Name: Histon Ekstraksiyon Gönderen Data Analizi: Aşağıdan yukarıya Kütle Spektrometre kullanarak histon post-translasyonel modifikasyonlar Analizi için komple iş akışı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Öğrenin histon post-translasyonel modifikasyonlarını kütle spektrometresi kullanarak analiz etme yöntemini. Bu protokol, kromatin biyolojisi ve epigenetik değişiklikleri incelemek için güvenilir bir iş akışı sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma NIH hibe (DP2OD007447, R01GM110174 ve R01AI118891) fon tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Waddington, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canalization+of+development+and+the+inheritance+of+acquired+characters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Canalization of development and the inheritance of acquired characters.</a> Nature. 150, 563-565 (1942).</li>
<li>Sharma, S., Kelly, T. K., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Epigenetics in cancer.</a> Carcinogenesis. 31 (1), 27-36 (2010).</li>
<li>Reik, W., Dean, W., Walter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+reprogramming+in+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Epigenetic reprogramming in mammalian development.</a> Science. 293 (5532), 1089-1093 (2001).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li>
<li>Tessarz, P., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+core+modifications+regulating+nucleosome+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Histone core modifications regulating nucleosome structure and dynamics.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 703-708 (2014).</li>
<li>Fischle, W., Wang, Y. M., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+and+chromatin+cross-talk%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone and chromatin cross-talk.</a> Curr Opin Cell Biol. 15 (2), 172-183 (2003).</li>
<li>Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+histone+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The language of histone crosstalk.</a> Cell. 142 (5), 682-685 (2010).</li>
<li>Simboeck, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Phosphorylation+Switch+Regulates+the+Transcriptional+Activation+of+Cell+Cycle+Regulator+p21+by+Histone+Deacetylase+Inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A Phosphorylation Switch Regulates the Transcriptional Activation of Cell Cycle Regulator p21 by Histone Deacetylase Inhibitors.</a> J Biol Chem. 285 (52), 41062-41073 (2010).</li>
<li>Hirota, T., Lipp, J. J., Toh, B. H., Peters, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3+serine+10+phosphorylation+by+Aurora+B+causes+HP1+dissociation+from+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone H3 serine 10 phosphorylation by Aurora B causes HP1 dissociation from heterochromatin.</a> Nature. 438 (7071), 1176-1180 (2005).</li>
<li>Xhemalce, B., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromodomain+switch+mediated+by+histone+H3+Lys+4+acetylation+regulates+heterochromatin+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A chromodomain switch mediated by histone H3 Lys 4 acetylation regulates heterochromatin assembly.</a> Genes Dev. 24 (7), 647-652 (2010).</li>
<li>Vermeulen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+interaction+proteomics+and+genome-wide+profiling+of+epigenetic+histone+marks+and+their+readers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers.</a> Cell. 142 (6), 967-980 (2010).</li>
<li>van Attikum, H., Gasser, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+histone+modifications+during+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between histone modifications during the DNA damage response.</a> Trends Cell Biol. 19 (5), 207-217 (2009).</li>
<li>Fernandez-Capetillo, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX+is+required+for+chromatin+remodeling+and+inactivation+of+sex+chromosomes+in+male+mouse+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">H2AX is required for chromatin remodeling and inactivation of sex chromosomes in male mouse meiosis.</a> Dev Cell. 4 (4), 497-508 (2003).</li>
<li>Santaguida, S., Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+and+miracles+of+kinetochores%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">The life and miracles of kinetochores.</a> Embo J. 28 (17), 2511-2531 (2009).</li>
<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
<li>Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+in+chromatin+biology+and+epigenetics%3A+Elucidation+of+post-translational+modifications+of+histone+proteins+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry.</a> J Proteomics. 75 (12), 3419-3433 (2012).</li>
<li>Plazas-Mayorca, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-Pot+Shotgun+Quantitative+Mass+Spectrometry+Characterization+of+Histones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">One-Pot Shotgun Quantitative Mass Spectrometry Characterization of Histones.</a> J Proteome Res. 8 (11), 5367-5374 (2009).</li>
<li>Sidoli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drawbacks+in+the+use+of+unconventional+hydrophobic+anhydrides+for+histone+derivatization+in+bottom-up+proteomics+PTM+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Drawbacks in the use of unconventional hydrophobic anhydrides for histone derivatization in bottom-up proteomics PTM analysis.</a> Proteomics. 15 (9), 1459-1469 (2015).</li>
<li>Lin, S., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+histone+posttranslational+modification+patterns+by+high-resolution+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Examining histone posttranslational modification patterns by high-resolution mass spectrometry.</a> Methods Enzymol. 512, 3-28 (2012).</li>
<li>Sidoli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWATH+Analysis+for+Characterization+and+Quantification+of+Histone+Post-translational+Modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">SWATH Analysis for Characterization and Quantification of Histone Post-translational Modifications.</a> Mol Cell Proteomics. , (2015).</li>
<li>Krautkramer, K. A., Reiter, L., Denu, J. M., Dowell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+SAHA-Dependent+Changes+in+Histone+Modifications+Using+Data-Independent+Acquisition+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Quantification of SAHA-Dependent Changes in Histone Modifications Using Data-Independent Acquisition Mass Spectrometry.</a> J Proteome Res. , (2015).</li>
<li>Yuan, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpiProfile+Quantifies+Histone+Peptides+With+Modifications+by+Extracting+Retention+Time+and+Intensity+in+High-resolution+Mass+Spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">EpiProfile Quantifies Histone Peptides With Modifications by Extracting Retention Time and Intensity in High-resolution Mass Spectra.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (6), 1696-1707 (2015).</li>
<li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skyline%3A+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li>
<li>Yuan, Z. F., Lin, S., Molden, R. C., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+proteomic+search+engines+for+the+analysis+of+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of proteomic search engines for the analysis of histone modifications.</a> J Proteome Res. 13 (10), 4470-4478 (2014).</li>
<li>Tan, Y., Xue, Y., Song, C., Grunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylated+histone+H3K56+interacts+with+Oct4+to+promote+mouse+embryonic+stem+cell+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Acetylated histone H3K56 interacts with Oct4 to promote mouse embryonic stem cell pluripotency.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (28), 11493-11498 (2013).</li>
<li>Vonholt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Histones%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Histones.</a> Methods Enzymol. 170, 431-523 (1989).</li>
<li>Zhang, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+acetylation+and+methylation+sites+of+histone+H3+from+chicken+erythrocytes+by+high-accuracy+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-time-of-flight%2C+matrix-assisted+laser+desorption+ionization-postsource+decay%2C+and+nanoelectrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Identification of acetylation and methylation sites of histone H3 from chicken erythrocytes by high-accuracy matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight, matrix-assisted laser desorption ionization-postsource decay, and nanoelectrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> Anal. Biochem. 306 (2), 259-269 (2002).</li>
<li>Jufvas, A., Stralfors, P., Vener, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+Variants+and+Their+Post-Translational+Modifications+in+Primary+Human+Fat+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Histone Variants and Their Post-Translational Modifications in Primary Human Fat Cells.</a> Plos One. 6 (1), e15960(2011).</li>
<li>Bonaldi, T., Imhof, A., Regula, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combination+of+different+mass+spectroscopic+techniques+for+the+analysis+of+dynamic+changes+of+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">A combination of different mass spectroscopic techniques for the analysis of dynamic changes of histone modifications.</a> Proteomics. 4 (5), 1382-1396 (2004).</li>
<li>Zhao, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Proteomic+Analysis+of+Histone+Post-translational+Modifications+upon+Ischemia%2FReperfusion-Induced+Retinal+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative Proteomic Analysis of Histone Post-translational Modifications upon Ischemia/Reperfusion-Induced Retinal Injury.</a> J Proteome Res. 13 (4), 2175-2186 (2014).</li>
<li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable-isotope-labeled+histone+peptide+library+for+histone+post-translational+modification+and+variant+quantification+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Stable-isotope-labeled histone peptide library for histone post-translational modification and variant quantification by mass spectrometry.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2450-2466 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Burada açıklanan protokol maliyetleri, zaman ve performans dikkate alınarak optimize edilmiştir. Diğer preparasyonlar da mümkündür, ancak bunlar, özellikle MS analizi ile bağlanması durumunda, sınırlamaları vardır. Örneğin, yüksek tuz ekstraksiyon protokolü histonlar 26 yerine, TCA çökeltisi (bölüm 3) saflaştırmak için kullanılabilir. güçlü asit kullanmak değildir gibi yüksek tuz protokolü, özünde hafif olduğunu. Bu asit-labil PTMS koruyan ve TCA çökeltisi olarak, ekstre histonların verim artar diğer kromatin bağlayıcı proteinleri birlikte çökelir. Bununla birlikte, yüksek tuzlu ekstraksiyon HPLC-MS / MS çok konsantre tuzlu ihtiva eden numuneler yol açar. Tripsin inkübasyon süresi ve enzim / substrat oranı 27 azaltılması veya sindirim enzim 28-30 kadar argc kullanılarak, örneğin, - Alternatif bir preparasyonda, histon sindirim propionylation (8 Bölüm 6) olmadan gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, propiyonik anhidrid ile türetme, i önerilmektedirt iyi sıvı kromatografisi sırasında korunur daha hidrofobik peptitler oluşmasına sebep olur. Kimyasal türetme, organik asit anhidritleri, çeşitli değerlendirilmiştir ve yararları kapsamlı 18 ele alındı. Bununla birlikte, propiyonik anhidrit verimliliği, minimize yan ürünleri ve gelişmiş peptid hidrofobisite arasında en iyi uzlaşma kanıtladı. Potansiyel olarak, propionik anhidrid izotopik olarak etiketli halde satın alınabilir; bu durum birden fazla numune karıştırma ve ağır etiketten kazandırılan farklı kitlelere dayanan MS düzeyinde onları ayırmak olasılığına çoklayıcı analiz sağlar. Ancak bu analiz, LC-MS kromatogramının artan karmaşıklığı yol açar ve her bir durum için enjekte edilebilir numune miktarını azaltır. Bu bağlamda, protokol bazı kritik yönleri vurgulanmalıdır. Aşağıdaki CH gibi kullanılmalıdırnegatif sonuçlar elde edilmektedir halinde işlemi gerçekleştirmeden hataları bulmak için ecklist. İlk olarak, çekirdek yağış sonrası pelet dikkatlice NP-40 Alternatif (karıştırma esnasında kabarcıkların eksikliği fark) deterjan tamamen kaldırılması kadar (bölüm 2.10) olmadan ELVES ile yıkanmalıdır. bunu başaramayınca asitlerle histon çıkarma taviz verecek. İkinci olarak, TCA ile histon yağış (bölüm 3.9) aseton ile pelet yıkar sonra çok önemlidir. propionylation ve sindirim (bölüm 6.1) doğrudan yapılması halinde konsantre asit varlığı aşağıdaki adımı zarar verecektir. (Bölüm 5) gerçekleştirilir durumda histon ayrıştırmada değil sorunlu olacaktır. (- 6.7 bölüm 6.3) Üçüncü olarak, propionylation Reaksiyon hızlı bir şekilde gerçekleştirilir esastır. 4 ardışık numunelerin - Bunu yapmak için, en fazla 3 için aynı propionylation karışımı (propiyonik anhidrit + asetonitril) kullanmaktan kaçının. Ayrıca, pH tripsin sindirim (bölüm 7) en önemli yönüdür. değilse8.0 (7.5 - 8.5) etrafında sindirim etkisiz olacaktır. Numune bu aşamada propiyonik asit açısından zengin olacak gibi bu, olabilir. NH4OH gerektiğinde kadar ilave edilebilir. Ayrıca, proteomik iş akışları aşina araştırmacılar için tripsin sindirimi sonlandırmak için numunesi asitler normal hissedeceksiniz. Aşağıdaki reaksiyon, örneğin, peptid N-uçlarının (bölüm 8.1) propionylation tehlikeye gibi bu yapılmamalıdır. Son olarak, aynı konuda, o değiştirilmemiş peptitler gerçekten değiştirilmemiş olmayan veri analizi için hatırlamak önemlidir; tüm serbest lizin kalıntıları ve N-termini propionylation (56,026 Da) tarafından işgal edilecektir. Bu durumda, Peptid sekansına sadece karşı kitle çıkarma iyon kromatografisi performanstan sonuçlara neden olacaktır. yöntemin sınırlamaları gerçek ABUN ulaşmada önyargılar nedeniyle kısa peptid dizileri, birleştirici PTMS tespit yetersizlik çoğunlukla ilişkilidir veFarklı modifiye formlarda peptidler, farklı etkinliklerine sahip iyonize olabilir olması nedeniyle bir değişiklikten dans. Ilk konu orta-down ya da (16 gözden) yukarıdan aşağıya bir yaklaşımla bu tekniği birleştirerek çözülebilir. bile teknik olarak daha zor, Bu tip analiz, modifikasyon birlikte varlığı frekanslarını çalışmak için idealdir. Ayrıca, bazı peptitler, farklı histon türevleri aynı sekansa sahip yana zaman tabandan yukarı elde edilemez histon varyantları, daha iyi ayırt edilmesini sağlar. Iyonlaşma verimliliği ile ilgili ikinci mesele, sentetik peptidler 31 bir kütüphane kullanılarak çözülebilir. Bu yaklaşım, histon PTMS görece bolluğu daha doğru bir tahmin sağlar. Ancak, çoğu deneylerde, istenen sonucu analiz koşulları arasında verilen değişiklikler göreli değişikliklerdir. Bu durumda, böyle bir korelasyon nedeniyle parçaların aynı Bia sahip olması gerekli değildir,s. Sonuç olarak, bu protokol tandem MS bağlanmış NLC kullanarak 3 gün içinde tamamlanabilir histon PTMS analizi için izin verir. MS dışındaki teknikleri ile yapılan karşılaştırmalar, yani onlar hacmi bile neredeyse bu seviyeye ulaşmak olamaz girişte tartışıldığı gibi antikor bazlı stratejileri kullanarak, uygun değildir. Buna ek olarak, antikor tabanlı teknikler yeni değişiklikler keşfi için izin vermez, ama onlar sadece teyit ve tahmin işaretleri miktarının dayanmaktadır. Böylece ayar gen ekspresyonu kahramanları olan histon işaretleri, düzenlenmesi bilerek nedeniyle sezgisel avantajları proteomik laboratuarlarında popülerlik kazanmaya ve böylece proteom düzenlenmesini etkileyecek histon peptidler o aşağıdan yukarıya proteomik spekülasyon. Ayrıca, protokol açıklanan laborant için de histon analizi daha önemsiz hale veri analizi için numune hazırlama ve yazılım son gelişmeleri içerirhypermodified peptidlerin bu tür karakterizasyonu yaşamamış Tories.

Epigenetik altta yatan DNA dizisi 1. değiştirerek dışındaki mekanizmalar ile ortaya çıkan, gen ekspresyonunda kalıtımsal değişikliklerin çalışma olarak tanımlanır. Organizma dramatik fenotipik kendi DNA içeriği değişmez olsa bile değiştirir uğrar gibi epigenetik düzenleme gelişimi sırasında kritik önem taşımaktadır. Farklı mekanizmalar 2 vasıtasıyla gen ekspresyonunu etkileyen her biri histon post-translasyonel modifikasyonlar (PTMS), histon varyantları, kodlayıcı olmayan RNA&#39;lar, DNA metilasyonu ve DNA bağlama faktörler de dahil olmak üzere uygun bir epigenetik bakımı için gerekli kritik bileşenleri vardır. Örneğin, ise DNA metilasyonu geni çeviri 3, histon varyantları ve histon PTMS daha dinamik ve şekillerde 4 çeşitli kromatin etkileyebilir bastıran oldukça dengeli bir modifikasyonudur. en çok maruz kalan ve esnek bölgesi olarak Histon PTMS çok N-terminal kuyrukları lokalizeprotein. Ancak, nucleosome çekirdek de ağır ortalama proteinler 5 ile karşılaştırıldığında modifiye edilir. histon işaretleri yaygın son on yılda karakterize edilmiştir olsa da, bilinen histon işaretleri ve bunların fonksiyonu arasındaki birçok bağlantılar hala belirsiz. Bu en histon PTMS transkripsiyon 6,7 gibi belirli bir süreç değiştirmek için diğer PTMS ( &quot;cross-talk&quot;) ile tandem oldukça işlevi yalnız çalışmak değil, gerçeği büyük ölçüde kaynaklanmaktadır. Örneğin, gen p21 ile kombinasyon işareti H3S10K14ac iki PTMS 8 yalnızca birinde ortaya değil, transkripsiyonu aktive eder. Protein HP1 sıkıştırır H3K9me2 / Me3&#39;ten seçilen tanıma ve yakındaki nükleozom için değişiklik yayarak kromatin. Bitişik S10 9 fosforile olduğunda ancak, HP1 H3K9me2 / 3 bağlamak mümkün değil. H3K4 asetilasyonu Schizosaccharomyces pombe 10 H3K9me2 / Me3 protein spChp1 bağlanmasını engeller. Ayrıca, histon lizin Demethylase PHF8 üç PTMS H3K4me3, K9ac ve K14ac 11, bu en yüksek nükleozom bağlayıcı etkinliğe sahiptir. Bu örnekler histon PTM değişikliklerin küresel bir bakış elde ziyade tek değişiklikler odaklanarak önemini vurgulamaktadır. dizinin varlığı da varyantları histon izotipleri genellikle oldukça benzer dizilere sahip olarak, histon analiz karmaşıklığını artırır, ancak genellikle kromatin farklı rollere sahiptir. Örneğin, H2A.x daha kolay kanonik H2A 12 göre DNA hasarı üzerine fosforilatlanır bir C-terminal dizisine sahiptir, ve erkek farenin mayoz 13 cinsiyet kromozom inaktivasyonu için gereklidir; Benzer şekilde, CENP-A sentromer 14 kanonik histon H3 yerini alır. Farklı fonksiyonların rağmen, bu varyant belirlemek ve bunları ayrı ayrı ölçmek güçleştirir ilgili standart histon ile amino asidi dizisinin büyük bir bölümünü paylaşmaktadır. </p&gt; Böyle batı blot olarak antikor bazlı teknikler yoğun histon karakterize etmek kabul edilmiştir. Bununla birlikte, antikor bazlı yaklaşımlar, aşağıdaki nedenlerden dolayı sınırlıdır: (i) sadece modifikasyon varlığını teyit edebilir ve bilinmeyen PTMS belirleyemez; (Ii) bağlı bir bağlanma afinitesine etkileyebilir birlikte mevcut olan bakışı varlığında şekilde bastırılmaktadır; (iii) sadece çok az sayıda antikorlar, amacı ve (iv) çok benzer histon varyantları ya da benzeri PTMS (örneğin, di- ve lizin kalıntılarının trimethylation) arasındaki çapraz reaksiyona için uygun olarak, kombinasyon işaretleri tespit edilemez. Egelhofer ve ark. Ticari antikorların% 25&#39;ten fazla nokta leke veya Western blot ile özgüllük testleri başarısız ve spesifik antikorlar arasında% 20&#39;den fazla kromatin immüno deneyler 15 başarısız tanımlanmıştır. Kütle spektrometrisi (MS) şu anda, yeni ve / veya kombinasyon PTMS çalışma için en uygun bir analitik araç olduğunuve yaygın (16 gözden) histon proteinler için uygulamaya konmuştur. Bu, yüksek hassasiyet ve MS kütle hassasiyeti, ve büyük ölçekli analiz gerçekleştirmek için olasılığı çok bağlıdır. (- 20 aa 5) aşağıdan yukarı bir strateji Sağlam protein enzimatik kısa peptitler sindirilmiş burada histon karakterizasyonu ve PTMS için en yaygın olarak kullanılan MS tabanlı proteomik stratejidir. Bu sindirim LC ayrılması ve MS algılama hem de kolaylaştırır. 600 aralığında Kitleler - 2000 Da yaygın daha kolay iyonize ve daha geniş kitlelere daha yüksek kitle doğruluk ve çözünürlük ile tanımlanır. MS / MS parçalanması da kısa peptidler genellikle Çarpışmanın neden olduğu ayırma (CID) için çok uygundur, artırıldı. Bunlar son derece bazik amino asit kalıntısı, yani lisin ve arginin açısından zengin olan Ancak, histonlar aşağıdan yukarı MS için sorunlara neden olabilmektedir. Bu nedenle, bir şekilde tripsin emdirme çok sm olan peptidlerin oluşumuna yol açantüm LC tutma ve PTMS kesin lokalizasyonu için. Bu sorunu aşmak için, bizim protokol lizin ve peptit N-terminal kimyasal türetme 17 içermektedir. Propiyonik anhidrid kullanılması diğer reaktifler 18 ile karşılaştırıldığında etkili kimyasal türetme için tavsiye edilir. Tripsin, sadece arginin kalıntılarının, C-terminalindeki proteolizini gerçekleştirmek için izin Bu türetme blok edilmemiş ve monometil lizin kalıntılarının ɛ-amino grupları. Türetilmiş aminler çözümü ile protonları alışverişi olamaz ve bu nedenle peptitler genellikle sadece çift veya triply MS ve MS / MS algılama kolaylaştırmak, tahsil edilir. Ayrıca, N-terminal türetme peptit hidrofobiklik ve böylece ters faz kromatografik arttırır. Burada, histon arındırmak ve aşağıdan yukarıya proteomik (Şekil 1) üzerinden PTM analiz için onları hazırlamak için iş akışını açıklar. Bu strateji, tek histon işaretleri ve kombinasyon işaretleri f miktarının eldeamino asit dizisinde nispeten yakın olan ya da histon PTMS.

<table><tbody><tr><td>Tripsin% 0.25 EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td>Hücreleri hasat etmek için</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roche</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Klorür hekzahidrat</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür, susuz</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>15508-013</td><td></td></tr><tr><td>AEBSF</td><td>EMD Millipore Corp</td><td>101500</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosistin</td><td>Sigma</td><td>M4194</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Butirat</td><td>Sigma</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>Halt Proteaz ve Fosfataz İnhibitör Kokteyli, EDTA İçermeyen (100x)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>78445</td><td></td></tr><tr><td>NP-40 Alternatif</td><td>CALBIOCHEM</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>Sülfürik Asit, ACS sınıfı</td><td>Fisher Chemical</td><td>7664-93-9</td><td></td></tr><tr><td>Trikloroasetik asit</td><td>Sigma</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Sigma</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>Bradford reaktifi</td><td>Biorad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>%30 akrilamid/bis 29:1 &#8212; 500 ml</td><td>Biorad</td><td>1610156</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie</td><td>Fisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>C18 Sütunu (5 &#181; m) 2.1&nbsp; mm x 250&nbsp; mm</td><td>Grace</td><td>218TP52</td><td></td></tr><tr><td>C18 Sütun (5 &# 181; m) 4.6&nbsp; mm x 250&nbsp; mm</td><td>Grace</td><td>218TP54</td><td></td></tr><tr><td>HPLC sınıfı asetonitril</td><td>Fisher Chemical</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>HPLC sınıfı su</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6 4</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11650</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum Bikarbonat</td><td>Sigma</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>amonyum hidroksit</td><td>Sigma</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>propiyonik anhidrit</td><td>Sigma</td><td>240311</td><td></td></tr> MS <tr><td>Asetik Asit</td><td>Sigma</td><td>49199</td><td></td></tr><tr><td>C18 ekstraksiyon diski</td><td>Empore</td><td>2215</td><td></td></tr><tr><td>Formik Asit</td><td>Sigma</td><td>F0507</td><td></td></tr> <tr><td>için histonları sindirmek için</td>sıralama<td>derecesi modifiye tripsin</td><td>Promega</td><td>PRV5113</td></tr></tbody></table>

histon ekstraksiyon gönderen data analizi: aşağıdan yukarıya kütle spektrometre kullanarak histon post-translasyonel modifikasyonlar analizi için komple iş akışı

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Nükleozom histon proteinleri bir oktamer sarılı DNA 147 baz çifti oluşan kromatin küçük yapısal birimi vardır. Histon fonksiyonu, nükleer proteinlerin sayısız tarafından kapsamlı post-translasyonel modifikasyon aracılık eder. Onlar gen regülasyonu, DNA tamiri ve kromozom yoğunlaşma katılan kromatin yapısı ve işe enzimleri düzenleyen olarak bu değişiklikler, nükleer bütünlüğü için kritik öneme sahiptir. bilimsel topluluğun büyük bir kısmı histon PTM bolluk karakterize etmek antikor bazlı teknikleri benimser olsa epitop yakın değişikliklerle engel olabileceği gibi, bu yaklaşımlar, düşük verimlilik ve hypermodified proteinlere karşı önyargılı. Bu protokol, histon modifikasyonlarının tayini için daha kesin nano sıvı kromatografisi (nlC) ve kütle spektrometrisi (MS) kullanımını tarif etmektedir. Bu yöntem, histon PTMS çok çeşitli ve çok sayıda histonun göreceli olarak karakterize etmek için tasarlanmıştır s içinde varyantlarıingle analiz eder. uzunluğu 20 AA - Bu protokol, histonlar 5 peptidleri üretmek üzere tripsin ile sindirme ile ve ardından propiyonik anhidrid ile türetilir. Sindirimden sonra, histon peptitlerin yeni maruz kalan N-termini nlC-MS sırasında kromatografık tutma özelliğinin geliştirilmesi için türetilir. Bu yöntem, dört büyüklük düzeyinde kapsayan, histon PTMS rölatif ölçümü sağlar.

Bir örnek olarak, 200 ul hücre peletleri ile başlayan ve retinoik asit (RA), uyandırma olmadan insan embriyonik kök hücreleri (hESC), elde edilen histon analiz edilmiştir. hücre kültürü içinde RA varlığı ESC farklılaşmasına yol açar. histon peptidlerin birden LC-MS enjeksiyonları gerçekleştirmek için yeterli olandan daha fazla olan histon 100 ug ekstre edildi, - hücre peleti, yaklaşık olarak 50. Türetme, sindirim ve tuzunun alınması işlemlerinden sonra, numuneler bağlanmış mikroakışkan fiş ile yüksek performans sıvı nano kromatografi sistemi seri modda 75 mm x 15 cm C18 kolonu (parçacık çapı 3 um, gözenek boyutu 300 A) üzerine yüklendi bir melez doğrusal tuzak dört kutuplu - Orbitrap kütle spektrometresi. MS alıcı DIA kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Buna paralel olarak, numuneler bir melez iyon tuzağı-Orbitrap kütle spektrometresine birleşik nano akış UHPLC kullanılarak DDA yöntemi ile analiz edildi (veriler gösterilmemiştir). İçindeher döngü, bir tam MS Orbitrap algılama 1.400 m / z, 6. Sonra, veri bağımlı kazanç modu dinamik uygulandı 10 60000 AGC (m / z 200) ve bir çözünürlük 290 tarama aralığı ile gerçekleştirildi 30 saniye dışlama. MS / MS taramaları en yoğun olanlardan ana iyonları takip edildi. birine göre bir şarj durumu iyonlar MS / MS alınmadı. 2, m / z bir izolasyon penceresi kullanılmıştır. İyonlar% 35 çarpışma enerjisi ile çarpışma kaynaklı ayrışma (CID) kullanılarak parçalandı. İyon tuzağı algılama 10 4 AGC normal tarama aralığı modu ve normal tarama hızı ile kullanılmıştır. Ham MS verileri, yani 23 ve EpiProfile 22 Skyline, öncüsü ve fragmanı iyon kromatogramlar çıkarılması için yazılım benimseyerek analiz edildi. nedeniyle moral önceki bilgisine akıllı pik alan çıkarma entegre olarak EpiProfile, histon peptidler için optimize edilmiştirgelgit tutma süresi. Öte yandan, Skyline DIA analizleri için optimize edilmiştir ve bu nedenle görüntülenen DIA rakamları (Şekil 4 ve 5A) Bu yazılım ekran vardır. ekstre iyon kromatogramdan, eğri altındaki alan alınır ve bu, her bir peptidin bolluk tahmin etmek için kullanılır. Kromatografik tepe alanı [M + H] için hesaplanan +, [M + 2H] 2+ ve [M + 3H], aynı peptidin 3+ iyonları da çoğu durumda [M + 2H] olsa 2+ yaygın biçimiydi. Bu peptidin, belirli bir modifiye formda ham bolluk içerir. PTMS göreceli olarak elde etmek için, bir histon peptidin farklı tadil edilmiş biçimlerinin toplamı% 100 olarak kabul edilmiştir ve özellikle peptid bölge, tadil edilmiş biçimlerinin tümünde bu histon peptid için toplam alan ile bölünmesinin olduğu . Histon peptidler va mevcutizobarik formların riety (Şekil 5). ICD, peptidler, örneğin, K18ac ve K23ac, sadece özel fragman iyonları izobarik türleri (Şekil 5A ve 5B) oranını belirlemek için kullanılır MS / MS düzeyinde ölçülebilir. Bu oran, iki tür arasında kromatografik tepe alanı ayırmak için kullanılır. DDA kullanırken bu peptidler bir standart DDA deneyinde meydana olmaz, hangi onların bütün elüsyon yoluyla parçalanması için seçilmiş olması gerekir, çünkü bu izobarik formlar, hedef kitle listesinde alındı. izobarik türlerin görece bolluğu ayrımı daha sonra parça iyonlarının çıkış profili izleyerek gerçekleştirilir. Öte yandan, satın alma DIA tipi herhangi bir içerme listesi gerektirmez. Ancak, satın alma yöntemi bu tür bilinmeyen modifiye edilmiş peptidler keşif engelleyebilecek ve böylece geleneksel veritabanı arama ile uyumlu değildir ve. <p clfo eşek = &quot;jove_content&quot;: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Lizin asetilasyonu (+ 42,011 Da) yüksek çözünürlüklü MS satın alma (&gt; 30.000) kullanarak neredeyse izobarik trimethylation (+ 42,047 Da) ayırt edildi. Ayrıca, asetilasyon, daha sonra, ilgili trimethylated olanlardan daha asetillenmiş peptidlerin elüsyonu yol trimethylation daha hidrofobiktir. Aynı peptid modifiye edilmemiş bir şekilde bağlı lisin propionylated edilir olması nedeniyle, daha sonra çözülür. Özetle, tek değiştirilebilir site ile bir peptid için hidrofobiklik sırası di- ve trimethylated &lt;asetillenmiş &lt;değiştirilmemiş (propionylated) &lt;monometile (propionylated). farklılaşma (Şekil 6A ve 6B) için uyarıldığında HESC asetile peptidlerin açık bir azalma olduğunu göstermiştir. Önceki sonuçlar ayırt olanlar 25 ile karşılaştırıldığında EKH yüksek asetilasyonunu belirtildiği gibi bu, şaşırtıcı değildirpluripotent kromatin genellikle hoşgörülü doğasını yansıtmaktadır. Histon H3 odaklanarak, 35 farklı değiştirilmiş formları (Şekil 6C) ölçüldü. Bununla birlikte, bu yaklaşım ile araştırılabilir tüm histon proteoforms 200&#39;ün tüm histon varyantları ve az bulunan değişiklikleri (veriler gösterilmemiştir) da dahil olmak üzere, bulunmaktadır. Bunun yanı sıra, analiz (± standart sapmayı ifade eder) hata çubukları küçük boyutu ile kanıtlandığı gibi yüksek bir tekrarlanabilirliği teknik çoğaltır elde edilebileceğini göstermiştir. Birlikte ele alındığında, bu bölümde NLC-MS verileri kullanılarak histon modifiye edilmiş peptidler göreceli bolluk ayıklamak açıklamaktadır. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig1.jpg" /> Şekil 1:. Aşağıdan yukarıya MS / MS Histon Analiz İş Akışı histon analizi için on adım her adım için gerekli zamanın bir tahmin de dahil olmak üzere, gösterilir.<html> bölüm numarası yazının içinde mevcut olarak parantez içinde verilmiştir. Belirli bir varyantının son derece hassas analizine ihtiyaç olmadığı sürece çeşitli histon varyantları izole etmek için numune parçalaması açıklayan Bölüm 5, ihmal edilebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54112/54112fig2.jpg" /> Şekil 2: histon Varyant fraksiyonasyonunda ve Coomassie Jel için Ters Fazlı Yüksek Akış LC (A) bozulmamış histon ayrımını temsil eden LC-UV kromatogramı.. Histon H3 varyantları elüsyon zamanına göre birbirlerinden ayırt edilebilir. Fraksiyonlar bir otomatik kısım toplayıcısı kullanılarak ve ya elle ya da toplanabilir. Histon arıtma üç kez tekrarlanmış olan (B), Coomassie jeli.= &quot;Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig2large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54112/54112fig3.jpg" /> Şekil 3:. P1000 pipet ile Tak Sahne devrilme Yapımı, bir katı faz ekstraksiyon disk (ikinci panel) C 18 malzemeden yapılmış bir disk yumruk. küçük kılcal her türlü kullanarak küçük bir P100 / 200 pipet içine itilebilir böylece MiniDisk, ucu (orta panel) sopa olacak. Bu örnekte, 700 ml&#39;lik bir dış çapı kaynaşık silika boru kullanılır. MiniDisk herhangi başka (son paneli) gidemez kadar P100 / 200 pipet altına itilmesi gerekir. Bu çok sayıda kopya için yeterli numune malzeme tutmak için yeterli kapasiteye sahip olduğu aşama ucu, histon tuzsuzlaştırma hazırdır. sa, 20 ug - Özellikle, bir MiniDisk 15 yetermple. Daha fazla örnek gerekiyorsa, çoklu diskler birbirlerine paketlenmiş olabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54112/54112fig4.jpg" /> Şekil 4:. DDA kullanırken DDA ve DIA Yöntemleri şematik bir temsilidir, MS tarama döngüsü yoğunluk ve yük durumuna göre, MS / MS parçalanması için ön-madde iyonlarının sıralı seçilmesiyle karakterize edilir. bir öncü iyon parçalanmış edildikten sonra MS daha az bol sinyalleri içine &quot;kazmak&quot;, böylece aynı peptid tekrarlayan seçimini önlemek için bir dışlama listesine yerleştirilir. Bu satın alma yöntemi keşif modu için proteomikteki tercih edilen tekniktir. Niceleme belirlenen MS yanında belirli bir iyon tam tarama sinyal entegre edilerek elde edilir /MS spektrum. DIA, tüm m / z aralığı her tarama döngüsünde parçalanır. Bu yaklaşım, bulma modu için daha az uygun olan fakat tüm iyonlar, öncüler ve ürünleri kromatografik profili sağlar. Bu daha güvenli ölçümü ve izobarik formların ayrımcılığa yol açar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54112/54112fig5.jpg" /> Şekil 5: Isobaric Peptides miktarının histon analizinde genellikle bol iki izobarik peptidlerin (A) Örnek.. çıkarılan iyon kromatogramı onların habercisi kütlesi ve (yukarıda) göreceli izotop (XIC) aynıdır. Ancak, ürün iyonları XIC (aşağıda) iki İzobarik formların ayrımcılık için izin verir. Özellikle, sadece tek fragman iyonları bizi olmalıdıred. İki türlerin göreceli bolluk tahmin (kırmızı vurgulanmış) iki açıklanan peptidler için benzersiz fragman iyonları (B) Temsil. En az bir izobarik eşdeğer olan Homo sapiens yaygın olarak analiz peptitlerin (C) Liste için. Sıra listelenen histon peptitler gösterilir arasında. Varyantları <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig5large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/54112/54112fig6.jpg" /> Şekil 6: ve Retinoik Asit Tedavisi olmadan İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Temsilcisi Sonuçlar (A) histon H3 peptid KQLATKAAR rölatif ölçümü - onun değiştirilmiş proteoforms tüm (aa 18 26).. göreceli bolluk% 100 (rel olarak tüm proteoforms kullanılarak tahmin edilmiştir. değiştirilmemiş peptid ative yüzdesi) gösterilen histon H3 peptid KSTGGKAPR (aa 9 (B) Bağıl miktar değil -. 17) (C) ve retinoik asit ile hücre tedavisi olmadan kanonik histon H3 için tespit edilen peptidlerin Bağıl bolluğu. Şekil verilen değişiklikler (&gt;% 50) daha fazladır iki tedavinin içinde gösterir. Genel olarak, biz histon H3 asetillendirme hücre farklılaşmasının indüksiyonu üzerine lizin kalıntılarının çoğu azaldığını göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Çözüm # </td><td colspan="7"> kompozisyon </td></tr><tr><td> 1 </td><td colspan="7"> Nükleer Yalıtım tamponu (NIB) hazır aşağıdaki gibi hazırlandı ve -20 ° C de, 100 ml alikotları olarak dondurulmuş olarak saklanır; çözülmüş15 mM Tris, 60 mM KCI, 15 mM NaCI, 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 250 mM sükroz: NIB birkaç hafta boyunca 4 ° C&#39;de saklanabilir. tampon pH&#39;ı HCI ile 7.5&#39;e ayarlandı. </td></tr><tr><td> 2 </td><td colspan="7"> Proteaz inhibitörleri (tampon taze ilave kullanımdan önce) GKD 2 içinde 1 M ditiyotreitol (DTT), O (1,000x); GKD 2 O (400x) 200 mM AEBSF </td></tr><tr><td> 3 </td><td colspan="7"> fosfataz inhibitörleri (tampon taze ilave kullanımdan önce): 2.5 uM Mikrokistin% 100 etanol (500x) </td></tr><tr><td> 4 </td><td colspan="7"> HDAC inhibitörü (kullanımdan önce tampon taze ekleme): 5 M sodyum bütirat, pH 7.0 (500x) için NaOH ile 5 M butirik asit titrasyonu ile yapılan </td></tr><tr><td> 5 </td><td colspan="7"> NP-40 Alternatif: GKD 2 O içinde% 10 h / h </td></tr><tr><td> 6 </td><td colspan="7"> GKD 2 O 0.2 MH 2 SO 4 </td></tr><tr><td> 7</td><td colspan="7"> Trichloroacetic asit (TCA):% 100 w / GKD 2 O v </td></tr><tr><td> 8 </td><td colspan="7"> Aseton +% 0.1 hidroklorik asit (HCl):% 0.1 h / h HCI aseton </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Çözümler.

Bu protokol, kütle spektrometrisi (MS) ile histon post-translasyonel modifikasyonları karakterize etmek için tamamen entegre bir iş akışı özetlenmektedir. iş akışı nano-akış sıvı kromatografi ve veri analizi için talimatları kullanarak hücre kültürlerinde veya dokular, histon türetilmesi ve sindirim, MS analizi gelen histon arınma içerir. 3 gün - protokol 2 içinde tamamlanması için tasarlanmıştır.

Histon Ekstraksiyon Gönderen Data Analizi: Aşağıdan yukarıya Kütle Spektrometre kullanarak histon post-translasyonel modifikasyonlar Analizi için komple iş akışı

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Bu protokolün genel amacı, gen ifadesinin düzenlenmesi ve kromozom kondansasyonu gibi kromatin biyolojisinde temel roller oynayan histon translasyon sonrası modifikasyonlarının göreceli bolluğunu değerlendirmek için basit bir prosedür sağlamaktır. Bu yöntem, kromatin biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Örneğin, belirli hücrelerin veya dokuların stimülasyonu veya tedavisi üzerine hangi histon modifikasyonlarının göreceli bolluğunun değiştiği gibi.Bu tekniğin temel avantajı, kütle spektrometrisi tabanlı proteomik kullanarak, tek bir analizde bilinen proteinlerdeki bilinen PTM'lerin çoğunu eş zamanlı olarak nicelendirebilmemizdir. Histon modifikasyon analizi, ilaç tedavisi veya stres sonrası bireylerin veya model sistemlerin epigenetik değişikliklerini ve kromatin işleyişini tahmin etmek dahil olmak üzere çok sayıda uygulama alanına sahiptir. Simone'ye ek olarak, laboratuvarımdan diğer iki üye de bu protokolün prosedürlerini uygulamalı olarak gösterecektir.Araştırma uzmanı Natarajan Bhanu ve lisansüstü öğrencisi Kelly Karch. Bu iş akışında gösterildiği gibi, bu protokol; hücre kültürlerinden veya dokulardan histon saflaştırmayı, histon türevlendirmeyi, sindirimi ve tuzdan arındırmayı ve nanoflow sıvı kromatografisi kullanılarak yapılan kütle spektrometrisi analizini içeren 10 adımlık bir prosedürdür. Bu videoda yalnızca seçili prosedürler gösterilecektir.Sağlam hücrelerden çekirdek izole etme prosedürüne başlamak için, daha önce hasat edilmiş ve negatif 80 santigrat derece Celsius'ta saklanmış hücreleri buz üzerinde çözdürün. Ve protokol metninde açıklandığı gibi çekirdek izolasyon tamponunu veya NIB'yi hazırlayın. NIB hacminin beşte birini çıkarın ve nihai konsantrasyonu 0.2% olacak şekilde NP-40 Alternative ekleyin. Kalan beşte dört hacim yıkamalar için kullanılacaktır.Hücre peletini, hücre peleti hacmi ile tampon hacmi arasında 1:10 oranını kullanarak NP-40 Alternative içermeyen NIB ile yıkayın. 700 RCF'de beş dakika santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın. Hücre peletini buz üzerine yerleştirip, hücre peleti hacmi ile tampon hacmi arasında 1:10 oranında %0,2 NP-40 Alternative içeren NIB ekleyerek lize edin.Hücreleri nazikçe pipetleyerek homojenize edin. Hücrelerin liz olması ve çekirdeklerin serbest kalması için homojenize edilmiş hücreleri buz üzerinde beş ila 10 dakika inkübe edin. Dört derece Celsius'ta, 1000 RCF'de beş ila 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Çökelek esas olarak hücre çekirdeklerini içerirken, süpernatan esas olarak sitoplazmik bileşenleri içerecektir. İstenirse sitoplazmik fraksiyon saklanabilir. Çökelek hacmine karşı 1:10 tampon hacmi oranını kullanarak, çekirdek çökeleğini NP-40 Alternatifi içermeyen NIB ile nazikçe yeniden süspanse ederek yıkayın.4 °C'de beş dakika boyunca 1000 RCF'de santrifüjleyin ve süpernatanı uzaklaştırın. NP-40 Alternatifi çekirdek peletinden tamamen uzaklaştırıldıktan sonra, çekirdek hacmi ile sülfürik asit hacmi 1:5 oranında olacak şekilde buz gibi 0,2 molar sülfürik asit ekleyin. Çekirdekleri, nazikçe pipetleyerek sülfürik asit içinde yeniden süspande edin.Numuneyi sabit rotasyonla veya hafifçe çalkalayarak, dört derece Celsius'te iki ila dört saat boyunca inkübe edin. Ardından, numuneyi dört derece Celsius'te 3400 RCF'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Çözünmeyen maddeleri uzaklaştırmak için işlemi tekrar santrifüjleyip süpernatanı yeni bir tüpe aktarın.Histonları çöktürmek için, toplanan süpernatanta 1:3 hacim oranında soğutulmuş, %100 trikloroasetik asit veya TCA ekleyin. Numunenin bulanıklaşması, histonların varlığını gösterir. Tüpü birkaç kez tersyüz ederek karıştırın.Karışımı buz üzerinde en az bir saat inkübe edin. 3400 RCF'de beş dakika santrifüjleyin. Santrifüjleme sonrası histonlar tüpün kenarlarına yapışacak ve aynı zamanda dibe çökecektir.Tüpün en altında, çoğunlukla histon dışı proteinler ve diğer biyomolekülleri içeren beyaz, çözünmeyen bir pelet de oluşacaktır. Tüpün kenarlarını veya dipteki peleti kazımadan, süpernatanla dikkatlice aspirasyon yaparak uzaklaştırın. Cam bir Pasteur pipeti kullanarak, kenarları ve tabanı kaplayan çökmüş proteinlerin üzerini örtecek şekilde tüpü %100 buz gibi soğuk aseton ve %0,1 hidroklorik asit ile durulayın.3400 RCF'de iki dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı, kenarları veya peleti kazımadan dikkatlice aspire edin. Tüpü %100 buz gibi soğuk asetonla durulayın, tekrar santrifüjleyin ve kenarları veya peleti kazımadan süpernatanı uzaklaştırın.Ardından, protokol metninde açıklandığı şekilde histon kantifikasyonu ve saflık analizi gerçekleştirilir. Histon türevlendirmesi öncesinde, isteğe bağlı olarak ters fazlı HPLC ile histon varyantlarının fraksiyonasyonu da yapılabilir. Bu prosedüre, histon örneklerini 40 µL 50 mM amonyum bikarbonatta (pH 8.0) çözerek başlayın.Aspirasyon yapmadan bir P10 pipet ucunu numuneye daldırarak ve pipet ucunu bir pH indikatör şeridine değdirerek pH değerini kontrol edin. pH değerini 8,0'a ayarlamak için amonyum hidroksit ve formik asit kullanın. Bu aşamadan itibaren, propionik anhidrit kullanımını içeren tüm adımlar bir çeker ocakta gerçekleştirilmelidir.Propionik anhidritin reaktivitesini korumak için aynı anda en fazla üç ila dört numune işleyin. Propionik anhidriti asetnitril ile 1:3 hacim oranında karıştırarak taze propionilasyon reaktifi hazırlayın. Propionilasyon reaktifini her bir numuneye 1:4 hacim oranında ekleyin.Çözeltinin pH değerini yeniden 8,0'a getirmek için hızlıca amonyum hidroksit ekleyin. Genellikle, pH 8,0'ı yeniden sağlamak için örneğe 1:5 hacim oranında amonyum hidroksit eklemek uygundur. Vortex kullanarak hemen karıştırın.pH değerini kontrol edin. Numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. Tüm numunelerin propionilasyonu tamamlandıktan sonra, numuneleri bir vakum konsantratöründe 10 ila 20 microliters hacme kadar kurutun.Numuneleri, nihai hacim 40 µL olana kadar ddH2O ile yeniden süspande edin veya seyreltin. Tuzlar, sıvı kromatografisini ve kütle spektrometresini engellediği için numuneler analizden önce tuzdan arındırılmalıdır. Bu videoda sadece stage-tip'lerin hazırlanışı gösterilecektir.Bir katı faz ekstraksiyon diskinden C18 materyali şeklinde bir disk çıkarmak için P1000 pipet ucu kullanın. Mini-diski P1000 ucundan dışarı iterek bir P100 veya P200 pipet ucunun tabanına yerleştirmek için kuvars kılcal boru kullanın. Diskin ucun tabanına sıkıca yerleştiğinden emin olun.25 µg'dan fazla örnek tuzsuzlaştırma işlemi yapılacaksa, aynı P100 veya P200 uç içerisinde iki adet C18 mini-disk kullanın. Stage-tip'leri 1,5 veya 2 mL'lik mikrosantrifüj tüplerinde sabit tutmak için bir santrifüj adaptörü kullanın. C18 materyali aktive etmek ve potansiyel kontaminanları uzaklaştırmak için reçineyi 50 µL %100 acetonitrile ile yıkayarak temizleyin.Numune tuzsuzlaştırma işlemi daha sonra protokol metninde açıklandığı şekilde gerçekleştirilir. Histon peptidleri çeşitli izobarik formlarda bulunur. Histon analizlerinde yaygın olarak karşılaşılan iki örnek gösterilmiştir.Yukarıda gösterilen öncül kütlelerinin ve ilgili izotoplarının çıkarılmış iyon kromatogramları birbirinin aynıdır. Ancak, aşağıda gösterilen ürün iyonlarının çıkarılmış iyon kromatogramı, iki izobarik formun ayırt edilmesine olanak tanır. İki türün göreceli bolluğunu tahmin etmek için yalnızca kırmızıyla vurgulanan özgün fragman iyonlar kullanılmalıdır.Retinoik asit stimülasyonu uygulanmış ve uygulanmamış insan embriyonik kök hücrelerinden ekstrakte edilen histonlar analiz edildi. İki histon H3 peptidinin bağıl kantifikasyonu, diferansiyasyon için stimüle edilmiş insan embriyonik kök hücrelerinde asetilasyonun belirgin şekilde azaldığını ortaya koydu. Bu durum, diferansiyasyon geçiren hücrelere kıyasla embriyonik kök hücrelerde daha yüksek asetilasyon olduğunu belirten önceki raporlarla tutarlıdır.Bu teknik bir kez kavrandığında, uygun şekilde uygulandığı takdirde üç günde tamamlanabilir. Birinci gün histon ekstraksiyonu, ikinci gün protein türevlendirme ve sindirimi ve üçüncü gün peptid türevlendirme, stage-tipleme ve LC-MS analizi için ayrılır. Histon saflaştırma, kombinatoryal histon modifikasyonlarının karakterize edilmesinin mümkün olduğu middle-down ve top-down proteomik dahil olmak üzere, peptid analizleri dışındaki diğer amaçlar için de kullanılabilir.Bu videoyu izledikten sonra, kütle spektrometrisi tabanlı proteomik kullanarak histon post-translasyonel modifikasyonlarının nasıl tanımlanacağı ve nicelendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

complete-workflow-for-analysis-histone-post-translational

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Yerli birleştirerek ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile kromatin imunopresipitasyon çapraz bağlanmasıyla, ChroP yaklaşım histon modifikasyonları, çeşitleri ve fonksiyonel olarak farklı kromatin etki de synergizing olmayan histonic proteinlerin kompozit proteomik mimarisini incelemek için olanak sağlar.

ChroP Yaklaşım Kromatin Odağı özgü Proteomic Manzaralar teşrih Chip ve Kütle Spektrometre birleştirir

Bu makalenin amacı, bir kapsamlı, sistematik rehber histon H3 ve H4 etkili arınma ve miktar acetylated histon kalıntılarının sağlamaktır.

Arıtma H3 ve H4 histon proteinleri ve Acetylated histon işaretleri hücrelerinde ve beyin dokusu miktar

Protokol, kuraklığa dayanıklı ürünlerin mühendisliğine yardımcı olmak için potansiyel epigenetik belirteçler olarak hizmet edebilecek histone post-translational modifikasyonların profillenebilmesi için sorgum yaprağı malzemelerinden bozulmamış histonları etkili bir şekilde çıkarmak için geliştirilmiştir.

Potansiyel Epigenetik belirteçlerin Yukarıdan Aşağıya Kütle Spektrometresi Profillemi için Sorgum Yaprak Dokusundan Histone İzolasyonu

Bu protokol, üç boyutlu bir hücre kültürü sisteminin, kromatin modifikasyonlarını fizyolojik bir durumda modellemek, tedavi etmek ve analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini özetlemektedir.

Karaciğer Dokusunun 3D Hücre Kültürü Modelinde Histone Post-Translasyonel Modifikasyonlarının Küresel Düzeyde Nicelleştirilmesi

Histon modifikasyonlarının yüksek güvenilirlikli ve yüksek oranda tekrarlanabilir "aşağıdan yukarıya" analizi ve temel parametrelere (alıkonma süresi [RT], çarpışma kesiti [CCS] ve doğru kütle-yük [m/z] oranı) dayalı tanımlama için sıvı kromatografisi, sıkışmış iyon hareketlilik spektrometrisi ve uçuş zamanı kütle spektrometrisine (LC-TIMS-ToF MS/MS) dayalı analitik bir iş akışı.

Sıvı Kromatografisi, Sıkışmış İyon Hareketlilik Spektrometrisi ve Uçuş Süresi Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Histon Modifikasyon Taraması

Bu protokol, çeşitli klinik örneklerden verimli histon çıkarımı ve ardından LC-MS/MS ile translasyonel sonrası modifikasyon analizini sağlar. Önemli histon modifikasyonlarının sağlam tespitini kolaylaştırarak, büyük klinik kohortlarda kapsamlı epigenetik profilleme için değerli bir araç olarak hizmet eder.

Kütle Spektrometrisi ile Epigenetik Profilleme için Klinik Örneklerden Histonların Ekstraksiyonu

Burada, izotopik iki plex etiketleme stratejisi ve ArgC sindirimi kullanarak tek hücreli histon post-translasyonel modifikasyon analizini otomatikleştirmek için bir protokol sunuyoruz. Bu iş akışı, tek hücre çözünürlükte kromatin heterojenliği ve epigenetik yanıtların nicel, tekrarlanabilir ve yüksek hassasiyetli profillenmesini mümkün kılar.

Tek Hücreli Histon Post-Translasyonel Modifikasyonlarının Çoklayıcı Analizi için Otomatik Örnek Hazırlığı (sc-hPTM2)

Nucleosome ELISA (NU-ELISA), post-translasyonel modifikasyonlar, doğal, bozulmamış nükleozom hazırlıkları küresel kalıplarını tespit etmek için hassas ve kantitatif bir yöntemdir. Bu değişiklikler özel histon amino asit artıkları metilasyonla, asetilasyon, fosforilasyon, ve dolayısıyla NU-ELISA belirli hücre tiplerinin genel kromatin modifikasyon devletlerin küresel bir proteomik tahlil sağlar.

ELISA yöntemi ile yerli bozulmamış nükleozom Post-translasyonel modifikasyonlar Algılama

Özgü bitki genleri histon değişiklikleri algılamak için güvenilir ve faydalı bir yaklaşım açıklanmıştır. Bu yaklaşım, kromatin immunoprecipitation (ChIP) ve gerçek zamanlı kantitatif PCR birleştirir. Çeşitli fizyolojik süreçlerde bir rol ile spesifik genlerin histon modifikasyonları tespiti sağlar.

Bitki Leaves Histon değişiklik tespiti

Biz H1 bağlayıcı histonlarının ekspresyon düzeyleri analiz testleri bir dizi açıklar. H1 histon protein miktarının HPLC analizi ile elde edilir ise bireysel H1 genlerin mRNA kantitatif gerçek zamanlı PCR ile takip rastgele astar göre ters transkripsiyon ile ölçülür.

Memeli Linker-histon Alttipleriyle İfadesi Analizi

Öğrenin histon post-translasyonel modifikasyonlarını kütle spektrometresi kullanarak analiz etme yöntemini. Bu protokol, kromatin biyolojisi ve epigenetik değişiklikleri incelemek için güvenilir bir iş akışı sunar.

Histon Ekstraksiyon Gönderen Data Analizi: Aşağıdan yukarıya Kütle Spektrometre kullanarak histon post-translasyonel modifikasyonlar Analizi için komple iş akışı (Video) | JoVE Journal

Histon Ekstraksiyon Gönderen Data Analizi: Aşağıdan yukarıya Kütle Spektrometre kullanarak histon post-translasyonel modifikasyonlar Analizi için komple iş akışı

Daha fazla video keşfet