İnsan Nöral Kök Hücreler Pasajlanması

Merhaba, ben Steve. UC, Irvine'deki Patoloji Bölümü'nde Dr. Flanagan'ın laboratuvarında çalışıyorum. Bugün size insan nöral öncü hücrelerini nasıl parçalayacağınızı göstereceğim.

Bu teknik, bir insan fibronektin çözeltisi ile yeni bir şişenin kodlanmasını, hücrelerin hücre ayrışma tamponu ile kaldırılmasını, daha sonra hücre ayrışma tamponunun %10'luk bir serum çözeltisi ile nötralize edilmesini, hücre süspansiyonunun santrifüjlenmesini ve hücrelerin taze, orta derecede yeniden askıya alınmasını ve hücre süspansiyonunun yeni bir şişeye aktarılmasını içerir. Laboratuvarımızda, insan nöral öncü hücrelerini, ortamlarının yarısını her gün değiştirerek kültürlüyoruz ve haftada bir kez bir ila ikiye bölerek geçiriyoruz. Hücreleri geçirdiğimde, onları bir immünokimya deneyi için takas etmek istersem veya bir nükleer efektör ile bir transfeksiyon yapmak istersem sayabilirim.

Hücreleri paketlerken bir hücre ayrışma tamponu kullanmak önemlidir, çünkü ilk olarak, tripsin'den farklı olarak enzimatik değildir ve hücrelere karşı çok daha naziktir. Merhaba, şimdi doku kültürü odasındayız ve size insan öncü hücrelerinin birleşik bir şişesinin neye benzediğini göstermeden önce, önce doku kültürünü hazırlayacağım. İlk olarak, UV ışığını kapatacağım ve ışığı ve hava akışını açacağım.

Ardından, bir kağıt havlu püskürterek ve kaputu silerek davlumbazı %70 etanol ile dezenfekte edeceğim. Bir kağıt havluya doğrudan davlumbazın içine değil, %70 etanol püskürtmek önemlidir, çünkü davlumbaza %70 etanol püskürtmek HEPA filtresine zarar verebilir ve bu gerçekten pahalıdır. Sonra, tüm reaktifleri ve aletleri püskürteceğim.

Ve son olarak, vakum hortumlarını püskürteceğim ve her şey hazır. Bu hücrelere bir göz atalım. Yani bu hücreler yaklaşık% 80 birleşik görünüyor.

Bunlar, insan fetüslerinden izole edilen insan nöral öncü hücreleridir ve onları T 25 şişelerinde büyütüyoruz. Onları her hafta, bir ila iki kez ayırıyoruz. Artık hücrelerimi geçmeye hazırım.

Ve ilk olarak, dört saat boyunca BD Biosciences'tan insan fibronektiniyle kapladığım yeni bir T 25 şişesi getireceğim. Bu yüzden fibronektin solüsyonunu çıkardım. Hücreleri şişeye taşımadan önce bu şişeyi BBS ile durulayacağım.

Ve şimdi hücreleri 37 derecelik inkübatörden çıkaracağım. İşte oradalar. Şimdi PBS yıkama solüsyonunu insan fibronektiniyle kaplanmış yeni şişeden çıkaracağım.

Ve yeni şişeye iki mililitre eski şartlandırılmış ortam ekleyeceğim. Bu yüzden şimdi onu yüzeyden çıkarmadan önce hücrelerimi PBS ile durulamam gerekiyor. Bu yüzden önce, kalan ortamı çıkaracağım, hücreleri ıslatmadan hemen yaklaşık iki mil PBS ekleyeceğim.

Satışları pul pulun yüzeyinden çıkarmak için PBS'yi çıkarmadan ve satışa ayrışma tamponu koymadan önce yaklaşık iki dakika bekleyeceğim. Şimdi PBS'yi kaldıracağım ve tekrar, hücrelerin kurumaması için hemen hücre ayrışma tamponu eklemeye çalışacağım. Bu yüzden 1.5 mil hücre ayrışma tamponu ekleyeceğim.

Ve PBS'den farklı olarak, bunu doğrudan hücrelere ekleyeceğim ve mümkün olduğunca çok yüzeyi kaplamaya çalışacağım. Bu yüzden bu tamponu hücrelere yavaşça eklerken şişeyi bir yandan diğer yana hareket ettiriyorum. Ve şimdi hücrelerin yüzeye çıkmaya başlaması için yaklaşık beş dakika bekleyeceğim.

Ve matarayı oda sıcaklığında davlumbazda bırakacağım. Burada gördüğünüz gibi, hücreler önce toplanmaya başlar ve sonra yüzeyden çıkmaya başlarlar ve aslında bazılarını, bazı hücrelerin zaten yüzdüğünü görebilirsiniz. Ve şişeyi yan tarafına geniş bir şekilde dokunursanız, bu onların çıkmasına yardımcı olacaktır.

Beş dakika oldu ve gördüğünüz gibi, çözelti yüzeyden çıkan hücrelerle gerçekten yoğun hale geldi. Ve şimdi 4.5 mil serum içeren ortam ekleyerek hücre ayrışma tamponunun etkisini nötralize edeceğim. Bu yüzden D-M-E-M-F 12 ortamında% 10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu kullanacağım ve bağlı hücre kalmadığından emin olmak için doğrudan şişenin yüzeyine ekleyeceğim.

Ve bunu yapacağım ve kalan hücreleri çıkarmak için nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyeceğim. Ve sonra hücre çözeltisini 15 millik konik bir tüpe aktaracağım. Ve onu bir dakika boyunca bin RPM'de döndüreceğim.

Böylece hücreler dönmeye başladı ve burada güzel bir hücre paletimiz var. Paleti rahatsız etmeye çalışmadan serum ortamını çok ama çok dikkatli bir şekilde çıkaracağım. Ve sonra paleti medyanın dört milinde yeniden askıya alacağım.

Bu yüzden peleti yeniden süspanse etmeye çalışacağım, böylece hücre kümeleri kalmaz, kalır, böylece çözelti homojen hale gelir ve topak içermez, içermez. Ve bire iki bölme yaptığım için, dört değirmenden ikisini alacağım ve bunları zaten iki mil kondisyon ortamı içeren yeni şişeye aktaracağım. Ve son olarak, şişeyi hücre tipi, geçiş numarası ve tarih ile etiketleyeceğim.

Bu, yarım saat önce geçtiğimiz hücrelere bir bakış. Ve gördüğünüz gibi, onlar, çoğu, yüzeye yapışmış durumdalar ve süreçleri göndermeye başlamışlar. Hepsi bu kadar millet.

Ve şimdi saymaya hazırım.