İnsan Nöral Kök Hücreler Sayma
August 22nd, 2007
Canlı hücreler tam sayısının Bilgi, birçok doku kültürü manipülasyonlar için gereklidir. Bu protokol, canlı ve ölü hücreleri arasındaki ayrım ve hemasitometre kullanarak hücrelerin miktarını nasıl açıklamaktadır. Insan sinir kök / prekürsör hücrelerinin (hNSPCs) sayma açıklar olsa da, diğer hücre türleri için kullanılabilir.
Şimdi size insan nöro öncü hücrelerini nasıl sayacağınızı göstereceğim ve hücrelerinizi immünokimya için koymak istediğinizde veya nükleer faktör makinesi ile bir transfeksiyon yapmak istediğinizde sayabilirsiniz. Kenar ızgarası olan bir faz kontrastlı hemo sitometre kullanıyorum ve ayrıca trip ve blue adlı bir boya kullanıyoruz. Ve boya, canlı ve ölü hücreler arasında ayrım yapabilmesi açısından faydalıdır.
Ölü veya ölmekte olan hücreler bu boyayı alır ve mavi görünürler. Hemo, sitometre ve canlı hücrelerdeki hücrelere baktığınızda bu boyayı dışlayabiliyorlar ve onlar, onlar, mavi görünmüyorlar. Böylece, hücrelerinizin canlılığını belirleyerek bir trip ve mavi ve medya çözeltisi hazırlayabilirsiniz.
Bu 0.5 mil epi tüpüne 20 mikrolitre tuzak ve mavi solüsyon ekleyeceğim. Ve sonra 25 mikrolitre besiyeri ekleyeceğim. Bu şekilde şu anda 45 mikrolitre tuzak tavası mavisi ve medya solüsyonum var, böylece beş mikrolitre hücre süspansiyonu eklediğimde, bir ila 10 seyreltme elde edeceğim.
Ve şimdi, beş mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyeceğim. İlk olarak, hücrelerin parmak girdabı ile iyi bir şekilde yeniden süspanse edildiğinden emin olacağım. Bu yüzden şimdi bu çözeltinin iyi karıştırıldığından emin olmak istiyorum.
Bu yüzden yatağımı birkaç kez yukarı ve aşağı koyacağım. Ve son olarak, bu hücre süspansiyonundan yaklaşık 12 mikrolitre kadarını bir hemo sitometreye yükleyeceğim. Var, iki bağlantı noktası var ve ikisini de kullanabilirsiniz.
Yani tek yapmanız gereken çözeltiyi bu porta sokmak ve sıvı bir kılcal hareket ile emilecek. Ve şimdi saymaya hazırım. İşte 10 x'teki hemo sitometreye bir bakış ve burada 16 kare içeren bir kadranımız var.
Ve gördüğünüz gibi, burada canlı ve ölü hücreleri gözlemleyebiliriz. Burada şu, bu ve bu gibi canlı hücrelerimiz var. Ve bunun gibi bazı ölü hücrelerimiz de var.
Dikkat ederseniz, ölü hücre koyu mavi görünür, oysa canlı hücrelerin etrafında bir tür dolu vardır. Şimdi tüm canlı hücreleri sayacağım. Bu yüzden soldan sağa ve yukarıdan aşağıya gideceğim.
1, 2, 3, 4, 5, 6, 33, 1 32, 33, 34, 3 5, 3 6. Yani bu kadranda toplam üç altı hücremiz var. Bu yüzden, kadranın sınırında olan hücreleri gördüğümde, örneğin buradaki çizgi boyunca, tutarlı olmak için, sol kenarda ve üst sınırda olan hücreleri sayıyorum.
Ve sürekli olarak bu sınırlardaki hücreleri hemositometredeki tüm kadranlar için sayıyorum. Şimdi mikrolitre başına kaç hücremiz olduğunu hesaplayacağız. Ve bunu yapmak için, çeyrek başına düşen hücrelerin ortalamasını alacağım, bu 38'dir ve 10 ile çarpacağım, bu odanın boyutları tarafından belirlenen bir faktördür.
Ve ayrıca 10 ile çarpacağız, bu durumda seyreltme faktörümüz budur. Ve sonunda, mikrolitre başına düşen hücre sayısını elde edeceğiz. Yani bu durumda mikrolitre başına 3.800 hücremiz var.
Ve hücre paletimizi 500 mikrolitre çözelti içinde askıya aldığımız için, toplam kaç hücreniz olduğunu hesaplayabilirsiniz. Ve artık hazırız.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, bir hema sitometre kullanarak insan nöral kök/öncü hücrelerini (hNSPC'ler) sayma yöntemini özetlemektedir. Çeşitli doku kültürü uygulamaları için canlı ve ölü hücreler arasında ayrım yapmanın önemini vurgulamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Doku Kültürü
Arka Plan
- Canlı hücre sayımı, doku kültürü manipülasyonları için kritik öneme sahiptir.
- Canlı hücreler belirli boyaları dışarıda tutabilir, ölü hücreler yakalayamaz.
- Hema sitometre, hücre sayımı için standart bir araçtır.
- Trippan mavisi boya, hücre canlılığının değerlendirilmesinde yaygın olarak kullanılır.
Çalışmanın Amacı
- hNSPC'leri saymak için güvenilir bir yöntem sağlamak.
- Canlı ve ölü hücreleri etkili bir şekilde ayırt etmek.
- Araştırmacıların immünokimya veya transfeksiyon gibi ileri deneylere hazırlanmasına yardımcı olmak.
Kullanılan Yöntemler
- Bir faz kontrast hema sitometre kullanımı.
- Hücre canlılığının ayırt edilmesi için Trippan mavisi boyası uygulaması.
- Mikroskop altında hücre sayımı.
- Trippan mavisi ve medya çözeltisinin hazırlanması.
Ana Sonuçlar
- Canlı ve ölü hücreler arasında başarılı ayrım.
- hNSPC'lerin doğru nicelendirilmesi.
- Trippan mavisi boyasının etkinliğinin gösterilmesi.
- Hema sitometrenin güvenilir bir sayım yöntemi olarak doğrulanması.
Sonuçlar
- Protokol, hücre sayımına doğrudan bir yaklaşım sağlar.
- hNSPC'lerin ötesinde çeşitli hücre tipleri için geçerlidir.
- Hücre canlılığının anlaşılması, başarılı doku kültürü deneyleri için esastır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of viable human neural stem/precursor cells (hNSPCs) is essential for reproducible tissue culture workflows in neuroscience drug discovery. This protocol enables reliable cell viability assessment and concentration measurement, supporting consistent experimental seeding for downstream applications such as immunocytochemistry and transfection. By standardizing live/dead discrimination using Trypan blue and hemacytometer-based counting, the method enhances predictive confidence in early-stage target validation and assay development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise seeding of hNSPCs for target engagement and pathway modulation studies.
- Operational Value: Reduces variability in cell-based assays by ensuring consistent input of viable cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides quantitative, reproducible cell concentration data critical for assay standardization.
- Operational Value: Supports scalable preparation of cell suspensions for high-content screening formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains cellular input consistency across discovery-to-preclinical transition stages.
- Operational Value: Facilitates cross-functional collaboration through standardized cell counting practices.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the early discovery continuum, supporting reliable cell preparation from target validation through assay optimization and preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Ensures accurate cell dosing for target validation experiments involving hNSPCs.
- Screening: Delivers standardized, quantifiable cell inputs necessary for reproducible assay performance.
- Analytics: Generates viable cell concentration and total count outputs used to normalize experimental conditions.
- Translational Research: Supports continuity in cell handling between in vitro discovery and preclinical models.
- Enterprise Reuse: Represents a transferable, low-complexity capability applicable across multiple cell types and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence by minimizing variability in cell-based experimental inputs.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across laboratories and teams.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions through reliable assay foundations.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by ensuring data quality in early efficacy screening.
Implementation Considerations
- Requires basic tissue culture technique and microscopy proficiency.
- Dependent on hemacytometer availability and proper cleaning to avoid contamination.
- Necessitates consistent operator training for unbiased quadrant selection and border-counting rules.
- Limited by manual counting throughput; not suited for high-throughput automation without adaptation.
- Relies on correct dilution and mixing to ensure representative sampling of cell suspension.
