Name: ToxR Assay tarafından belirlenen Transmembran Domain Oligomerization Eğilimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Öğrenin, tek geçişli transmembran domainlerin oligomerizasyon eğilimini E. coli'de ToxR raportör sistemiyle nasıl değerlendireceğinizi. Beta-galaktosidaz aktivitesi ölçülerek doğal fosfolipid çift tabakada protein etkileşimleri incelenir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz, Ulusal Sağlık Enstitüleri (1R21CA138373 teşekkür ediyor ve bu çalışmanın finansal destek Kanseri (SU2C) Stand Up. HY, Amerikan Kanser Araştırma, Sidney Kimmel Vakfı Kimmel Scholar Ödülü Derneği, 2009 Elion Ödülü için minnettar Kanser Araştırma (SKF-08-101) ve Ulusal Bilim Vakfı Fakültesi Erken Kariyer Ödülü (NSF0954819).

1. Klonlama Hususlar <ol><li> Ticari olarak hazırlanan oligonükleotidler NheI ve BamHI kısıtlama siteleri ve 5'-fosforile ile çevrili ilgi TMD temsil pTox7 (BamHI kısıtlama sitesi 14 doğrudan sonra tek bir baz çifti ekleme laboratuvarımızda güncellenmiştir) (Şekil 3) sırayla sindirilir içine bağlandı . BamHI ve NheI. Bir örnek oligonükleotid, aşağıda gösterilmiştir: 5'ctagcTMDSEQUENCEg3 ' 3 'gTMDSEQUENCEcctag5' </li></ol> TMD sıra 12-24 kalıntıları (kısa dizileri muhtemelen vektör kodlanmış hidrofobik artıkları uzun olacak) olmalıdır. Sıralı kalıntı eklemeler ve ToxR TMD göreli dönme birlikte kalıntı silmeler. 15,16 Nihayet, arabinoz konsantrasyonu 0.001 ve% 0.01 arasında değişmektedir olmalıdır arayüzü araştırmak için, dört değişik TMD tasarım oluşturulmalıdır (w / v) farklı TMD dizileri arasında β-galaktosidaz sinyalleri maksimum farklılıklar gözlenmektedir konsantrasyonunu belirlemek için farklı ekspresyon seviyeleri test koşulları altında farklı yakınlık en iyi ayırt edilebilir tanımlamak için tavsiye edilir. Arabinoz ve antibiyotiklere ek olarak, 0.4 mM IPTG farklı TMDS arasındaki yakınlık farkı artırmak için kullanılabilir. En az dört nüsha ToxR ölçümü yapılmalıdır. Tüm prosedürü farklı plazmid dönüşümler ile en az üç kez tekrar edilmelidir. 2. Bakteriyal Kültürler Büyüme <ol><li> Yavaşça 15 ml kültür tüp içine buz ve transfer FHK12 yetkili hücreleri (200 ul) Çözülme. Plazmid DNA (200 ng) ekleyin ve 30 dakika buz üzerinde hücreleri kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> 42 90 s inkübasyon ısı-şok hücreleri ° C, 2 dakika süreyle buz üzerinde kuluçka takip. </li><li> SOC medya (800 ul) ekleyin ve 37 numunelerin inkübasyon ° C (300 rpm) sallayarak bir saat </li><li> Üç nüsha halinde 15 ml kültür tüpleri dönüşüm karışımı 50 ul kloramfenikol (30 mg / ml) ve arabinoz (0.0025% w / v) ile 5 ml LB medya inoküle edin. 37 numune ° C'de 20 saat (300 rpm) sallayarak (5 ul kültür Alternatif 96-plaka orta 100 ul aşılamak için kullanılan olabilir, çok sayıda numune ile uğraşırken bu yöntem yararlıdır, hataları biraz daha yüksek olmasına rağmen, yol açacak buharlaşma önlemek için hata ile dış ortam kuyuları doldurup, ancak örnekler için onları kullanmayın. Sonunda), kapak ve parafilm ile plaka arasında ortak çift sarın. </li></ol> 3. Β-galaktosidaz Aktivite ölçümü <ol><li> Onceden plaka okuyucu ile 28 ° C </li><li> Üst katmanı (sulu) sadece almak için emin olun, büyük bir pipet ucu ile Z-tampon bir rezervuar içine aktarın. 96 plaka kuyulardan taze hazırlanmış Z-buffer/chloroform 100 ul aktarın. Her kültürün 5 ul dört nüsha plaka kuyuların içine aktarın. Dört kuyu boş olarak hizmet verecek kültür yok sayın. </li><li> Hücre yoğunluğu belirlemek için plaka OD 595 ölçün. </li><li> Plaka tüm kuyuları Z-buffer/SDS 50 ul ekleyin. Plaka plaka okuyucu hücreleri lyze için 10 dakika süreyle iyice çalkalayın. Hücre süspansiyonları lizis sonra açık ve gerekirse sallayarak adımı tekrarlayın emin olun. Eksik lizis Z-buffer/chloroform taze hazır değildi göstermektedir. </li><li> Tüm kuyulara Z-buffer/ONPG taze hazırlanmış 50 ul ekleyin ve 20 dakika boyunca her 30 s plaka okuyucu ve ölçü OD 405 plaka dönmek. </li><li> Aşağıdaki denklemi kullanarak (boş çıkarma hatırlamak) β-galaktosidaz aktivitesi hesaplayın. Doğrusal bir modeli uydurmak kullanarak 1,0 OD 405 aralığı 0.0 tüm veri noktalarını kullanarak, OD 405 / dk oranı hesaplanmalıdır . <img src="files/ftp_upload/2721/2721eq1.jpg" alt="Denklem 1"> Miller birimleri, farklı günlerde bazen farklılık gösterir. Bu nedenle, genel not ortalaması gibi bir referans inşa, her bir test ölçülmelidir. Kendi değerlerini ToxR değerleri normalleşmesi için kullanılabilir. </li></ol> 4. Protein Ekspresyonu için kontrol <ol><li> Batı yapıları arasında bile protein ekspresyonu doğrulamak için blot gerçekleştirin. Bir mikrosantrifüj üç nüsha kültürler ve santrifüj 50 ul (2000 rpm, 4 dakika) birleştirin. Pipetleme süpernatantı ve 2 adet numune yükleme tamponu kalan pelet tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> % 8 standart bir jel üzerinde 7.5 ul Yük ve 1 saat 5 dakika boyunca 125 V electrophoreses yürütmek. Aktarımdan sonra, anti-MBP HRP-konjuge antikor ile inkübe ve görselleştirmek; kimerik protein yaklaşık 70 kDa, 48 kDa etrafında bazen görülen bazı yıkım ürünleri ile görülmektedir. Endojen MBP 45 kDa görülmektedir (bkz. Şekil 5). </li></ol>5. Uygun Membran Ekleme Kontrolü Maltoz bağlayıcı protein eksikliği hücre hattı kimerik TMD inşa uygun membran ekleme değerlendirmek için kullanılır. Tek karbon kaynağı olarak, maltoz ile minimal medya yetişen, sadece hücreleri periplasm doğru yer maltoz bağlayıcı protein ile bir zar-integral ifadesi ürün ifade büyümek mümkün. <ol><li> Transform PD28 hücreleri (FHK12 hücreleri için açıklandığı gibi) ve 2 ml LB orta aşılamak. 37 hücrelerin büyümesine ° C (300 rpm) bir gecede sallayarak. </li><li> Pelet 3500 rpm'de santrifüj yoluyla hücreler, 10 dk, 4 ° C ve PBS (2 ml) tabanda büyük bir ucunda ya da yumuşak bir vorteks nazik pipetleme ile yıkayın. Pelet hücreleri (yukarıdaki gibi), ikinci kez PBS ile yıkayın pelet ve son olarak PBS (1 ml) tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> 37 az üç nüsha ve inkübe 5 ml minimal medya aşılamak için yeniden süspanse hücrelerinin 25 ul kullanın ° C sallayarak (300 rpm). 15-25 saat, plaka okuyucu kullanarak 96-plaka okuma ve her bir örnek 200 ul aktararak yaklaşık her 2 saat arasında OD 595 okuma alın. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: Şekil 4'te gösterildiği transmembran etki alanı oligomerization eğilimi analiz ToxR transkripsiyonel muhabiri testinin kullanımı bir örnek. Önceleri biz oligomerization transmembran etki araştırıldı multispanning membran-integral protein latent membran protein-1 ToxR de dahil olmak üzere çeşitli teknikler (LMP-1) 14 Transmembran etki alanı beş (TM5) oligomerize güçlü bir eğilimi gösterirler gösterildi. Bu pozitif kontrol ile karşılaştırılabilecek yüksek Miller Üniteleri, GPA, köklü bir dimerizing dizisi olduğunu göstermiştir. TM5, D150A, zararlı mutasyon oligomerize dizisi yeteneğini azaltır. LMP-1 TM1 önemli ölçüde oligomerize değildir ve sadece boş olmayan dönüştürülmüş FHK12 hücreler için sinyal üzerinde çok düşük Miller Birim sinyali sergiliyor. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Karikatür ToxR muhabiri tahlil tasvir. Transmembran etki alanı (TMD) ToxR ve LacZ transkripsiyon aktivasyonu dimerization oligomerization sonuçları tahrik. LacZ gen ürünü, β-galaktosidaz oligomerize bir TMD eğilimi bir önlem olarak belirlenebilir. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 ışık emici türleri o nitrophenolate (ONP) üretimi β-galaktosidaz sonuçları ONPG hidrolitik bölünme. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 pToxR7 Plazmid harita. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 Temsilcisi ToxR transkripsiyonel muhabiri tahlil latent membran protein-1 transmembran etki alanı oligomerization eğilimi analiz. Transmembran etki alanı 1 (TM1) sadece zayıf bir etkileşim gösterir iken Transmembran etki alanı 5 (TM5), güçlü bir oligomerizes. Mutasyon D150A TM5 içinde oligomerize kabiliyetini önemli ölçüde azaltır. GPA, güçlü dimerization bir pozitif kontrol dizisi olarak yer almaktadır. Boş araştırıcıların bulgularıyla FHK12 hücreleri temsil eder. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5 protein ekspresyonu için Western Blot. <img src="/files/ftp_upload/2721/2721fig6.jpg" alt="Şekil 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 6"> Şekil 6 PD28 tamamlama tahlil periplasm doğru membran ekleme kontrol etmek için. Negatif kontrol, maltoz bağlayıcı protein eksikliği bir yapı gösterir.

<ol><li>Parker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+of+the+heptahelical+G+protein+coupling+receptors%3A+a+case+for+association+using+transmembrane+helices%5BTitle%5D)+AND+%22Mini+Rev+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Oligomerization of the heptahelical G protein coupling receptors: a case for association using transmembrane helices.</a> Mini Rev Med Chem. 9, 329-339 (2009).</li>
<li>Mo, W., Zhang, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomerization+of+human+ATP-binding+cassette+transporters+and+its+potential+significance+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Metab+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Oligomerization of human ATP-binding cassette transporters and its potential significance in human disease.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 1049-1063 (2009).</li>
<li>von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-protein+topology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane-protein topology.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 909-918 (2006).</li>
<li>Van Horn, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+nuclear+magnetic+resonance+structure+of+membrane-integral+diacylglycerol+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Solution nuclear magnetic resonance structure of membrane-integral diacylglycerol kinase.</a> Science. 324, 1726-1729 (2009).</li>
<li>Hattori, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mg%282%2B%29-dependent+gating+of+bacterial+MgtE+channel+underlies+Mg%282%2B%29+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Mg(2+)-dependent gating of bacterial MgtE channel underlies Mg(2+) homeostasis.</a> Embo J. 28, 3602-3612 (2009).</li>
<li>Ulmschneider, M. B., Sansom, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+distributions+in+integral+membrane+protein+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Amino acid distributions in integral membrane protein structures.</a> Biochim Biophys Acta. 1512, 1-14 (2001).</li>
<li>Deber, C. M., Goto, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+proteins+into+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Folding proteins into membranes.</a> Nat Struct Biol. 3, 815-818 (1996).</li>
<li>Gerber, D., Shai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+detection+of+hetero-association+of+glycophorin-A+and+its+mutants+within+the+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo detection of hetero-association of glycophorin-A and its mutants within the membrane.</a> J Biol Chem. 276, 31229-31232 (2001).</li>
<li>Langosch, D., Brosig, B., Kolmar, H. p, Fritz, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimerisation+of+the+glycophorin+A+transmembrane+segment+in+membranes+probed+with+the+ToxR+transcription+activator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Dimerisation of the glycophorin A transmembrane segment in membranes probed with the ToxR transcription activator.</a> J Mol Biol. 263, 525-530 (1996).</li>
<li>Russ, W. P., Engelman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TOXCAT%3A+a+measure+of+transmembrane+helix+association+in+a+biological+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">TOXCAT: a measure of transmembrane helix association in a biological membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 863-868 (1999).</li>
<li>Berger, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+motif+for+integrin+transmembrane+helix+association%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Consensus motif for integrin transmembrane helix association.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 703-708 (2010).</li>
<li>Oates, J., King, G., Dixon, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+oligomerization+behavior+of+PDGFbeta+receptor+transmembrane+domain+and+its+regulation+by+the+juxtamembrane+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Strong oligomerization behavior of PDGFbeta receptor transmembrane domain and its regulation by the juxtamembrane regions.</a> Biochim Biophys Acta. 1798, 605-615 (2010).</li>
<li>Sal-Man, N., Gerber, D., Shai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hetero-assembly+between+all-L-+and+all-D-amino+acid+transmembrane+domains%3A+forces+involved+and+implication+for+inactivation+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Hetero-assembly between all-L- and all-D-amino acid transmembrane domains: forces involved and implication for inactivation of membrane proteins.</a> J Mol Biol. 344, 855-864 (2004).</li>
<li>Sammond, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+peptides+used+to+investigate+the+homo-oligomeric+interface+and+binding+hot-spot+of+the+oncogene%2C+latent+membrane+protein+1%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Transmembrane peptides used to investigate the homo-oligomeric interface and binding hot-spot of the oncogene, latent membrane protein 1.</a> , Forthcoming (2010).</li>
<li>Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimerization+of+the+transmembrane+domain+of+Integrin+alphaIIb+subunit+in+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dimerization of the transmembrane domain of Integrin alphaIIb subunit in cell membranes.</a> J Biol Chem. 279, 26666-26673 (2004).</li>
<li>Ruan, W., Becker, V., Klingmuller, U., Langosch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interface+between+self-assembling+erythropoietin+receptor+transmembrane+segments+corresponds+to+a+membrane-spanning+leucine+zipper%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The interface between self-assembling erythropoietin receptor transmembrane segments corresponds to a membrane-spanning leucine zipper.</a> J Biol Chem. 279, 3273-3279 (2004).</li>
<li>Finger, C., Escher, C., Schneider, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single+transmembrane+domains+of+human+receptor+tyrosine+kinases+encode+self-interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">The single transmembrane domains of human receptor tyrosine kinases encode self-interactions.</a> Sci Signal. 2, ra56-ra56 (2009).</li>
</ol>

ToxR transkripsiyonel muhabiri tahlil oligomerize potansiyeline sahip transmembran dizileri tanımlamak için uyduruk bir yoludur. Bakteriyel iç zarı içinde meydana gelen etkileşimler olduğundan, bu testte membran-mimetik ortamlarda eğitim sistemlerinin geçerliliği ile ilgili konular circumvents. Paralel olarak tek bir plazmid birden çok TMDS klonlama kolayca yapılabilir ve tüm testi 96-plaka biçiminde yapılabilir göz önüne alındığında, bu testte yüksek verimlilik analizi için çok sayıda protein dizileri kullanılan bir <s...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> BamHI restriksiyon enzimi </td><td> Invitrogen </td><td> 15201023 </td><td> Invitrogen enzimler alternatif tedarikçiler daha verimli olduğu tespit edildi </td></tr><tr><td> NheI restriksiyon enzimi </td><td> Invitrogen </td><td> 15444011 </td><td> Invitrogen enzimler alternatif tedarikçiler daha verimli olduğu tespit edildi </td></tr><tr><td> 15 ml kültür tüpleri </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-956-1J </td><td></td></tr><tr><td> SOC medya </td><td> Teknova </td><td> S0225 </td><td> Uygun hacmi kadar yapılan ve otoklav ile sterilize. </td></tr><tr><td> LB medya </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L7275 </td><td> Uygun hacmi kadar yapılan ve otoklav ile sterilize. </td></tr><tr><td> Kloramfenikol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> CO 3 78 </td><td> Dondurucuda saklanan etanol içinde 30 mg / mL stok çözelti </td></tr><tr><td> Arabinoz </td><td> Fluka </td><td> 10839 </td><td> Dondurucuda saklanan su,% 2,5 (w / v) stok solüsyonu </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9390 </td><td></td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9638 </td><td></td></tr><tr><td> KCl </td><td> Mallinckrodt Kimyasallar </td><td> 6858-06 </td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 .7 H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 63138 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum dodecylsulfate (SDS) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L6026 </td><td></td></tr><tr><td> 2-nitrofenil β-D-galactopyranoside (ONPG) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 73660 </td><td></td></tr><tr><td> Z-buffer </td><td></td><td></td><td> 16.1 g Na 2 HPO 4 5.5g NaH 2 PO 4 0.75g KCl 0.246g MgSO 4 1 lt, pH 7.0 Makyaj </td></tr><tr><td> Z-buffer/chloroform </td><td></td><td></td><td> 200 ml β-mercaptoethanol, 2 mL kloroform, Z-buffer ile 20 ml kadar yapmak. 800 rpm&#39;de 1 dakika için 1 dakika, santrifüj Vortex. Her plaka için taze olun. </td></tr><tr><td> Z-buffer/SDS </td><td></td><td></td><td> 160 mg SDS 10 ml Z-tampon içinde çözünmüş </td></tr><tr><td> Z-buffer/ONPG </td><td></td><td></td><td> 40 mg 10 ml Z-tampon ONPG. Her plaka için taze olun </td></tr><tr><td> ß-mercaptoethanol </td><td> Calbiochem </td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-MBP monoklonal antikor (HRP konjuge) </td><td> NEB </td><td> E8038S </td><td></td></tr><tr><td> Maltoz ile Minimal medya </td><td></td><td></td><td> 1 x M9 tuzlar,% 0.4 maltoz, 1 mg / ml tiamin, 2 mM MgSO 4 </td></tr><tr><td> 96-düz alt plakası </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1835.300 </td><td></td></tr><tr><td> Levha okuyucu </td><td> Beckman Coulter </td><td> DTX880 Multimode Dedektörü </td><td></td></tr><tr><td> Su banyosu </td><td> VWRI </td><td> 89032-204 </td><td></td></tr><tr><td> Inkübatör Çalkalamalı </td><td> FormaScientific </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

toxr assay tarafından belirlenen transmembran domain oligomerization eğilimi

Transmembrane Domain Oligomerization Propensity determined by ToxR Assay

Çürütülmüştür beri protein transmembran etki basitleştirilmiş görünüm olarak sadece fosfolipid bilayers çapa uzun. Birçok durumda membran kapsayan proteinler eylem oldukça sofistike mekanizmaları gelişmiştir. Membran proteinleri, yapıları ve işlevleri modüle 1-3 hangi bir yolu yapılandırılmış transmembran oligomerler oluşturan, hidrofobik heliksler ve özel direkt temas 4,5 Kadar son tercihen sulu çözelti ve sürücü protein dernek. 6,7 Bununla birlikte, transmembran proteinlerinin etki moleküler tanıma çalışmaları hala gerisinde kalıyor bu farklı moleküller arası kuvvetler karşılaştırma membran ortamda bulunan amino asitlerin dağıtım odaklandı suda çözünen bölgeler. Büyük bir engel kalır: transmembran oligomerization elde edebilirsiniz olağanüstü spesifite ve afinite rağmen, kendi dernek 8 doğrudan ölçümü zordur. Integral membran proteini fonksiyon çalışmaya uygulanan geleneksel metodolojiler inceleme altında dizilerinin doğasında çıkılmazlık engel olabilir. Transmembran etki alanlarını temsil eden sentetik peptidlerin inceleyerek elde Biyofiziksel anlayışlar yararlı yapısal içgörü sağlayabilir. Ancak, deterjan misel veya hücre zarının taklit etmek için bu çalışmalarda kullanılan lipozom sistemleri biyolojik önemi sık sık sorgulanmaktadır; peptidler, bu koşullar altında anadili gibi bir yapı benimsiyor ve bunların fonksiyonel davranış, gerçekten yerli bir membran içinde eylem türü yansıtıyor mu ? Transmembran dizilerinin doğal fosfolipid bilayers etkileşimleri incelemek üzere, Langosch laboratuar ToxR transkripsiyonel muhabiri deneyleri geliştirdi. 9 transmembran ilgi alanı periplasm ve ToxR konumu, maltoz bağlayıcı protein ile bir kimerik protein olarak ifade edilir bir rapor sunmak oligomerization düzeyi (Şekil 1). Son on yıl içinde, diğer bazı gruplar (örneğin Engelman, DeGrado, Shai) daha da optimize ve bu ToxR muhabiri tahlil uygulanan 10-13 çeşitli ToxR deneyleri, hücre zarlarında protein-protein etkileşimleri test etmek için bir altın standart haline gelmiştir . Biz burada öncelikle Langosch tarafından geliştirilen protokoller aşağıdaki laboratuvarda yapılan tipik bir deneysel çalışma göstermektedir. Bu genellikle uygulanan yöntem E. transmembran alan öz-dernek analizi için yararlı coli, β-galaktosidaz üretim TMD oligomerization eğilimi değerlendirmek için kullanılır. TMD indüklenen dimerization üzerine, ToxR β-galaktosidaz LacZ gen up-regülasyonu neden ctx organizatörü bağlar. Kolorimetrik okuma kazandaki süreçlerin hücreleri ONPG eklenmesi ile elde edilir. Işık emici türleri o nitrophenolate (ONP) (Şekil 2) üretimini β-galaktosidaz sonuçları ONPG hidrolitik bölünme.

Tek-geçişli transmembran etki oligomerization eğilimi (TMDS) değerlendirmek için etkili bir prosedür açıklanmıştır. E. coli muhabiri zorlanma ToxR için erimiş TMD oluşan Kimerik proteinleri ifade edilir. TMD-kaynaklı oligomerization ToxR, transkripsiyon ve muhabir protein üretimi,-galaktosidaz aktivasyonu dimerization neden olur.

ToxR Assay tarafından belirlenen Transmembran Domain Oligomerization Eğilimi

Protein transmembran bölgelerinin yalnızca fosfolipid çift tabakalarındaki demirler olduğu şeklindeki aşırı basitleştirilmiş görüş, çoktan geçerliliğini yitirmiştir. Birçok durumda...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, doğal bir membran ortamındaki proteinlerin, transmembran domainlerinin veya TMD'lerin ligamanlaşma eğilimlerini incelemektir. Bu işlem, ilgilenilen transmembran domaininin e coli'de, periplazmaya lokalizasyon için maltoz bağlayıcı protein ile kimerik bir protein olarak ve transkripsiyonel bir raporlayıcı olarak tox R ile eksprese edilmesiyle gerçekleştirilir; transmembran domaininin tetiklediği ligamanlaşma, tox R'nin dimerleşmesiyle ve LXi transkripsiyonunun aktivasyonuyla sonuçlanır. İkinci bir adım olarak hücreler lize edilir ve beta galaktoz tarafından ışığı soğuran tür olan O nitrofenolata veya ONP'ye hidrolize edilen ONPG ile işleme tabi tutulur.Ardından, 405 nanometredeki ışık absorbansı ölçülerek ONP seviyeleriyle nicelleştirilir. Transmembran domain seviyelerini belirlemek amacıyla, ligasyon sonuçları bir tox R reporter analizi temelinde transmembran domainlerin ligasyon eğilimini ortaya koyar. Bu tekniğin SDS page veya floresans gibi mevcut biyofiziksel yöntemlere göre temel avantajı, transmembran domainin davranışının, deterjan miselleri gibi bir membran mimetik sistem yerine e coli içinde ekspresyon yoluyla doğal bir fosfolipid çift katman

transmembrane-domain-oligomerization-propensity-determined-toxr

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu raporda, yüzey plazmon rezonans ev sahibi sitoplazmada içine toksin girişini tespit etmek için nasıl kullanıldığını açıklar. Bu son derece duyarlı bir yöntem sitozolik toksin miktarı nicel veri sağlayabilir ve toksinlerin bir dizi yapılabilir.

Yüzey Plasmon Rezonans Host Cytosol Toksin Translokasyon Tespiti

Hücre içi depolardanCa2+ salınımına aracılık eden homo-tetramerik bir iyon kanalı olan ryanodin reseptörünün oligomerizasyonu, iskelet ve kalp kası kasılması için kritik öneme sahiptir. Burada, proteinlerin kendi kendine birleşmesini tespit etmek ve homo-oligomer stokiyometrisini belirlemek için tamamlayıcı in vivo ve in vitro yöntemler sunuyoruz.

Genetik ve biyokimyasal Yaklaşımlar<em&gt; İn Vivo</em&gt; ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Protein oligomerization Değerlendirilmesi: Riyanodin Reseptör Vaka Çalışması

Birçok protein, zar yüzeylerine bağlandığında işlevlerini yerine getirir. Ekstrinsik proteinlerin nanodisk membranları üzerindeki bağlanması, transmisyon elektron mikroskobu ile dolaylı olarak görüntülenebilir. Negatif leke sodyum fosfotungstat tarafından indüklenen nanodisklerin karakteristik istiflenmesinin (rouleau), ekstrinsik proteinin bağlanmasıyla önlendiğini gösteriyoruz.

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Bu protokol, yapısal düzeyde bir M42 aminopeptidaz olan TmPep1050'nin dimer-dodecamer geçişini incelemek için geliştirilmiştir. Protein arınması ile X-ışını veri işlemeye kadar basit bir boru hattıdır. Crystallogenezis, veri seti indeksasyonu ve moleküler replasman çalışma bir olgu ile vurgulanmıştır, TmPep1050H60A H307A varyantı.

X-Ray Kristalografi Thermotoga maritima M42 Aminopeptidaz TmPep1050 Oligomerik Devlet Geçiş Çalışma

Burada, tanımlanmış proteolipozomlarda tamamen saflaştırılmış bileşenlerle Msp1 ekstraksiyon aktivitesinin yeniden uzlaştırılması için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Msp1 Ayıklama Etkinliğinin Tamamen Saflaştırılmış Bileşenlerle Yeniden Uzlaştırılması

Burada, ABD Çevre Koruma Ajansı Türler Arası Duyarlılığı Tahmin Etmek için Dizi Hizalama (SeqAPASS) aracının en son sürümünü kullanmak için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, protein korumasını hızlı bir şekilde analiz etmek ve türler arasında kimyasal duyarlılığın özelleştirilebilir ve kolayca yorumlanabilir tahminlerini sağlamak için çevrimiçi aracın uygulanmasını göstermektedir.

Protein Korunumunun Hızlı Değerlendirilmesi için Türler Arasında Tahmin Etmek İçin Dizi Hizalamasının Gösterilmesi Duyarlılık Aracı

Burada sunulan, gözenek oluşturan toksinlerin neden olduğu bağlanma, sitotoksisite ve sinyalleşmeyi belirlemek için Leishmania majör promastigotlarını kullanan bir protokoldür. Streptolizin O ile bir kavram kanıtı sağlanır. Diğer toksinler, toksin direncinin yeni mekanizmalarını tanımlamak için L. major'da bulunan genetik mutantlardan yararlanmak için de kullanılabilir.

Leishmania major kullanarak Gözenek Oluşturan Toksinlerin Moleküler Mekanizmasını ve İşlevini Deşifre Etmek

Bu protokol, bireysel iyon kanallarını izlemek ve desteklenen lipit membranlarındaki aktivitelerini belirlemek için TIRF mikroskopisinin nasıl kullanılacağını açıklar, böylece yanal membran hareketi ile kanal fonksiyonu arasındaki etkileşimi tanımlar. Membranların nasıl hazırlanacağını, verilerin nasıl kaydedileceğini ve sonuçların nasıl analiz edileceğini açıklar.

Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu Kullanılarak Lipid Çift Katmanlarında Yanal Mobilite ve İyon Kanalı Aktivitesinin Tek Moleküllü Görüntülenmesi

Burada, ubikitin ligazları Von Hippel-Lindau E3 ligaz (VHL) ve Cereblon (CRBN) içeren kimeraları (PROTACS) hedefleyen proteoliz tarafından indüklenen üçlü kompleks oluşumunun biyofiziksel karakterizasyonu için protokolleri açıklıyoruz.  Burada gösterilen biyofiziksel yöntemler arasında yüzey plazmon rezonansı (SPR), biyokatman interferometrisi (BLI) ve izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) bulunur.

Kimeraları Hedefleyen Proteoliz Tarafından İndüklenen Üçlü Kompleks Oluşumunun Değerlendirilmesi için Biyofiziksel Testlerin Geliştirilmesi ve Uygulanması (PROTACS)

Dinamin süper aile proteinlerinin işlevleri, GTP hidrolizi ile birleşen konformasyonel değişikliklere bağlıdır. Farklı nükleotid yükleme durumlarında dinnamin benzeri GTPaz atlastininin konformasyonel dinamiklerini izlemek için tek moleküllü FRET (smFRET) tekniği kullanılarak bir sistem tanımlanmıştır.

Dinamin Benzeri GTPaz Atlastininin Konformasyonel Dinamiklerini Gözlemlemek için Tek Moleküllü FRET Görüntüleme

Öğrenin, tek geçişli transmembran domainlerin oligomerizasyon eğilimini E. coli'de ToxR raportör sistemiyle nasıl değerlendireceğinizi. Beta-galaktosidaz aktivitesi ölçülerek doğal fosfolipid çift tabakada protein etkileşimleri incelenir.

ToxR Assay tarafından belirlenen Transmembran Domain Oligomerization Eğilimi

Daha fazla video keşfet