Gelişmekte olan Zebra balığı Epidermis Hücre Ekstrüzyon Canlı Görüntüleme

Epitel dokularının bakımı, bariyer fonksiyonunu bozmadan hasarlı ve ölmekte olan hücrelerin sürekli olarak uzaklaştırılmasını gerektirir. Bu epitelyal işlemi gerçekleştirmek için, ölmekte olan hücreyi çevreleyen hücrede bir aktin ve miyozin halkası oluşturup daraltarak ölmekte olan hücreleri ekstrüde edin ve çıkışından kaynaklanabilecek boşlukları kapatırken onu dışarı atın. Bu video makalesinde, larva zebra balıklarının epidermisinden apoptotik hücre ekstrüzyonunu gerçek zamanlı olarak indüklemek ve görüntülemek için bir yöntem.

Gösterildiği gibi, bu, epitel dokularında etkili filamentleri görselleştirmek için epidermiste yeşil floresan proteini eksprese eden bir hücre aşaması transgenik zebra balığı embriyosuna F aktin probu etiketli kırmızı bir floresan proteinin enjeksiyonu ile elde edilir. Dördüncü gün, hem GFP hem de RFP'yi eksprese eden kişiselleştirme sonrası larvalar daha sonra epidermiste apoptozu indüklemek için G four 18 ile tedavi edilir. Ekstrüzyon sırasında meydana gelen aktin dinamikleri ve epitel hücre şekli değişiklikleri, dönen disk konfokal mikroskopta hızlandırılmış görüntüleme ile görselleştirilir.

Bu tekniğin immüno-kuvvet ve analizler gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, canlı bir epitel dokusunda olması durumunda ekstrüzyon işlemi sırasında meydana gelen hızlı değişiklikleri ve aktin dinamiklerini gözlemleyebilmemizdir. Bu videoda, gelişmekte olan zebra balığının epidermisinden apoptotik hücrelerin ekstrüzyonunu gerçek zamanlı olarak görüntülemek için bir prosedür göstereceğiz. Laboratuvarımızda, hücrelerin bariyer fonksiyonunu korurken apoptotik hücreleri çıkarmak için akton hücre iskeletlerini koordineli olarak nasıl yeniden düzenlediklerini ve ekstrüzyon işleminin bozulmasının belirli hastalık durumlarına nasıl yol açabileceğini anlamak için bu prosedürü kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım: Gelişmekte olan zebra balıklarının epidermisinde hücre ekstrüzyonu sırasında hareket dinamiklerini görselleştirmek için, daha önce kopyalanmış RNA'yı buz üzerinde çözerek başlayın. Ütrofinin homoloji alanında baldıra kaynaşmış kırmızı floresan proteini kodlayan Mr.mRNA'yı yazıya döküyoruz ve proteini bağlayıcı olarak hareket ediyoruz. Mikrolitre başına yaklaşık 30 nanogramlık bir nihai RNA konsantrasyonu için RNA'ya bire bir oranında fenol kırmızısı ekleyin ve geri doldurma ile çekilmiş bir kılcal iğneye bir mikrolitre çözelti yükleyin.

E üç tamponda yaklaşık 75 1 hücre evresi C-K-G-F-P embriyosu toplayın. Toplanan embriyoları beş ve üç çeyrek makarna pipeti ile mikroenjeksiyon kalıbına pipetleyin ve embriyoları FST Dumont ile olukta nazikçe yönlendirin. Beş numara, forseps, RNA'yı standart bir laboratuvar diseksiyon stereo mikroskobu altında çok aşamalı embriyolara enjekte etmek zorunda kalmamak için hızlı bir şekilde çalışır.

RNA'yı fenol fosili olarak embriyoların boyunduruğuna enjekte etmek için basınç kontrollü bir mikro enjektör kullanın. Enjeksiyondan sonra embriyoda kırmızı görünmelidir. Her deney için en az 50 embriyo enjekte ettiğinizden emin olun.

Döllenmemiş veya hasar görmüş yumurtaları çıkarmak için embriyoları sıralayın ve kalan tüm embriyoları 28 santigrat derecede inkübe edin. 24 saat sonra, epidermiste yüksek düzeyde GFP floresansı ve RFP etiketli etkili floresan olan zebra balığı embriyolarını seçmek için bir floresan diseksiyon mikroskobu kullanın. Seçilen embriyoları, amino glikozite apoptoz maruziyetini indüklemek için ilaç tedavisine devam etmeye hazır olana kadar 28 santigrat derecede inkübe edin.

Antibiyotik G dört 18 veya ilaç, gelişmekte olan zebra balığı larvalarının epidermisinden apoptotik hücrelerin ekstrüzyonuna neden olur. Daha da önemlisi, bu tedavi sadece hücre ekstrüzyonunu indüklemek için döllenmeden dört gün sonra ve daha yaşlı larvalar üzerinde çalışır. Hem GFP hem de RFP'yi ifade eden döllenmeden 4 gün sonra 25'e kadar zebra balığı larvalarını, üç mililitre E üç orta içeren 35 x 10 milimetrelik bir kültür kabına toplayın.

Ortamı dikkatlice üç mililitre E ile değiştirin, üç mililitre G dört 18 miligram içerir ve larvaları ilacın içinde karanlıkta dört saat boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra ortamı çıkarın ve %0.02 trica içeren ön ısıtma E üç ortamla değiştirin ve larvaları görüntüleme için monte etmek üzere larvaları monte etmeye devam edin. En fazla üç larvayı 1.5 mililitrelik bir fendor tüpüne aktarın ve E üç ortamının çoğunu çıkarın.

Kesilmiş bir pipet ucu kullanarak, 120 mikrolitre% 1 düşük eriyik aros pipetini tüp karışımına ekleyin. Daha sonra larvaları ve aro karışımını bir matech kültür kabının altındaki kapak camına nazikçe pipetleyin. Bir geçme pimi veya tungsten iğnesi takılı bir FST pim tutucusu kullanarak, larvaları kapak camına karşı düz ve düz olacak şekilde hızlı bir şekilde yönlendirin.

Aeste'nin katılaşmasına izin verin. Daha sonra tabağı nazikçe% 0.02 trica içeren E üç ortam ile doldurun. Gelişmekte olan zebra balığı larvalarının epidermisinden tüm apoptotik hücre ekstrüzyon işleminin yaklaşık 20 dakika sürdüğünü bulduk.

Burada, zebra balığı epidermisinin tek bir katmanından bir dizi Z düzlemi toplamak için dönen diskli konfokal mikroskop ve ve/veya IQ yazılımı kullanarak hızlandırılmış bir görüntüleme deneyinin nasıl kurulacağını gösteriyoruz. İlk olarak, ve/veya IQ yazılımı içindeki argon ve helyum neon lazerler mikroskop kamerasını ve epi floresan lambayı açın. Görüntülenecek dalga boylarını içeren bir zaman serisi protokolü oluşturun.

Görüntü yakalamaları arasındaki aralıkların sıklığı ve yakalamanın tekrarlanması gereken sayı: Numuneyi içeren mattec kabını nazikçe mikroskop tablasına yerleştirin ve ardından larvalara odaklanmak için iletilen ışıkla 20 kat objektif kullanın. 40 kez suya daldırma hedefini doğru konuma getirin. Bu hedefi kullanarak, alan başına yaklaşık 20 ila 25 hücreyi filme alabiliyoruz, bu da ekstrüzyon sırasında hücresel davranışları takip etmemizi sağlarken aynı zamanda hücre altı hareket dinamiklerini de çözüyor.

40 kez objektifin üstüne dikkatlice bir damla su damlatın ve mattec kabını hızlı bir şekilde üstüne yerleştirin. Parlak alan aydınlatması kullanarak numuneyi tanımlayın ve ardından özellikle GFP pozitif epidermise odaklanmak için 488 nanometre epi floresan kullanın. Konfokal tarama moduna geçin.

Kanalların her biri için lazer yoğunluğunu ve pozlama süresini buna göre ayarlayın. Sinyalinizin en iyi şekilde algılanması ve herhangi bir fototoksisiteyi önlemek için lazer gücünü ve maruz kalma süresini dengelemeye dikkat edin. Ekstrüzyon yapan hücreleri tanımlamak için, GFP etiketli epidermisi görselleştirmek için epi floresan kullanın ve ortada küçük yuvarlak bir hücreyi çevreleyen bir hücre koleksiyonundan oluşan klasik bir rozet modelinde bir hücre grubunu tanımlayın.

Ek olarak, hücre ekstrüzyonunun ayırt edici özelliği olan, ortadaki küçük yuvarlak hücrenin etrafında bir halka olarak görülebilen RFP etiketli aktin birikimi olmalıdır. Ekstrüzyon yapan bir hücre tanımlandıktan sonra, Z Serisi için üst ve alt limitleri ve adım boyutunu hızlı bir şekilde ayarlayın. Ardından, verileri görüntülemek ve aktin halkasının kasılmasını ve ölmekte olan hücrenin etrafında meydana gelen epitel davranışlarını görselleştirmek için dört D konfokal veri seti edinmeye başlayın.

Zamanla, Z serisinin 3D projeksiyonlarını yapın ve verileri bir film dosyası olarak kaydedin. Bu adım, çeşitli yazılım paketleri kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu şekil, döllenmeden dört gün sonra CK GFP zebra balığı larvalarının epidermisinde RFP UTR CH ekspresyonunu göstermektedir.

Burada hala canlı oyunculuk dinamiklerini takip eden hızlandırılmış bir filmden Z projeksiyonlarını kadrajlayın. Epitel hücre ekstrüzyonu işlemi sırasında oklar, komşu hücreler tarafından oluşturulan, iki dakika boyunca büzülen ve kapanan aktin halkasını gösterir. Bu prosedürü takiben, ekstrüzyonun değiştirilmesinin belirli hastalık durumlarına nasıl yol açabileceğini daha iyi anlamak için kimyasal inhibitörlerin veya genetik mutasyonların kullanımı gibi bu teknikle birlikte başka yöntemler de kullanabiliriz.

Apoptotik hücrelerin temizlenememesinden kaynaklanan, gelişmekte olan zebra balığının epidermisinden ekstrüzyon sürecini görselleştirmek için hızlandırılmış bir görüntüleme deneyinin nasıl kurulacağını gösterdik. Bu prosedürü gerçekleştirirken, herhangi bir fotoğraf ağarmasını veya toksisitesini önlemek için numunenize maruz kalan ışık miktarını sınırlamayı unutmamak önemlidir. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde iyi şanslar.