ToxR Assay tarafından belirlenen Transmembran Domain Oligomerization Eğilimi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, doğal bir membran ortamında protein, transmembran alanları veya T MD'lerin ligamentizasyon eğilimlerini araştırmaktır. Bu, e coli'deki transmembran ilgi alanının, peri plazma ve toksine lokalizasyon için maltoz bağlayıcı protein ile kimerik bir protein olarak ifade edilmesiyle elde edilir. Transkripsiyonel bir raportör olarak R, transmembran alanın indüklediği ligamentizasyon, toksinin dimerizasyonu ile sonuçlanır R, ve LXi transkripsiyonunun aktivasyonu İkinci adım olarak, hücreler parçalanır ve beta galakto tarafından ışık emici tür O nitro folat veya ONP'ye hidrolize edilen ONPG ile muamele edilir.

Sonraki ONP seviyeleri, 405 nanometrede ışık emiciliği ölçülerek ölçülür. Transmembran domain seviyelerini belirlemek için ligamentizasyon sonuçları, transmembran domainlerin ligamentizasyon eğilimini bir tox R raportör testine dayalı olarak ortaya koymaktadır. Bu tekniğin SDS sayfası veya floresan gibi mevcut biyofiziksel yöntemlere göre ana avantajı, transmembran alanının davranışının, kendim bir deterjan gibi bir membran mimetik sisteminden ziyade e coli'de ekspresyon yoluyla doğal bir fosfolipid çift tabakasında incelenmesidir.

Bu yöntem, transmembran Helix Birliği'nde yer alan temel yapısal özelliklerin aydınlatılması gibi membran protein alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu protokolün başlamasından önce, gerekli kimerik proteini ifade eden pox yedi plazmit, ticari olarak sentezlenmiş oligonükleotidlerden hazırlanır ve NHE bir ve BMH bir ile çevrili ilgilenilen TDS'yi temsil eder. Plazmitler hazırlandıktan sonra kısıtlama bölgeleri, fhk 12 yetkin hücreleri buz üzerinde nazikçe çözer. Çözüldükten sonra, hücreleri her bir plazma DNA'sının 200 nanogramında 15 mililitrelik kültür tüplerine ayrı bir tüpe aktarın ve hücreleri 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.

Daha sonra hücreleri 42 santigrat derecede 90 saniye boyunca ısı şoku uygulayın, ardından 800 mikrolitre SOC ortamında iki dakika buz üzerinde inkübe edin ve inkübasyondan sonra numuneleri bir saat çalkalayarak 37 derecede inkübe edin kloramfenikol ve aose içeren beş mililitre LB ortamını 50 mikrolitre dönüşüm karışımı ile aşılayın her numune için üç nükte halinde 15 mililitre kültür tüpleri kullanarak. Son olarak, numuneleri 37 santigrat derecede 20 saat çalkalayarak inkübe edin. TDS'nin tüm ligamentizasyonunu ölçmek için beta galakto taz aktivitesi belirlenir.

İlk olarak, plaka okuyucuyu önceden 28 santigrat dereceye ısıtın. Yazılı protokolde açıklandığı gibi taze Z tampon çözeltileri hazırlamak için Z tampon stoğunu kullanın. Z tampon kloroformunu tüpten rezervuara aktarın, sadece Z tampon kloroformunun üst sulu tabakasını boruladığınızdan emin olun.

96 oyuklu plakayı, doğru pipetlemeyi sağlamak için ızgara çizilmiş bir kağıda yerleştirin, 100 mikrolitre Z tampon kloroformunu 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna aktarın ve ardından her kültürden dörtlü olarak beş mikrolitre aktarın. Çoğaltın, boşluk görevi görecek dört kuyudan kültürü atlayın. Hücre yoğunluğunu belirlemek için plakanın OD 5 95'ini ölçün.

Plakanın tüm kuyucuklarına 50 mikrolitre Z tampon SDS ekleyin. Daha sonra, tüm kuyucuklara ONPG için 50 mikrolitre ZPA'da hücre lizizini takiben hücreleri yerleştirmek için plakayı plaka okuyucuda 10 dakika çalkalayın. Plakayı plaka okuyucuya geri koyun ve 20 dakika boyunca her 30 saniyede bir OD 4 0 5'i ölçün.

Boşluğa normalleştiren Miller birimlerinin hesaplanması yoluyla beta lakto tuz aktivitesinin seviyesini belirleyin. Western blotlama, yapılar arasındaki eşdeğer protein ekspresyonunu doğrulamak için gerçekleştirilir. İlk olarak, üçlü kültürlerin 50 mikrolitresini birleştirin ve ardından numuneleri bir mikro santrifüj kullanarak santrifüjleyin.

Süpernatanı pipetleme ve tekrarlama ile çıkarın. Artık peleti iki x numune yükleme tamponunda askıya alın, her numuneden 7,5 mikrolitre standart bir %8 jel üzerine yükleyin ve transferden sonra bir saat beş dakika boyunca 125 voltta elektroforez gerçekleştirin. Zarı anti M-V-P-H-R-P konjuge antikor ile inkübe edin, kimerik protein yaklaşık 70 kilodaltonda gözlenir, bazı bozunma ürünleri bazen 48 kilodalton civarında görülür.

Endojen MVP de 45 kilodaltonda gözlenir. Kimerik TMD yapısının uygun membran yerleştirilmesini değerlendirmek için, maltoz bağlayıcı protein eksikliği olan PD 28 hücre hattı, tek karbon kaynağı olarak maltoz ile minimal ortamda büyütüldüğünde kullanılır, sadece peri plazmasında doğru bir şekilde yerleştirilmiş maltoz bağlayıcı protein ile bir zar integral ekspresyon ürününü eksprese eden hücreler büyüyebilir. PD 28 hücrelerini fhk 12 hücreleri için tarif edildiği gibi dönüştürün ve iki mililitre LB ortamını aşılayın.

İnkübasyondan sonra gece boyunca 300 RPM'de çalkalayarak hücreleri 37 santigrat derecede büyütün. Hücreleri santrifüjleme ile pellet yapın ve iki mililitre PBS'de Resus süspansiyonu ile yıkayın ve büyük bir uçla nazikçe pipetleyin. Peletlemeden sonra, hücreler tekrar PBS ile ikinci kez yıkanır, daha sonra bir mililitre PBS'de son bir santrifüjleme ve yeniden süspansiyon gerçekleştirir.

Beş mililitre minimal ortamı aşılamak için 25 mikrolitre yeniden askıya alınmış hücre kullanın. 37 santigrat derece olan hücreleri 15 saatte çalkalayarak inkübe edin. Her numunenin 200 mikrolitresini 96 oyuklu bir plakaya aktarın ve plaka okuyucuyu kullanarak OD 5 9 5 okumasını alın.

Bu işlemi 25 saate kadar her iki saatte bir tekrarlayın. Çoklu yayılan membran integral proteini gizli membran proteininden bireysel transmembran alanlarının tüm ligamentizasyon eğilimi, tox R transkripsiyonel raportör testi kullanılarak analiz edildi. Transmembran alan beş, pozitif kontrol GPAA iyi kurulmuş dimerizasyon dizisi ile karşılaştırılabilir olan yüksek Miller birimleri tarafından gösterildiği gibi liga yükselmesine güçlü bir eğilim sergiler.

Transmembran alanındaki zararlı bir mutasyon beş D bir 50 A, dizinin tüm liga yükselişine yeteneğini azaltır LMP bir, TM biri önemli ölçüde tüm liga yükselmesini sağlamaz ve dönüştürülmemiş FHK 12 hücreleri olan boşluk sinyalinin hemen üzerinde çok düşük bir Miller birimi sinyali sergiler. Bu videoyu izledikten sonra, ilgilenilen bir transmembran sarmalının doğal bir membran ortamında daha yüksek dereceli kompleksler oluşturma yeteneğine sahip olup olmadığını nasıl belirleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız Bu prosedürü denerken, büyük hatalardan kaçınmak ve hava kabarcığı oluşmadığından emin olmak için 96 oyuklu plakaya son derece dikkatli bir şekilde pipetlemek önemlidir.