İnsan Nöral Kök Hücreler Sayma
22 Ağustos 2007
Canlı hücreler tam sayısının Bilgi, birçok doku kültürü manipülasyonlar için gereklidir. Bu protokol, canlı ve ölü hücreleri arasındaki ayrım ve hemasitometre kullanarak hücrelerin miktarını nasıl açıklamaktadır. Insan sinir kök / prekürsör hücrelerinin (hNSPCs) sayma açıklar olsa da, diğer hücre türleri için kullanılabilir.
Şimdi size insan nöro öncül hücrelerinin nasıl sayılacağını göstereceğim; hücrelerinizi immünokimya işlemi yapacağınızda veya nükleer faktör makinesi ile bir transfeksiyon gerçekleştirmek istediğinizde saymanız gerekir. Kenar ızgaralı bir faz kontrastlı hemositometre ve ayrıca trypan mavi adı verilen bir boya kullanıyorum. Bu boya, canlı ve ölü hücreleri birbirinden ayırabilmesi bakımından faydalıdır.
Ölü veya ölmekte olan hücreler bu boyayı alır ve mavi görünürler. Hemositometrede hücrelere baktığınızda, canlı hücreler bu boyayı dışarıda tutabilir ve mavi görünmezler. Böylece hücrelerinizin canlılığını belirleyebilirsiniz; bunun için trypan blue ve besiyeri içeren bir çözelti hazırlayın.
Bu 0,5 ml'lik epi tüpe 20 µL tuzak ve mavi çözelti ekleyeceğim. Ardından 25 µL medya ekleyeceğim. Böylece şu anda toplam 45 µL tuzak pan mavisi ve medya çözeltisine sahibim; böylece beş µL hücre süspansiyonu eklediğimde 1:10 oranında bir dilüsyon elde etmiş olacağım.
Şimdi beş mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyeceğim. Öncelikle, parmakla vorteksleyerek hücrelerin iyice yeniden süspanse edildiğinden emin olacağım. Böylece bu solüsyonun iyi karıştığından emin olmak istiyorum.
Bu nedenle, tablaya birkaç kez yukarı ve aşağı hareket yaptıracağım. Ve son olarak, bu hücre süspansiyonundan yaklaşık 12 µL'yi bir hemositometreye yükleyeceğim. Cihazın iki portu vardır ve bunlardan herhangi birini kullanabilirsiniz.
Tek yapmanız gereken çözeltiyi bu porttan tanıtmak; sıvı, kılcal hareketle yukarı çekilecektir. Ve şimdi sayıma hazırım. İşte 10x büyütmede hemositometre görünümü ve burada 16 kare içeren bir kadranımız var.
Ve gördüğünüz gibi, burada canlı ve ölü hücreleri gözlemleyebiliriz. Burada şunun, şunun ve şunun gibi canlı hücrelerimiz var. Ayrıca şunun gibi bazı ölü hücrelerimiz de mevcut.
Fark edeceğiniz üzere, ölü hücre koyu mavi görünürken, canlı hücrelerin etrafında bir tür hale bulunmaktadır. Şimdi tüm canlı hücreleri sayacağım. Bu nedenle soldan sağa ve yukarıdan aşağıya doğru ilerleyeceğim.
1, 2, 3, 4, 5, 6, 33, 1 32, 33, 34, 3 5, 3 6. Böylece bu kadranda toplam otuz altı hücremiz var. Bu nedenle, tam buradaki çizgi boyunca olduğu gibi, kadranın sınırında olan hücreler gördüğümde, tutarlı olmak adına, sol sınırda ve üst sınırda yer alan hücreleri sayıyorum.
Hemositometredeki tüm kadranlar için bu sınırlardaki hücreleri istikrarlı bir şekilde sayıyorum. Şimdi, mikrolitre başına kaç hücremiz olduğunu hesaplayacağız. Bunu yapmak için, kadran başına hücre sayısının ortalamasını, yani 38'i alacağım ve bunu, odacık boyutları tarafından belirlenen bir faktör olan 10 ile çarpacağım.
Ve bu durumda seyreltme faktörümüz olan 10 ile de çarpacağız. Sonuçta, mikrolitre başına hücre sayısını elde etmiş olacağız. Dolayısıyla bu örnekte, mikrolitre başına 3.800 hücremiz var.
Hücre peletimizi 500 µL çözeltide resüspande ettiğimiz için, toplamda kaç hücreniz olduğunu hesaplayabilirsiniz. Hazırlıklarımızı tamamladık.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, bir hemositometre kullanarak insan nöral kök/prekürsör hücrelerinin (hNSPCs) sayılmasına yönelik bir yöntemi özetlemektedir. Çeşitli doku kültürü uygulamaları için canlı ve ölü hücrelerin ayırt edilmesinin önemini vurgulamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Doku Kültürü
Arka Plan
- Canlı hücre sayısı, doku kültürü manipülasyonları için kritik öneme sahiptir.
- Canlı hücreler belirli boyaları dışlarken, ölü hücreler dışlayamaz.
- Hemositometre, hücre sayımı için standart bir araçtır.
- Hücre canlılığını değerlendirmek için yaygın olarak Tripan mavisi boyası kullanılır.
Çalışmanın Amacı
- hNSPC'lerin sayımı için güvenilir bir yöntem sağlamak.
- Canlı ve ölü hücreleri etkili bir şekilde ayırt etmek.
- Araştırmacıların immünokimya veya transfeksiyon gibi ileri deneylere hazırlanmalarına yardımcı olmak.
Kullanılan Yöntemler
- Faz kontrastlı bir hemositometre kullanımı.
- Hücre canlılığını ayırt etmek için Tripan mavisi boya uygulanması.
- Mikroskop altında hücre sayımı.
- Tripan mavisi ve besiyeri çözeltisinin hazırlanması.
Ana Sonuçlar
- Canlı ve ölü hücreler arasında başarılı ayrım yapılması.
- hNSPC'lerin doğru şekilde kantifikasyonu.
- Trypan mavisi boyasının etkinliğinin gösterilmesi.
- Hemositometrenin güvenilir bir sayım yöntemi olarak doğrulanması.
Sonuçlar
- Protokol, hücre sayımı için basit bir yaklaşım sunmaktadır.
- hNSPC'lerin ötesinde çeşitli hücre tipleri için uygulanabilir.
- Hücre canlılığının anlaşılması, başarılı doku kültürü deneyleri için esastır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Uygunluk
Canlı insan nöral kök/öncül hücrelerin (hNSPCs) doğru şekilde miktarının belirlenmesi, nörobilim ilaç keşfi süreçlerindeki tekrarlanabilir doku kültürü iş akışları için temel teşkil eder. Bu protokol, güvenilir hücre canlılığı değerlendirmesi ve konsantrasyon ölçümü sağlayarak, immünositokimya ve transfeksiyon gibi sonraki uygulamalar için tutarlı deneysel ekimi destekler. Trypan blue ve hemositometre tabanlı sayım kullanarak canlı/ölü ayrımını standart hale getiren bu yöntem, erken aşama hedef doğrulama ve analiz geliştirme süreçlerindeki öngörü güvenilirliğini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Hedef etkileşimi ve yolak modülasyon çalışmaları için hNSPC'lerin hassas bir şekilde ekilmesine olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Canlı hücrelerin tutarlı girişini sağlayarak hücre tabanlı analizlerdeki değişkenliği azaltır.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Analiz standardizasyonu için kritik olan kantitatif, tekrarlanabilir hücre konsantrasyonu verileri sağlar.
- Operasyonel Değer: Yüksek içerikli tarama formatları için hücre süspansiyonlarının ölçeklenebilir hazırlığını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Keşiften preklinik geçiş aşamaları boyunca hücresel girdi tutarlılığını korur.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış hücre sayım uygulamaları aracılığıyla fonksiyonlar arası iş birliğini kolaylaştırır.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef doğrulamadan assay optimizasyonuna ve preklinik etkinlik testlerine kadar güvenilir hücre hazırlığını destekleyerek, erken keşif sürecinin bir parçası olarak yer alır.
- Keşif Biyolojisi: hNSPC'leri içeren hedef doğrulama deneyleri için doğru hücre dozlamasını sağlar.
- Tarama: Tekrarlanabilir analiz performansı için gerekli olan standartlaştırılmış, ölçülebilir hücre girişleri sunar.
- Analitik: Deneysel koşulları normalize etmek için kullanılan canlı hücre konsantrasyonu ve toplam sayı çıktıları üretir.
- Translasyonel Araştırma: In vitro keşif ile preklinik modeller arasındaki hücre işleme süreçlerinde sürekliliği destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla hücre tipi ve proje genelinde uygulanabilen, aktarılabilir ve düşük karmaşıklığa sahip bir yetkinliği temsil eder.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hücre tabanlı deneysel girdilerdeki değişkenliği minimize ederek öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Laboratuvarlar ve ekipler arasında tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu geliştirir.
- Stratejik Değer: Güvenilir analiz temelleri aracılığıyla daha iyi devam/durdur kararlarını destekler.
- Portföy Etkisi: Erken etkinlik taramasında veri kalitesini sağlayarak riske göre ayarlanmış ilerlemeye olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Temel doku kültürü tekniği ve mikroskopi yetkinliği gerektirir.
- Hemositometre mevcudiyetine ve kontaminasyonu önlemek için uygun temizliğe bağlıdır.
- Tarafsız kuadrant seçimi ve sınır sayım kuralları için tutarlı operatör eğitimi gereklidir.
- Manuel sayım kapasitesiyle sınırlıdır; adaptasyon olmadan yüksek kapasiteli otomasyon için uygun değildir.
- Hücre süspansiyonunun temsili örneklemesini sağlamak için doğru dilüsyon ve karıştırmaya dayanır.
