Histon Ekstraksiyon Gönderen Data Analizi: Aşağıdan yukarıya Kütle Spektrometre kullanarak histon post-translasyonel modifikasyonlar Analizi için komple iş akışı

Bu protokolün genel amacı, gen ekspresyonunun düzenlenmesi ve kromozom yoğunlaşması gibi kromatin biyolojisinde önemli roller oynayan histon translasyon sonrası modifikasyonların nispi bolluğunu değerlendirmek için basit bir prosedür sağlamaktır. Bu yöntem, kromatin biyolojisi alanındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Örneğin, hangi histon modifikasyonları, verilen hücrelerin veya dokunun uyarılması veya tedavisi üzerine nispi bolluklarını değiştirir.

Bu tekniğin temel avantajı, kütle spektrometresi tabanlı proteomik kullanarak, bilinen proteinler üzerindeki bilinen PTM'lerin çoğunu tek bir analizde aynı anda ölçebilmemizdir. Histon modifikasyon analizinin, ilaç tedavisi veya stres üzerine bireylerin veya model sistemin epigenetik değişikliklerinin ve kromatin çalışmasının tahmin edilmesi dahil olmak üzere çok sayıda uygulaması vardır. Simone'a ek olarak, laboratuvarımın diğer iki üyesi de bu protokolün prosedürlerini gösterecek.

Bir araştırma uzmanı olan Natarajan Bhanu ve bir yüksek lisans öğrencisi olan Kelly Karch. Bu iş akışında gösterildiği gibi, bu, hücre kültürlerinden veya dokulardan histon saflaştırması, histon türevlendirmesi, sindirim ve tuzdan arındırma ve nanoflow sıvı kromatografisi kullanılarak kütle spektrometresi analizini içeren 10 adımlı bir protokoldür. Bu videoda yalnızca seçilen prosedürler gösterilecektir.

Çekirdekleri sağlam hücrelerden izole etme prosedürüne başlamak için, daha önce hasat edilmiş ve eksi 80 santigrat derecede depolanmış hücreler olan buz üzerinde çözülür. Ve protokol metninde açıklandığı gibi nükleer izolasyon tamponunu veya NIB'yi hazırlayın. Beşte bir NIB hacmini çıkarın ve %0,2'lik nihai konsantrasyona NP-40 Alternatifi ekleyin Kalan dört-beşte birlik hacim yıkamalar için kullanılacaktır.

Hücre peletini NP-40 Alternatifi olmadan NIB ile yıkayın, hücre pelet hacminin tampon hacmine 1:10 oranını kullanarak. 700 RCF'de beş dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Buz üzerine yerleştirerek ve hücre pelet hacminin tampon hacmine 1:10 oranında %0.2NP-40 Alternatifi ile NIB ekleyerek hücre peletini parçalayın.

Hücreleri nazik pipetleme ile homojenize edin. Homojenize hücreleri, hücrelerin parçalanması ve çekirdekleri serbest bırakması için beş ila 10 dakika buz üzerinde inkübe edin. Dört santigrat derecede beş ila 10 dakika boyunca 1000 RCF'de santrifüjleyin.

Pelet çoğunlukla hücre çekirdeği içerecek, süpernatan ise çoğunlukla sitoplazmik bileşenler içerecektir. İsterseniz sitoplazmik fraksiyonu kaydedin. Çekirdek peletini, NP-40 Alternatifi olmadan NIB'yi nazikçe yeniden askıya alarak, pelet hacminin tampon hacmine 1:10 oranını kullanarak yıkayın.

Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 1000 RCF'de santrifüjleyin ve süpernatenti çıkarın. NP-40 Alternatifi, çekirdek peletinden tamamen çıkarıldıktan sonra, çekirdek hacminin sülfürik asit hacmine 1: 5 oranında buz gibi soğuk 0.2 molar sülfürik asit ekleyin. Nazik pipetleme ile sülfürik asit içindeki çekirdekleri yeniden süspanse edin.

Numuneyi sabit rotasyonla veya dört santigrat derecede iki ila dört saat boyunca hafifçe sallayarak inkübe edin. Daha sonra, numuneyi 3400 RCF'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin ve süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Tekrar santrifüjleyin ve çözünmeyen herhangi bir materyali çıkarmak için süpernatanı yeni bir tüpe aktarın.

Histonları çökeltmek için, toplanan süpernajanta 1:3 hacim oranında soğutulmuş, %100 trikloroasetik asit veya TCA ekleyin. Histonların varlığı, numunenin bulanıklaşmasıyla gösterilir. Tüpü birkaç kez ters çevirerek karıştırın.

Karışımı buz üzerinde en az bir saat inkübe edin. 3400 RCF'de beş dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, histonlar tüpün kenarlarını kaplayacak ve ayrıca altta birikecektir.

Tüpün en altında, çoğunlukla histon olmayan proteinler ve diğer biyomolekülleri içeren beyaz, çözünmeyen bir pelet de oluşacaktır. Tüpün kenarlarını veya tüpün altındaki peleti kazımadan süpernatanı aspirasyonla dikkatlice çıkarın. Bir cam Pasteur pipeti kullanarak, tüpü %100 buz gibi soğuk aseton artı %0.1 hidroklorik asit ile durulayın, böylece yanları ve tabanı kaplayan çökelmiş proteinleri kaplayın.

3400 RCF'de iki dakika santrifüjleyin. Süpernatanı, kenarları veya peleti kazımadan dikkatlice aspire edin. Tüpü %100 buz gibi soğuk asetonla durulayın, tekrar santrifüjleyin ve kenarları veya peleti kazımadan süpernatanı çıkarın.

Daha sonra, protokol metninde açıklandığı gibi histon miktar tayini ve saflık analizi yapılır. Histon türevlendirmesinden önce histon varyantlarının ters fazlı HPLC ile isteğe bağlı bir fraksiyonlaması da gerçekleştirilebilir. Bu prosedüre, histon örneklerini 40 mikrolitre 50 milimolar amonyum bikarbonat, pH 8.0 içinde çözerek başlayın.

Numuneye aspirasyon olmadan bir P10 pipet ucu sokarak ve pipet ucunu bir pH indikatör şeridine dokundurarak pH'ı kontrol edin. PH'ı 8.0'a ayarlamak için amonyum hidroksit ve formik asit kullanın. Bundan sonra, propiyonik anhidrit kullanımını içeren tüm adımlar bir çeker ocakta gerçekleştirilmelidir.

Propiyonik anhidriti reaktif tutmak için bir seferde en fazla üç ila dört numuneyi işleyin. Propiyonik anhidrit ile asetonitrili 1:3'lük bir hacim oranında karıştırarak taze propiyonilasyon reaktifi hazırlayın. Propiyonilasyon reaktifini her numuneye 1:4 hacim oranında ekleyin.

Çözeltiye pH 8.0'ı yeniden oluşturmak için hızlı bir şekilde amonyum hidroksit ekleyin. Genellikle, pH 8.0'ı yeniden oluşturmak için numuneye 1:5 hacim oranına sahip amonyum hidroksit eklenmesi uygundur. Hemen girdap yaparak karıştırın.

PH'ı kontrol edin. Numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Tüm numuneler propiyonilasyona tabi tutulduktan sonra, numuneleri bir vakum yoğunlaştırıcıda 10 ila 20 mikrolitreye kadar kurutun.

20 mikrolitre nihai hacim elde edilene kadar numuneleri ddH40 ile yeniden askıya alın veya seyreltin. Tuzlar sıvı kromatografisini ve kütle spektrometresini engellediğinden, analizden önce numunelerin tuzdan arındırılması gerekir. Bu videonun amaçları doğrultusunda, yalnızca sahne ipuçlarının yapımı gösterilecektir.

Katı faz ekstraksiyon diskinden bir C1000 malzeme diskini delmek için bir P18 pipet ucu kullanın. Mini diski P1000 ucundan dışarı ve P100 veya P200 pipet ucunun altına itmek için kaynaşmış bir silika kılcal damar kullanın. Diskin ucun alt kısmında güvenli bir şekilde sıkıştığından emin olun.

25 mikrogramdan fazla numuneyi tuzdan arındırıyorsanız, aynı P18 veya P100 ucunda iki C200 mini disk kullanın. Sahne ipuçlarını 1,5 veya iki mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde yerinde tutmak için bir santrifüj adaptörü kullanın. C18 malzemesini aktive etmek ve olası kirleticileri gidermek için 50 mikrolitre %100 asetonitril ile döndürerek reçineyi yıkayın.

Numune tuzdan arındırma işlemi daha sonra protokol metninde açıklandığı gibi gerçekleştirilir. Histon peptitleri çeşitli izobarik formlarda bulunur. Histon analizinde yaygın olarak bol miktarda bulunan iki örnek gösterilmiştir.

Yukarıda gösterilen öncü kütlelerinin ve bağıl izotoplarının ekstrakte edilen iyon kromatogramı aynıdır. Bununla birlikte, aşağıda gösterilen ürün iyonlarının ekstrakte edilmiş iyon kromatogramı, iki izobarik formun ayırt edilmesine izin verir. İki türün nispi bolluğunu tahmin etmek için yalnızca kırmızıyla vurgulanan benzersiz parça iyonları kullanılmalıdır.

Retinoik asit stimülasyonu olan ve olmayan insan embriyonik kök hücrelerinden ekstrakte edilen histonlar analiz edildi. İki histon H3 peptidinin nispi niceliği, farklılaşma için uyarılan insan embriyonik kök hücrelerinde asetilasyonda net bir azalma olduğunu ortaya koydu. Bu, farklılaşan hücrelere kıyasla embriyonik kök hücrelerde daha yüksek asetilasyonun önceki raporlarıyla tutarlıdır.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa üç gün içinde yapılabilir. Histon ekstraksiyonu için bir gün, protein türevlendirmesi ve sindirimi için ikinci gün ve peptit türevi, aşama devri ve LC-MS analizi için üçüncü gün. Histon saflaştırması, kombinatoryal histon modifikasyonlarını karakterize etmenin mümkün olduğu orta-aşağı ve yukarı-aşağı proteomikler dahil olmak üzere peptitlerin analizi dışında başka amaçlar için kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, kütle spektrometresi tabanlı proteomik kullanarak histon translasyon sonrası modifikasyonun nasıl tanımlanacağını ve ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız.