Hücre hücre Etkileşim kurgulama için Silikon mikroçipler

Merhaba, ben Elliot Hu.Massachusetts Institute of Technology'de Tia'nın laboratuvarında doktora sonrası araştırmacıyım. Bugün silikon mikro mekanik çipler üzerinde hücre kültürleri hazırlayacağız. Cihazlar, birbirine kilitlenen küçük taraklara benziyor ve iki farklı hücre popülasyonu arasındaki etkileşimleri hassas bir şekilde manipüle etmemize izin veriyor.

Bugün karaciğer hepatositleri ve destekleyici stromal hücreler arasındaki etkileşimi inceleyeceğiz. Spesifik olarak, tarakların üst yüzeyinde üç T üç fibroblast hücresi kültürlenir, böylece tarak parmaklarını kaydırarak hücreleri hareket ettirebilir ve mekansal düzenlemelerini değiştirebilirsiniz. Her cihaz, iki olası konfigürasyonda bir araya gelen iki parçaya bölünmüştür.

Birincisi, iki hücre popülasyonunu birbiriyle temas ettirir. İkincisi, iki popülasyonu hafifçe ayırır, böylece hücreler dokunamaz. Burada, temas etkileşimleri önlenir, ancak salgılanan Faktörler aracılığıyla etkileşimler korunur.

Parçaların cımbızla nasıl ele alınacağı hakkında konuşarak başlayalım. Hem daha büyük Teflon cımbız hem de daha küçük yuvarlak uçlu metal cımbız kullanmayı seviyorum. Daha büyük cımbızlarla kenarlardaki parçaları bu şekilde tutabilirsiniz, daha büyük parçaları kollarla alabilirsiniz, kolları kırmamaya dikkat etmelisiniz çünkü çok kırılgandırlar.

Yani onları bu şekilde parçanın arkasından almak istiyorsunuz. Metal cımbız ile deliğe ulaşabilir ve talaşları doğrudan alabilirsiniz. Daha büyük parçalar 12 oyuklu bir plakanın duvarına sığarken, daha küçük parçalar 24 oyuklu bir plakaya sığar veya daha büyük parça ile eşleştirilebilir.

12 oyuklu bir plakada genellikle metal cımbız kullanırım. İki parçayı birbirine koparmak için plakalardaki parçaları tuttuğumda, genellikle önce büyük parçayı kuyuya koyarım ve bir tarafa kadar iterim. Sonra ücretsiz tamiri alıp kuyunun diğer tarafına koyuyorum ve her deliğe bir tane olmak üzere iki cımbız alarak onları birbirine ittim.

Artık parçaları boşluk konfigürasyonunda veya kontak konfigürasyonunda birbirine kilitleyebilirim. Parçaları ayırmak istersem, parçaları boşluk konfigürasyonuna çekmeyi ve ardından parçayı çıkarmak için dikey olarak yukarı çekmeyi severim. Artık cihazlar silikondan yapılmıştır, bu nedenle uygun hücre yapışmasını sağlamak için kaplanmaları gerekir.

Muhtemelen zaten polistiren ile kaplanmış ve plazma ile işlenmiş cihazları alacaksınız, bu yüzden bunun başlangıç noktamız olduğunu varsayacağız. Her şeyden önce, hepatositlerin yapışacağı yüzeyi kaplamak için kollajen kullanacağız. Hepatosit taraklarını değirmen başına 50 mikrogramlık bir kolajene, bir çözeltiye koyacağız ve 37 ° C'de 45 dakika inkübe edeceğiz.

Fibroblast tarakları ise kaplamamıza gerek yoktur. İnkübasyondan sonra, kollajen solüsyonunu aspire ediyoruz ve yıkayıp sularız. Şimdi, hücre tohumlaması için düz bir yüzey oluşturmak için ES'yi tamamlayıcı parçalarla temas halinde birbirine kilitleyeceğiz.

İlk olarak, bazı kuyuları %70 etanol ile dolduracağız. Her kuyuya bir çift koyacağım ve sonra onları birbirine kilitleyeceğim. Birbirine kilitlendikten sonra, eş düzlemli olduğundan emin olmak için mikroskop altında parçalara bakmak istiyoruz.

Arada bir, parçalar yanlış hizalanmış olarak birbirine kilitlenebilir. Ve mikroskopta iki farklı odak düzleminde olduklarını göreceksiniz. Bu durumda, parçaları ayırın ve tekrar bir araya getirin Hizalamanın iyi olduğunu kontrol ettikten sonra, parçaları sterilize etmek için bir süre etanolde bekletiyoruz.

Genellikle acelem var, bu yüzden sadece 10 dakika ıslanıyorum. Sterilizasyondan sonra durulamamız gerekiyor. Etanol iyice aspire edilir ve suda yıkanır, daha sonra aspire edilir ve tekrar suda yıkanır ve son olarak suyu aspire edin ve kültür ortamınızla değiştirin.

Şimdi Hücreleri Cihazlara Tohumlayalım. Tipik olarak, hücreleri mililitre başına 500.000 hücre konsantrasyonunda askıya alırız ve 12 oyuklu bir plaka kullanarak her tarak çiftinin üzerine bir mililitre süspansiyon pipetleriz. Bu yüzden fibroblastları mililitrede 500.000 hücrede iki kuyucuğa ektik.

Benzer şekilde, kuyu başına 500.000 hepatositlik bir süspansiyon aldık ve bunları diğer iki kuyuya tohumladık. Şimdi, kuluçkaya yatırmadan önce, eşit olarak dağıldıklarından emin olmak için hücreleri iyice çalkalayacağız. Ve üç kez dikey, üç kez yatay olarak sallamayı ve sonra bunu üç kez tekrarlamayı seviyorum.

Çalkaladıktan sonra, onu inkübatöre yerleştireceğiz ve hücreleri 15 dakika bekleteceğiz, bu noktada onları tekrar sallayacağız. Bir saat boyunca her 15 dakikada bir salladıktan sonra, hücre süspansiyonunu aspire edeceğiz ve yeni bir hücre süspansiyonu üzerinde oynayacağız. Ve bunu, birleşen bir hücre tabakası elde edene kadar tekrarlayacağız.

Tipik olarak fibroblastlarda, bir veya iki oturma yeri alır. Ve hepatositlerle iki ila dört oturma yeri alabilir. Birleşen bir tek tabaka elde etmek için, hücreler oldukça yüksek bir yoğunlukta oturtulur, sallanır, hücrelerin eşit şekilde dağılmasını sağlar.

İlk oturmadan sonra seyrek bir hücre tabakası oluşur. Hücrelerin yalnızca polistiren ve kollajen ile kaplanmış parmaklara yapıştığına dikkat edin. Taze hücreler tohumlandıktan ve bir saat daha inkübe edildikten sonra, yine her 15 dakikada bir çalkalanarak, hücre tabakası yoğunlaşır.

Üçüncü tohumlamadan sonra, iyi bir hücre yoğunluğuna sahibiz ve şimdi hücreler peteklere ekildikten sonra durabiliriz. Hücreleri istenen deneysel konfigürasyona manipüle etmek istiyoruz. Cihazlar artık tamamlayıcı parçalarından ayrılıyor ve 24 saat boyunca inkübe ediliyor.

24 saat sonra, hücreler tarakların yüzeyi üzerinde birleşik bir tek tabaka oluşturacak şekilde yayılır. Şimdi bir ortak kültür oluşturmak istiyoruz. Hepatosit tarağı ve fibroblast tarağı şimdi aynı kuyuya aktarılır ve istenen başlangıç konfigürasyonuna birlikte kilitlenir.

İstenirse. Belirli bir süre sonra yapılandırmayı değiştirebilirsiniz. Örneğin, 18 saat sonra boşluk konfigürasyonuna geçebiliriz, parçalar aynı şekilde yerleştirilir, boşluk konfigürasyonuna ulaşılana kadar iyi bir şekilde birlikte itilir ve daha sonra boşluk konfigürasyonuna tekrar temas etmeye itilir.

Ve şimdi bir tarağı çıkaracağız. Şimdi yapacağımız şey, eski polistiren kaplamayı sıyırma, talaşları temizleme ve ardından yeni bir polistiren kaplama koyup hücre kültürü için hazırlama sürecinden geçmek. Yine, eski polistiren kaplamayı sıyırarak ve yeni bir kat giyerek, önceki deneyin geçmişinin hiçbirinin yeni bir deneye müdahale etmemesini sağlıyoruz.

Bu nedenle, deneyinizi tamamladıktan sonra, yapmak istediğiniz ilk şey hücrelerinizi ağartmak ve ardından taraklarınızı ve suyunuzu durulamaktır. Bu nedenle, cipsleri ayak parmağına koymadan önce, tamamen kuru olduklarından emin olmak istersiniz. İşte burada, bir süreliğine havada kurumaya bıraktığım ve tamamen kuru olup olmadığını kontrol ettiğim birkaç tarağımız var.

Ve şimdi biraz ayak parmağı alacağız ve bu cam hoparlöre koyacağız. Burada bir cam pipet kullanacağız ki onu çözmeyelim. Cadılar Bayramı plastiği çözer, bu nedenle tipik bir polistiren pipet kullanamayız.

Tamam, bu kadar yeter. Ve şimdi bu parçalardan birkaç tane alacağız, onları ayak parmağının içine yerleştireceğiz ve çalkalayıcıyı çalkalamak için açacağım ve toluenin buharlaşmasını önlemek için üzerini alüminyum folyo ile kaplayacağız. Yani iki saat sonra, toluen peteklerdeki polistirenin çoğunu çözmüş olmalı ve onları dışarı çekip petekleri havayla kurutabiliriz.

Cadılar Bayramı durulamasından sonra, parçalar nispeten polistiren içermemeli ve nispeten temiz olmalıdır. Bununla birlikte, parçaların son derece temiz olmasına ihtiyacımız var, böylece yeni polistiren tabakası aşırı derecede temiz olmasalar bile iyi bir yapışma oluşturacaktır. Politik, hücreler onu çekmeye başladığında deneyin ortasında soyulma eğilimindedir.

Şimdi yapacağımız şey temiz bir piranha asidi. Parçaları bir cam hoparlöre koydum ve bunu ısıtacağız. Bu yüzden sıcak bir tabak koyacağız.

Ve burada sülfürik asit ve hidrojen peroksit var. Önce sülfürik asidi dökeceğim ve burada tüm talaşların sıvının altına daldırıldığından emin olacağım. Bazen yüzmeye meyillidirler.

Ayrıca artık oldukça aşındırıcı kimyasallarla çalıştığımıza göre, doğru koruyucu giysileri giydiğinizden emin olun. Burada. Nitril eldiven giyiyorum. Şimdi hidrojen peroksiti asidin içine dökeceğiz ve burada sadece dikkat edeceğiz çünkü bu ekzotermik bir reaksiyon.

Tepki verirken biraz sigara içtiğini görebilirsiniz, ancak sistemi daha da reaktif hale getirmek için sisteme biraz enerji eklemek istiyoruz. Şimdi onu 120 santigrat dereceye kadar ısıtacağız, şimdi yaklaşık 20 derecede, böylece hücre kültürünüzün kalıntılarının çiplerinizden tamamen temizleneceğinden emin olabilirsiniz. Yani bu noktada, hidrojen peroksitin tamamı tüketilene kadar reaksiyonun tam seyrini sürdürmesine izin vermek istersiniz.

Ve bu noktada, karışım köpürmeyi bırakacak. Bu yüzden reaksiyonun seyrini sürdürmesi yaklaşık yarım saat sürer. Ve baloncukları görmeyi bıraktıktan sonra, sıcak plakayı kapatabilir ve soğumaya bırakabilirsiniz.

Ve onları bir BAK eğrisi suyuna aktaracağız. Ve bir kez daha, burada metal değil, Teflon cımbız kullandığınızdan emin olun ve onları alıp aktarabilirsiniz. Bu yüzden şimdi onu sabit bir DDH akışı altında durulayacağız, iki O. Genellikle doğrudan Meine'den alırım ve burada en az 10 dakika çalışır durumda bırakırız.

Ve bunu yaparak, 10 dakika boyunca bir su akışı altında kıydıktan sonra tüm asit izlerini yıkayacağız. Asit cipslerden yeniden çıkarılmalı ve Sigma'dan aldığımız polistiren 45.000 Molekül ağırlıklı polistireni kaplamaya hazır olana kadar onları su altında saklayacağız. Ve burada küçük bir miktarını tartacağız.

Elimizde 400 miligram var ve bunu toluende mililitre başına 100 miligram olarak çözeceğiz. Bu yüzden toluenin başlıkta ele alınması gerekir. Ve diğer bir şey de, polistireni çözmek için bir toluen kullanacağımız için, polistirenden yapılmış herhangi bir laboratuvar giysisi kullanmadığımızdan emin olmak istiyoruz.

Yani burada polipropilen, konik ve cam pipet kullanıyoruz. Yani 400 miligram polistirenim olduğuna göre, dört mililitre toing koyacağım, Ve şimdi poli stirin çözülene kadar yarım saat boyunca girdap yapacağız. Şimdi tüpü en düşük hızda yaklaşık 20 dakika ila yarım saat arasında girdap haline getireceğiz.

Bu yüzden tüpü girdaplara bağlayacağım. Onu her zaman orada tutmak zorunda değilim. 20 ila 30 dakika sonra polistiren çözülmelidir ve onu kaplamaya hazırız.

Şimdi polistireni tesisimizde eğirme işlemi ile kaplayacağız. Spin kodlayıcımız temiz oda tesisindedir. Ve burada bir şapka, gözlük, önlük, patik ve eldiven takmamız gerekiyor, ancak bu sizin tesisinizde aynı olmayabilir.

Bu aynayı kullanmadan önce, onu polistirenden korumak istiyorum. Bu yüzden onu alüminyum folyo ile kaplayacağız ve bunu yüzeye mümkün olduğunca düz bir şekilde oturtmak istiyoruz, böylece çip yüzeye aynı hizada oturabilir. Çip üzerinde bir vakum tutabilmemiz için tam ortasına küçük bir delik açacağız.

Döndürme kodlayıcı 2.400 RPM ve 30 saniye olarak ayarlanmıştır. Şimdi çiplerimizden birini alabiliriz, çipin merkezi deliği kapatacak şekilde yerleştirebiliriz ve polistireni taktığımda ilk başta vakumu kapatacağım, vakumu açacağım ve sonra döndürmeye başlayacağım. Yani daha küçük parçalar için 10 damladan daha azını koyabiliriz.

Ve daha büyük parçalar için 10 damladan biraz fazla polistiren gerekir. Ve onu 2.400 RPM'de 30 saniye boyunca döndüreceğiz. Şimdi poli stiren kaplı cipsleri alıp 120 derece C'de fırına koyacağız.

Bu yüzden yüzeyi biraz yumuşatmak için yeniden akıtacak ve aynı zamanda plastiği yoğunlaştıracak ve sertleştirecek. Bu yüzden genellikle bir gece fırında bırakırım. İşlemin tamamlanması muhtemelen en az birkaç saat sürer.

Böylece bir gece pişirildikten sonra cipsler plazma işlemine hazırdır. Şimdi polistireni bir oksijen plazmasına maruz bırakacağız ve bu yüzey enerjisini değiştirecek, böylece proteinler ve hücreler ona daha iyi yapışacak. Bu yüzden çipleri plazma haznesine yükleyeceğiz ve bir vakuma pompalayacağız.

Kullanmak için iyi bir ayar, oksijen gazı akışı altında bir dakika boyunca 200 mil, vakum turu ve 200 watt güçtür. Şimdi sistem pompalandığına göre, oksijeni tanıtacağız. Tamam, şimdi RF gücünü açabilir, plazmayı bir dakika boyunca vurabiliriz.

Yani plazma çalışırken, aslında parlıyor. Floresan bir ampul gibi. Bir dakika plazmaya maruz kaldıktan sonra, basıncı atmosferik seviyeye geri getireceğiz ve parçaları dışarı çekebileceğiz.

Artık parçalar protein kaplama ve hücre beslemesi için hazırdır. Bu cihazı tasarlamaktaki amaç, dokunun mikro mimarisini dinamik bir şekilde manipüle edebilmekti. Bu nedenle, vücuttaki dokunun mikro organizasyonu, özellikle hücrelerin birbirine göre yerleştirildiği yer, laboratuvar kültüründe her bir hücrenin işlevini belirlemede çok önemlidir.

Yakın zamana kadar, bunu tekrarlamak için iyi bir iş çıkaramıyorduk, ancak son beş veya 10 yılda, insanlar hücreleri bir doku kültürü substratı üzerine mikro desen haline getirmeye başladılar, böylece hücreleri bir doku kültürü plakasında tam olarak istediğimiz yere yerleştirdiler. Ve bunu yaparken, mikro ölçekte hücre hücre etkileşimlerinin temel biyolojisinin bazı önemli yönlerini keşfedebildiler. Şimdi, bu noktaya kadar yapamadığımız şey, bunu dinamik bir şekilde yapmak.

Bu, deneyin ortasındaki bir hücre kültürünün organizasyonunu değiştirmektir. Ve bu önemlidir çünkü vücutta, yani doku aslında statik bir ortam değildir. Özellikle yara iyileşmesi veya gelişiminde hareket eden ve yeniden organize olan hücrelerimiz var.

Ama homeostazdaki normal bir organda bile, etrafta hareket eden çok fazla şey var. Öğrenilmesi en zor teknik yön, parçaların fiziksel olarak nasıl yenileceğidir. Ve başlangıçta sistemle çalışmaya başladığınızda, parçaların ne kadar kırılgan olduğu veya yapmanız gereken duyguların ne kadar küçük olduğu sizi korkutabilir.

Ama bence sadece bir süre pratik yaparsanız, çok fazla sorun yaşamazsınız. Bu cihazın, örneğin embriyonik gelişimde rol oynadığını gördüğümüz yerlerden bazıları, hücreler çeşitli embriyonik katmanlardan tomurcuklanırken bir dizi farklı hücre ortamıyla temas edecektir. Ve bilinen bir şey ki, katmanların her biri ile olan etkileşimler, sırayla temas ettiklerinde, hepimizi belirli bir farklılaşma yolu boyunca daha da ileri itiyor.

Ve bu yüzden bu tür bir cihazın laboratuvarda bu tür bir olayı tekrarlamaya çalışmak için iyi olabileceğini düşünüyoruz. Mikro organizasyonun özellikle bakmak istediğimiz yönlerinden biri, hücre zarlarının birbirine değebildiği temas etkileşimleri yoluyla iletişim kuran hücreler ile çevredeki ortama salgılanan ve biraz daha uzaktaki bir hücreye yayılan çözünür faktörler arasındaki farktı. Ve çoğu zaman hücreler ko-kültürde olduklarında ve birbirleri üzerinde bir etkiye sahip olduklarında, bunların rol oynayan temas etkileşimleri mi yoksa salgılanan faktörler mi olduğu açık değildir.