üç günde tamamlanabilir. Birinci gün histon ekstraksiyonu, ikinci gün protein türevlendirme ve sindirimi ve üçüncü gün peptid türevlendirme, stage-tipleme ve LC-MS analizi için ayrılır. Histon saflaştırma, kombinatoryal histon modifikasyonlarının karakterize edilmesinin mümkün olduğu middle-down ve top-down proteomik dahil olmak üzere, peptid analizleri dışındaki diğer amaçlar için de kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, kütle spektrometrisi tabanlı proteomik kullanarak histon post-translasyonel modifikasyonlarının nasıl tanımlanacağı ve nicelendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.